張浩 何長(zhǎng)晟 李艷艷 王永 朱江江 俄木曲者 林亞秋

（1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；3.四川省畜牧科學(xué)研究院 動(dòng)物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066）

脂肪組織是體內(nèi)重要的能量存儲(chǔ)場(chǎng)所，但過(guò)多的脂肪會(huì)破壞人體的能量平衡，增加患II型糖尿病、高血脂、脂肪肝以及其他代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)。畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)可增加胴體的瘦肉率并改善肉的嫩度和風(fēng)味。山羊作為家養(yǎng)動(dòng)物是肉類(lèi)的主要來(lái)源之一，與牛肉、豬肉相比，羊肉具有獨(dú)特的風(fēng)味，受到消費(fèi)者的廣泛推崇。羊肉的脂肪含量不僅影響羊肉的肉質(zhì)，還直接關(guān)系到經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此闡明脂肪沉積的分子機(jī)制是進(jìn)行分子育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。研究表明，動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化不僅受功能基因的調(diào)控，還受非編碼基因如miRNAs的調(diào)控［1-3］。microRNAs（miRNAs）于1993年首次在秀麗新小桿線(xiàn)蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)［4］，是物種間保守的內(nèi)源性表達(dá)的非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度一般在22 nt左右。miRNA通常與靶標(biāo)基因的3′ UTR互補(bǔ)區(qū)結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)，在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［5-6］。

基于miRNA在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要作用，在動(dòng)物脂肪沉積中的功能也被廣泛關(guān)注。研究人員通過(guò)微陣列芯片在肉牛的肌內(nèi)脂肪和皮下脂肪中發(fā)現(xiàn)了88個(gè)差異表達(dá)的 miRNA［7］。miR-130a靶向 PPARγ抑制脂質(zhì)沉積［8］，miR-130b通過(guò)抑制CYP2U1的表達(dá)抑制脂滴形成，miR-1271通過(guò)抑制ATF3的表達(dá)，提高PPARγ和C/EBPα的表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)脂質(zhì)沉積［9］。另有研究對(duì)牛脂肪細(xì)胞分化前后的miRNA的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)260個(gè)差異表達(dá)的miRNA，并且其靶基因與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)［10］。在產(chǎn)蛋后期母雞和幼年母雞的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中也通過(guò)RNA-seq鑒定了104個(gè)差異表達(dá)miRNA［11］。對(duì)雞腹脂衍生脂肪細(xì)胞測(cè)序也發(fā)現(xiàn)了33種差異表達(dá)的miRNA［12］，在組織水平上通過(guò)對(duì)6、14、22、30 周齡的雞腹脂測(cè)序，篩選到507種已知miRNA和53種新的miRNA，并發(fā)現(xiàn)miR-215-5p通過(guò)NCOA3抑制雞腹脂形成［13］。在家兔的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-130b可以抑制兔前體脂肪細(xì)胞的分化［14］。miR-301b是本實(shí)驗(yàn)室前期利用高通量測(cè)序篩選得到的調(diào)控山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化前后的差異miRNA，目前對(duì)其研究多集中于炎癥反應(yīng)［15］、癌癥［16］、糖尿病心臟?。?7］、細(xì)胞增殖［18］以及間充質(zhì)干細(xì)胞的異常成脂分化［19］，尚未見(jiàn)其在山羊脂肪細(xì)胞分化方面的報(bào)道。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞油酸誘導(dǎo)分化前后測(cè)序結(jié)果，在分化0 d和2 d中差異表達(dá)的miRNA，篩選出表達(dá)水平差異上調(diào)的miR-301b作為研究對(duì)象。為了闡明miR-301b對(duì)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)以山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)過(guò)表達(dá)和干擾miR-301b明確其對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響，通過(guò)qPCR技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析來(lái)探究其發(fā)揮作用的可能調(diào)控機(jī)制，為山羊脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)以7 日齡簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象，購(gòu)買(mǎi)自四川省簡(jiǎn)陽(yáng)大哥大牧業(yè)有限公司。取羔羊背最長(zhǎng)肌分離原代前體脂肪細(xì)胞后液氮凍存。

