張業(yè)猛 朱麗麗 陳志國(guó)

（1.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；2.中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001；3.青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001）

土壤鹽堿化是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要非生物脅迫因素之一，土壤中高濃度的Na+、Cl-不僅造成生理干旱，過(guò)量積累也會(huì)引起離子毒害，破環(huán)植物的正常生理代謝［1-2］。長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中植物各自形成了獨(dú)特的代謝和調(diào)控機(jī)制來(lái)響應(yīng)鹽脅迫［3］。其中NHX 家族蛋白為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，含有Na+/H+exchange（PF00999）蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于CPA1基因家族（cation：proton antiporter-1 family），廣泛存在于細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物中，主要參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的離子重建和pH 平衡［4-5］。對(duì)NHX基因家族基于全基因組水平進(jìn)行鑒定、分類和分析，不僅可以為NHXs基因應(yīng)答鹽脅迫機(jī)制提供重要信息，而且為作物改良提供候選基因。

自1976年，Ratner 等［6］在大麥中發(fā)現(xiàn)NHX基因之后，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［7］、水稻（Oryza sativa）［8］、普通小麥（Triticum aestivumssp.aestivum）［9］和玉米（Zea mays）［10］等植物中都相繼發(fā)現(xiàn)了NHX基因。隨著對(duì)NHX基因的深入研究，發(fā)現(xiàn)其不僅調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，也受到各種非生物脅迫和激素的誘導(dǎo)［11-13］。如鹽脅迫條件下，白菜（Brassica campestrisssp.chinensis）中BrNHX1-1和BrNHX1-2的轉(zhuǎn)錄水平在BrNHXs成員中上調(diào)最高［14］。聚乙二醇處理?xiàng)l件下，大豆（Glycine max）中GmNHX1的轉(zhuǎn)錄水平也顯著增加［15］。脫落酸處理?xiàng)l件下，葡萄（Vitis vinifera）中VvNHX1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而VvNHX5轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)［16］。此外，過(guò)表達(dá)NHX基因可以顯著提升植物的耐鹽性，董麗君等［17］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)AlNHX1基因大豆系對(duì)鹽脅迫的耐受性顯著提升，Yarra 等［18］在茄子（Solanum melongenaL.）中過(guò)表達(dá)TaNHX2基因可以顯著提升其鹽堿條件下植物的耐鹽性表現(xiàn)，異源表達(dá)HtNHX1或HtNHX2可以增強(qiáng)水稻對(duì)鋁和土壤酸度的耐受性［19］。因此，NHX基因在植物中普遍存在，且在非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）原產(chǎn)于南美洲安第斯地區(qū)，為莧科藜屬一年生葉草本植物，是喜冷涼的高海拔鹽生植物，具有較強(qiáng)耐旱、耐鹽堿和耐瘠薄等特征［20-22］。NHX基因雖然在多種植物中已有研究，但在藜麥中NHX基因家族的報(bào)道甚少。隨著藜麥基因組數(shù)據(jù)的公布［23］和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，有助于藜麥NHX基因家族在全基因組水平上進(jìn)行鑒定與分析。對(duì)其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育等信息進(jìn)行全面分析，研究藜麥NHX基因家族在鹽脅迫處理下的表達(dá)特性，為后續(xù)NHX基因功能研究和進(jìn)一步利用該類基因進(jìn)行藜麥的耐鹽性遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以青藜4 號(hào)為參試材料，品種認(rèn)定編號(hào)：青認(rèn)備2019001。

1.2 方法

1.2.1 藜麥NHX基因家族成員鑒定 藜麥、擬南芥、小麥、玉米基因組數(shù)據(jù)在Ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ensembl.org/index.html）下載，Na+/H+exchange 結(jié)構(gòu)域的HMM 模型（PF00999）來(lái)自Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）。利用HMMER 3.0 進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果利用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）和Pfam 網(wǎng)站（http://pfam.xfam.org/）進(jìn)行驗(yàn)證，去除不含Na+/H+exchange 結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。

1.2.2 藜麥NHX 蛋白的理化性質(zhì)分析 利用ExPASy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件對(duì)藜麥NHXs 蛋白序列長(zhǎng)度、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、親水性、不穩(wěn)定系數(shù)進(jìn)行分析，采用Cell-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plantmulti/）在線軟件對(duì)NHXs 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.3 藜麥NHX基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析 使用GSDS 2.0（http://gsds.gao-lab.org/index.php）在線軟件對(duì)NHXs基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析，采用MEME 4.12 進(jìn)行NHXs 蛋白motif 分析，通過(guò)TBtools 進(jìn)行可視化。