Trizol 和 TB Green? Premix Ex TaqTMII購(gòu)自 Ta-KaRa 公司，RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit、TurboFect Transfection Reagent和 Bodipy 購(gòu)自 Thermo公司，油酸購(gòu)自 Sigma 公司，DMEM/F12、胰酶、Opti-MEM、胎牛血清（FBS）和雙抗購(gòu)自Gibco，油紅O 購(gòu)自Solarbio 公司，甘油三酯（TG）測(cè)定試劑盒購(gòu)自普利萊，引物由生工生物有限公司（成都）合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取實(shí)驗(yàn)室前期凍存的山羊原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，37℃水浴迅速融化后轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入7 mL含10% FBS的DMEM-F12完全培養(yǎng)基，1 000 r/min離心3 min棄去上清液，加入3 mL完全培養(yǎng)基重懸，并轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中，補(bǔ)齊10 mL完全培養(yǎng)基，24 h貼壁后換液，后續(xù)每48 h換液。細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度約80%-90%傳代，傳代使用胰酶消化細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)miR-301b序列，由GenePharma公司合成miR-301b的mimics和inhibitor（表1），并按照TurboFect Transfection Reagent試劑說(shuō)明書(shū)將mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染至約80%密度的F3代山羊原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染12 h后更換為50 μmol/L 油酸誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)分化48 h 后收集細(xì)胞樣品。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 miRNA mimic和 inhibitor序列Table 1 Sequences of miRNA mimic and inhibitor

1.2.3 甘油三酯測(cè)定 利用甘油三酯（TG）試劑盒測(cè)定甘油三酯合成情況，實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 Bodipy和油紅O染色 接種于24孔板的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后經(jīng)誘導(dǎo)分化48 h后棄培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，并利用4%多聚甲醛固定30 min，棄去甲醛，PBS清洗3遍，油紅O染色30 min，PBS清洗3遍，每孔保留約200 μL PBS，顯微鏡下觀察脂滴分布并拍照。Bodipy避光染色后熒光顯微鏡下觀察脂滴分布并拍照，染色步驟同油紅O染色。

1.2.5 qPCR及數(shù)據(jù)分析 12孔板按照TRIzol的說(shuō)明裂解細(xì)胞樣品提取RNA，利用RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄cDNA，5倍稀釋后-20℃儲(chǔ)存，分別以U6和UXT為內(nèi)參基因，qPCR檢測(cè)miR-301b和基因相對(duì)表達(dá)量，qPCR總 體 系 20 μL，TB Green?Premix Ex TaqTMII 10 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，引物信息如表2，用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

表2 特異性引物序列信息Table 2 Sequences information of specific primers

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)miR-301b對(duì)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的影響

利用qPCR 技術(shù)檢測(cè)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-301b-mimics 的效率，結(jié)果（圖1-A）顯示，相比對(duì)照組，miR-301b-mimics組中miR-301b的相對(duì)表達(dá)水平升高29 290倍（P＜0.01）。

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及甘油三酯含量測(cè)定 通過(guò)油紅O和Bodipy染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-301b后山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴積累減少（圖1-B）。油紅O染色量化結(jié)果（圖1-C）顯示，miR-301b-mimics 組OD490值顯著低于NC組（P＜0.01），此外TG測(cè)定結(jié)果（圖1-D）顯示miR-301b-mimics 組的甘油三酯含量極顯著低于NC 組（P＜0.01）。

圖1 過(guò)表達(dá)miR-301b對(duì)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響Fig.1 Effect of overexpressing miR-301b on the morphology of goat intramuscular adipocytes

2.1.2 qPCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因mRNA表達(dá)水平 結(jié)果（圖2）顯示，過(guò)表達(dá)miR-301b后，與 NC 組比較 CEBPα、PPARγ、SREBP1、LPL極顯著降低（P＜0.01），與細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察得到的結(jié)果相一致，然而CEBPβ極顯著上調(diào)（P＜0.01），相對(duì)表達(dá)量上升了4倍，AP2的相對(duì)表達(dá)水平未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 miR-301b 山羊?qū)?nèi)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of miR-301b goat on the expressions of differentiation marker genes of intramuscular adipocytes

2.2 干擾miR-301b表達(dá)對(duì)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的影響

成功在山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中干擾miR-301b的表達(dá)，并且干擾效率達(dá)到60%，極顯著低于對(duì)照組（圖3-A）（P＜0.01）。