1.2.4 藜麥NHX基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 利用MRGA 7.0 中Neighbor-joining 法，設(shè)置Bootstrap值為1 000，對(duì)HMMER 搜索到的藜麥、擬南芥、小麥和玉米的NHXs基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建，采用iTOL（https://itol.embl.de/）在線軟件進(jìn)行調(diào)整。

1.2.5 鹽脅迫處理 挑選籽粒飽滿、大小一致的種子，用75%的乙醇溶液消毒5 min 后，無(wú)菌水沖洗至干凈無(wú)味，用濾紙吸取種子表面水分，平整鋪放在放有2 層濾紙的種子萌發(fā)盒中，置于12 h（25℃）光照/12 h（20℃）黑暗條件的人工氣候培養(yǎng)箱中萌發(fā)。萌發(fā)1 d 后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、一致的幼苗進(jìn)行300 mmol/L NaCl 脅迫處理，分別于0、24、48和72 h 整株取樣，液氮迅速冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 藜麥鹽脅迫條件下表達(dá)模式分析 總RNA提取和cDNA 模板第一鏈的制備分別采用生工生物有限公司（上海）的植物總RNA 快速提取試劑盒和AMV 第一鏈cDNA 合成試劑盒。產(chǎn)物在-80℃保存，委托生工生物有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。選取4 個(gè)具有不同表達(dá)模式的NHX基因（AUR62041754、AUR62027477、AUR62043892和AUR62017691） 進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。引物在生工生物有限公司合成（表1），反應(yīng)體系為20 μL（cDNA 1 μL、上下游引物各0.8 μL、MIX 10.4 μL、ddH2O 7 μL）。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 34 s、95℃15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s，共35 個(gè)循環(huán)，3 次生物學(xué)重復(fù)。

表1 藜麥NHXs 基因?qū)崟r(shí)熒光定量引物Table 1 RT-qPCR primers of NHXs in quinoa

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，Graphpad 9.2 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 藜麥NHXs蛋白理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

在藜麥基因組中共鑒定出46 個(gè)NHXs 蛋白（表2），其蛋白序列差異較大，長(zhǎng)度為109-1 820 aa，分子質(zhì)量為11 472.74-204 381.58 Da。等電點(diǎn)為5.00-9.27，其中有19 個(gè)為堿性蛋白。親水性為-0.226-1.112，除AUR62009395編碼的蛋白以外，其他全為親水蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)在21.71-50.73 之間，有11個(gè)不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白，其余全為穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，僅有AUR62033334、AUR62004319和AUR62033325編碼的蛋白定位在細(xì)胞核，其余都定位在細(xì)胞膜或液泡。

表2 藜麥NHXs 蛋白的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位Table 2 Physicochemical properties and subcellular localizations of quinoa NHXs proteins

2.2 藜麥NHX基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)NHX基因家族的序列信息繪制每個(gè)基因的結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖1）顯示，46 個(gè)NHXs基因外顯子數(shù)量為2-24 個(gè)，內(nèi)含子為1-23 個(gè)，結(jié)構(gòu)差異較大。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹得出藜麥NHXs基因分為5個(gè)亞組（Subgroup I-V），且在進(jìn)化樹中位置相近的NHXs具有相似的基因結(jié)構(gòu)。

圖1 藜麥NHXs 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹和基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Phylogenetic tree and gene structure of NHXs genes in quinoa

2.3 藜麥HNX基因家族motif分析

根據(jù)46 個(gè)NHXs 蛋白的全長(zhǎng)序列預(yù)測(cè)到10個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖2），每個(gè)motif 的E 值都顯著。motif 的長(zhǎng)度在21-50 個(gè)保守氨基酸，其中motif 1 最長(zhǎng)，含有50 個(gè)保守氨基酸，具有33 個(gè)位點(diǎn)；motif 8-10 最短，含有21 個(gè)保守氨基酸，位點(diǎn)分別為28、30 和39。此外，在進(jìn)化樹中位置相近的NHXs蛋白具有相似motif 結(jié)構(gòu)（圖3），其中Subgroup I、II、III 和IV 中除AUR62008394 和AUR62021702 以外，41 個(gè)NHXs 蛋白N 端都含有motif 7，高度保守。Subgroup V 中的5 條NHXs 蛋白都包含motif 10，N端為motif 7 或motif 10。

圖3 藜麥NHXs 基因motif 分析Fig.3 Motif analysis of NHXs gene in quinoa

2.4 藜麥NHXs蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為分析藜麥NHXs 蛋白的進(jìn)化，將擬南芥（60個(gè)）、小麥（119 個(gè)）、玉米（66 個(gè)）和藜麥（46 個(gè)）共291 個(gè)含有Na+/H+exchange 保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，291 個(gè)蛋白可分為4 類，分別命名為Group I、Group II、Group III 和Group IV。其中Group I 中含有63 個(gè)蛋白序列，擬南芥、小麥、玉米和藜麥分別含有10、27、18 和8個(gè)；Group II 含有86 個(gè)蛋白質(zhì)序列，擬南芥、小麥、玉米和藜麥分別含有15、42、25 和4 個(gè)；Group III含有29 個(gè)蛋白質(zhì)序列，擬南芥、小麥、玉米和藜麥分別含有3、11、10 和5 個(gè)；Group IV 含有113 個(gè)蛋白質(zhì)序列，擬南芥、小麥、玉米和藜麥分別含有32、39、13 和29 個(gè)。

圖4 擬南芥、小麥、玉米和藜麥的NHXs 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of NHXs proteins in Arabidopsis，wheat，maize and quinoa

2.5 藜麥NHXs基因鹽脅迫下表達(dá)模式及GO注釋

NaCl 脅迫下轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果（圖5-A）顯示，隨脅迫時(shí)間增加，16 個(gè)NHXs 基因的表達(dá)模式為先上升后下降，10 個(gè)一直上升，9 個(gè)一直下降，11 個(gè)無(wú)明顯變化。通過(guò)GO 注釋到37 個(gè)具有基因注釋的NHXs 基因，其中分子功能4 個(gè)，生物學(xué)過(guò)程33 個(gè)。4 個(gè)分子功能基因編碼的蛋白為離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性基因，33 個(gè)生物學(xué)過(guò)程基因包含1 個(gè)金屬離子穩(wěn)態(tài)、1 個(gè)鈉離子質(zhì)膜導(dǎo)入、1 個(gè)正向調(diào)控代謝過(guò)程、21 個(gè)穩(wěn)態(tài)過(guò)程、4 個(gè)蛋白質(zhì)定位、4 個(gè)調(diào)節(jié)代謝過(guò)程和1 個(gè)鉀離子穩(wěn)態(tài)基因（圖5-B）。選擇表達(dá)模式不同的4 個(gè)NHX基因進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組準(zhǔn)確性發(fā)現(xiàn)，AUR62017691隨脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量上升，AUR62043892隨脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量先上升后下降，而AUR62041754和AUR62027477隨脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量均降低，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致（圖5-C）。

圖5 藜麥NHXs 基因表達(dá)模式與GO 注釋Fig.5 Gene expression patterns and GO annotations of NHXs in quinoa