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及甘油三酯含量測(cè)定 油紅O 和Bodipy染色結(jié)果（圖3-B）均表明，干擾miR-301b表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)積聚。油紅O染色結(jié)果量化數(shù)據(jù)顯示，與NC 組對(duì)比，in-miR-301b組（干擾miR-301b組）的OD490值顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖3-C），甘油三酯含量也增長(zhǎng)了1.31倍（圖3-D）（P＜0.01）。

圖3 干擾miR-301b 對(duì)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響Fig.3 Effect of interfering miR-301b on the morphology of goat intramuscular adipocytes

2.2.2 qPCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因mRNA表達(dá)水平 為進(jìn)一步解釋山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中干擾miR-301b表達(dá)對(duì)分化影響的機(jī)制，檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果（圖4）顯示，干擾 miR-301b 表達(dá)后 AP2、CEBPα、CEBPβ、SREBP1和LPL的表達(dá)水平極顯著上調(diào)（P＜0.01），PPARγ顯著上調(diào)（P＜0.05）。

圖4 干擾miR-301b 山羊?qū)?nèi)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of interferring mir-301b goat on the expression of differentiation marker genes of intramuscular adipocytes

2.3 miR-301b靶基因預(yù)測(cè)及初步研究

利用Targetscan和miRDB并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果對(duì)miR-301b下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用Venny 2.1繪制韋恩圖（圖5-A），3種方法取交集得到392個(gè)潛在靶基因，其中包括CLIP1、GJA1、ACVR1、RPS6KA5、MDM4、PPARγ、KLF3和C/EBPα等。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)KLF家族對(duì)山羊脂肪細(xì)胞分化有重要的調(diào)控作用，KLF3可促進(jìn)山羊脂肪細(xì)胞分化［20］，通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)KLF3 3′UTR的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，得到2個(gè)miR-301b的潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖5-B）。因此，本實(shí)驗(yàn)選定KLF3作為miR-301b的潛在靶基因，分別在過(guò)表達(dá)miR-301b和干擾miR-301b表達(dá)的樣品中檢測(cè)KLF3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-301b后顯著抑制KLF3的mRNA表達(dá)水平（圖5-C），而干擾miR-301b后，KLF3的mRNA水平得到了顯著提升（圖5-D）。

圖5 miR-301b靶基因預(yù)測(cè)及表達(dá)水平檢測(cè)Fig.5 Prediction and expression level detection of miR-301b target gene

3 討論

脂肪細(xì)胞的分化是脂肪組織脂質(zhì)積累的重要過(guò)程，在機(jī)體的能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要功能，同時(shí)在畜牧方面，脂肪含量對(duì)于胴體性狀和肉質(zhì)及其經(jīng)濟(jì)價(jià)值有著極大的影響。脂肪細(xì)胞分化過(guò)程是極復(fù)雜的生理進(jìn)程，受多種轉(zhuǎn)錄因子和非編碼RNA的嚴(yán)格調(diào)控［21-23］，動(dòng)物體內(nèi)的miRNAs可以通過(guò)與不完全互補(bǔ)的靶mRNA結(jié)合來(lái)切割或抑制翻譯，從而發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［24］。pre-miRNA通過(guò)裂解、轉(zhuǎn)運(yùn)和切割等方式修飾以產(chǎn)生成熟的miRNA［25］，后者通過(guò)補(bǔ)充靶基因的3′UTR堿基來(lái)引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）切割靶mRNA結(jié)構(gòu)域，從而降低靶mRNA的表達(dá)或抑制其翻譯［26］。