3 討論

3.1 藜麥NHXs基因的結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)進(jìn)化

NHXs 蛋白主要依靠液泡膜質(zhì)子泵建立的質(zhì)子濃度差提供能量進(jìn)行Na+和H+跨膜反向運(yùn)輸，將Na+區(qū)隔化，可以降低胞質(zhì)中的滲透勢(shì)，也避免了過(guò)高的離子濃度對(duì)胞質(zhì)中細(xì)胞器的損傷［25］。液泡膜NHXs 蛋白與質(zhì)膜上的NHXs 蛋白協(xié)同調(diào)控整個(gè)植株的鹽分分配，構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)鹽分區(qū)隔化的基礎(chǔ)。前人對(duì)NHX基因家族已有大量研究，且多個(gè)物種的NHXs基因家族已經(jīng)被鑒定出來(lái)，例如在葡萄中發(fā)現(xiàn)了8 個(gè)NHX基因家族成員［26］，在香蕉（Musa acuminata）中鑒定出了11 個(gè)NHX基因家族成員［27］。藜麥在我國(guó)是一種新型的小宗作物，具有較強(qiáng)的耐鹽性［20］，Na+在鹽囊泡中大量積累和液泡區(qū)隔化以維持細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，是藜麥適應(yīng)鹽脅迫的重要策略。因此本研究基于藜麥基因組數(shù)據(jù)，共鑒定了46個(gè)NHXs基因，編碼46 個(gè)NHXs 蛋白，在進(jìn)化樹中位置相近的NHXs基因具有相近的結(jié)構(gòu)，NHXs 蛋白具有相似motif 結(jié)構(gòu)，并且在擬南芥、小麥和玉米中分別鑒定出含有Na+/H+exchange 結(jié)構(gòu)域的NHXs 蛋白60、119 和66 個(gè)，對(duì)擬南芥、小麥、玉米和藜麥中鑒定的291 個(gè)NHXs 蛋白親緣關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，4 種植物在系統(tǒng)進(jìn)化樹中分布均勻，并未出現(xiàn)同一植物的NHXs 蛋白成員聚在同一分支中，說(shuō)明不同植物間NHXs 蛋白多為直系同源蛋白。推測(cè)Na+區(qū)隔化是藜麥應(yīng)對(duì)鹽脅迫的重要機(jī)制之一，且與擬南芥、小麥和玉米的調(diào)控機(jī)制相似。

3.2 藜麥NHXs基因參與鹽脅迫條件下的離子穩(wěn)態(tài)和鹽分分配

隨著高通量測(cè)序技術(shù)及現(xiàn)代分子克隆技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的NHX 蛋白在植物、動(dòng)物和真菌中被發(fā)現(xiàn)，并將NHXs 蛋白家族分為Class-I 和Class-II 兩個(gè)亞組，Class-I 主要定位在液泡膜，Class-II 主要定位在小囊泡內(nèi)，且二者具有20%-25%的同源性［28］。此外，Lu 等［29］也表示植物中的NHXs 蛋白主要分為兩類，一類主要定位在質(zhì)膜上，另一類主要定位在液泡膜上。藜麥中鑒定出的46 個(gè)NHX蛋白通過(guò)亞細(xì)胞定位顯示多數(shù)蛋白定位在細(xì)胞膜和液泡中，推測(cè)該基因家族在藜麥中集中在質(zhì)膜或內(nèi)膜系統(tǒng)表達(dá)，這與多種植物中NHXs 蛋白的定位一致［27，30］。并且越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)NHXs 基因可以顯著提升植株對(duì)鹽脅迫的耐受性［17-18］。例如，郝東風(fēng)等［31］將鹽角草（Salicornia）的NHX基因?qū)敫仕{(lán)型油菜（B.napus）中可以提升植株對(duì)NaCl 脅迫的耐受性。趙云霞等［32］將無(wú)苞芥（Arabidopsis pumila）中OpNHX1基因?qū)氲綌M南芥中可以顯著提升轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的存活率。而藜麥中鑒定出的46 個(gè)NHXs基因在NaCl 脅迫下，有26 個(gè)隨脅迫時(shí)間逐漸升高，9 個(gè)隨脅迫時(shí)間逐漸下降，但是響應(yīng)時(shí)間和表達(dá)量存在較大差異，表明35 個(gè)NaCl 脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的NHXs基因在藜麥鹽脅迫過(guò)程響應(yīng)機(jī)制存在差異，與Ruiz 等［33］報(bào)道的藜麥在鹽脅迫條件下，響應(yīng)基因的表達(dá)具有時(shí)間依賴性一致。此外，46 個(gè)NHXs基因通過(guò)GO 注釋到37 個(gè)，其中參與生物學(xué)過(guò)程的33 個(gè)，具有分子功能的4 個(gè)，2 級(jí)注釋多是參與離子、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和離子跨膜運(yùn)輸過(guò)程。因此，推測(cè)受到鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)且GO 注釋到功能的35 個(gè)NHXs基因，參與調(diào)控藜麥鹽脅迫條件下的離子穩(wěn)態(tài)和鹽分分配。

4 結(jié)論

共鑒定出46 個(gè)藜麥NHX基因家族成員，編碼46 個(gè)NHX 蛋白，同一亞組具有相似的基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)motif，多數(shù)定位在細(xì)胞膜和液泡中，與小麥、玉米、擬南芥為直系同源蛋白。其中35 個(gè)參與藜麥鹽脅迫調(diào)控過(guò)程，為NHXs基因家族響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。