本研究通過(guò)利用化學(xué)合成的mimics和inhibitor在體外培養(yǎng)的山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和干擾miR-301b，探究miR-301b的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-301b后，山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的脂滴顯著減少，成脂相關(guān)基因CEBPα、PPARγ、SREBP1、LPL的表達(dá)水平極顯著降低，CEBPβ極顯著升高。干擾miR-301b的表達(dá)后，山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的脂滴顯著增加成脂相關(guān)基因AP2、CEBPα、CEBPβ、SREBP1和LPL的表達(dá)水平極顯著上升，PPARγ表達(dá)水平顯著上升。PPARγ和CEBPα作為經(jīng)典的成脂分化標(biāo)志基因，在成脂分化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［27-29］。CEBPβ可以激活 CEBPα和 PPARγ并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，快速激活成脂相關(guān)基因的表達(dá)［30］。結(jié)合本研究中，過(guò)表達(dá)和干擾miR-301b后，PPARγ與CEBPα的表達(dá)水平都發(fā)生了顯著變化，因此推測(cè)miR301b可能是通過(guò)調(diào)控PPARγ與CEBPα的表達(dá)，從而抑制肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化。而CEBPβ在過(guò)表達(dá)和干擾miR-301b的實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)了一致的上升趨勢(shì)，可能是由于CEBPβ在成脂分化過(guò)程中對(duì)PPARγ和CEBPα的調(diào)控作用，過(guò)表達(dá)miR-301b時(shí)，PPARγ和CEBPα的表達(dá)極顯著下調(diào)，使得二者的調(diào)控因子CEBPβ期望對(duì)下調(diào)的趨勢(shì)予以挽救，表達(dá)量極顯著上升，因此在過(guò)表達(dá)miR-301b的標(biāo)志基因中，CEBPβ呈現(xiàn)了與PPARγ和CEBPα相反的表達(dá)趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)與miR-301b同家族的miR-301b-3p可以通過(guò)靶向CPEB3/EGFR軸，加速高級(jí)別卵巢漿液性腫瘤的遷移和侵襲［31］。在家兔前體脂肪細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)和干擾miR-130b抑制/促進(jìn)分化和細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積累，分別顯著下調(diào)和上調(diào)PPARγ和CEBPα的表達(dá)［14］，發(fā)現(xiàn)miR-130b通過(guò)抑制其靶基因PPARγ來(lái)減少豬脂肪沉積［32］，而miR-301b與miR-130b屬同一家族，具有相同的種子序列，其表達(dá)模式和生物學(xué)功能可能存在類(lèi)似的地方。

miRNA作為生物發(fā)生過(guò)程中基因調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要通過(guò)與靶基因的相互作用來(lái)調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化，例如，miR-27b靶向LPL并抑制人脂肪干細(xì)胞（human adipose tissue-derived stem cell，hASC）分化［19］。miR-130a靶向 PPARγ抑制牛脂肪細(xì)胞的脂滴積聚［8］，在肉牛脂肪細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-378表達(dá)，通過(guò)下調(diào)靶基因的表達(dá)水平，致使PPARγ和SREBP1的表達(dá)水平上升，從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的成脂分化。在固始雞的皮下脂肪細(xì)胞中，miR-215-5p靶向NCOA3抑制脂肪細(xì)胞的增殖和分化［13］，miR-206靶向KLF4抑制豬脂肪細(xì)胞的分化［33］，miR-106b-5p靶向KLF4負(fù)向調(diào)控山羊脂肪細(xì)胞分化［34］。以上研究表明miRNA在不同物種中主要通過(guò)靶向基因發(fā)揮調(diào)控作用，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Targetscan、miRDB預(yù)測(cè)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果對(duì)miR-301b下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-301b靶標(biāo)基因包括KLF3。此前已有報(bào)道m(xù)iR-324-5p靶向KLF3促進(jìn)豬的脂肪細(xì)胞分化和脂肪沉積［35］。本實(shí)驗(yàn)室致力于探究KLF家族基因在山羊脂質(zhì)沉積中的作用，且前期研究發(fā)現(xiàn)KLF3是山羊皮下脂肪細(xì)胞分化的正向調(diào)控因子［20］，因此我們選擇KLF3作為研究對(duì)象。過(guò)表達(dá)miR-301b可以極顯著降低KLF3的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)干擾miR-301b可以極顯著提高KLF3的表達(dá)水平，推測(cè)miR-301b與KLF3之間的表達(dá)存在著調(diào)控關(guān)系。本研究從實(shí)驗(yàn)水平推測(cè)KLF3可能為miR-301b的靶標(biāo)基因，但二者之間具體的結(jié)合關(guān)系是本實(shí)驗(yàn)下一步研究的重點(diǎn)，擬利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)明確其靶標(biāo)關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)RNA-Seq篩選得到的山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化差異miR-301b為研究切入點(diǎn)。miR-301b是一個(gè)山羊肌內(nèi)脂肪沉積的負(fù)調(diào)節(jié)因子。推測(cè)miR-301b可能通過(guò)靶向KLF3抑制山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化。