許博楠 馮佳 周見庭 蔣建蘭

（天津大學(xué)化工學(xué)院 天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072）

近幾十年來，微生物已經(jīng)發(fā)展成為了生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物、酶制劑和生物能源等產(chǎn)品的有效底盤［1］。然而，由于活細(xì)胞的復(fù)雜性和細(xì)胞膜的屏障，目標(biāo)產(chǎn)物的有效生物合成和釋放受到了限制［2］，為了解決這一問題，無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（cell-free protein synthesis，CFPS）被廣泛應(yīng)用起來。CFPS 系統(tǒng)與體內(nèi)蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比沒有細(xì)胞生長(zhǎng)和維持的限制，易于觀察和操作，且設(shè)計(jì)構(gòu)建速度快、產(chǎn)物產(chǎn)量高、對(duì)有毒底物或產(chǎn)物具有高耐受性［3］。隨著合成生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，CFPS 系統(tǒng)在近幾年來取得了巨大的進(jìn)步［4-6］，已經(jīng)從單純的研究性工具發(fā)展成為替代傳統(tǒng)生物系統(tǒng)的有效平臺(tái)。

20世紀(jì)50年代以來，無細(xì)胞系統(tǒng)一直被用于探索基本的生物學(xué)機(jī)制［7-8］。1958年，Zamecnik 實(shí)驗(yàn)室首次證明了不依賴完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)而從細(xì)胞中提取翻譯相關(guān)物質(zhì)就可以調(diào)節(jié)體外蛋白質(zhì)的合成［9］。1961年，Nirenberg 和Matthaei［10］利用大腸桿菌細(xì)胞提取物系統(tǒng)成功破譯了20 種氨基酸的遺傳密碼子，取得了CFPS 領(lǐng)域的開創(chuàng)性進(jìn)展。1962年，Nathans 等［11］利用大腸桿菌細(xì)胞提取物體外合成了第一個(gè)完整的蛋白質(zhì)——噬菌體f2 的衣殼蛋白，之后許多病毒RNA 被用作信使RNA 來啟動(dòng)完整蛋白質(zhì)的體外合成。1967年，Lederman 和Zubay［12］開發(fā)了一種耦合轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)，可將DNA 作為模板用于蛋白質(zhì)的合成，這一發(fā)現(xiàn)是現(xiàn)代無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯應(yīng)用的先驅(qū)。1973年，Zubay［13］開發(fā)了一種以大腸桿菌S30 提取物為基礎(chǔ)的CFPS 系統(tǒng)，該系統(tǒng)由于較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量而得到了廣泛發(fā)展。1988年，Spirin 等［14］通過連續(xù)交換反應(yīng)物及反應(yīng)產(chǎn)物和副產(chǎn)品以延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄和翻譯，使CFPS 系統(tǒng)運(yùn)行長(zhǎng)達(dá)數(shù)十小時(shí)，大大提高了蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。2000年之后，一場(chǎng)關(guān)于CFPS 系統(tǒng)的技術(shù)復(fù)興逐漸展開，一些限制系統(tǒng)發(fā)展的瓶頸問題例如較低且不可控的蛋白質(zhì)產(chǎn)量、較高的試劑成本、反應(yīng)規(guī)模小、無法正確折疊復(fù)雜的蛋白質(zhì)等逐漸被攻克［15-18］，使CFPS 系統(tǒng)在合成生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用成為可能。

CFPS 系統(tǒng)是一個(gè)體外蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯平臺(tái)，其原理是以質(zhì)粒DNA 或線性PCR 產(chǎn)物為模板，在RNA 聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子等組分的作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，利用體系中的核糖體、調(diào)控因子、氨基酸底物、tRNA、能源物質(zhì)等進(jìn)行翻譯［19］。CFPS 系統(tǒng)可以分為兩類，一類是“PURE”系統(tǒng)，其由轉(zhuǎn)錄和翻譯的必要元素組成，所有添加物成分已知、濃度可控，可以減少蛋白酶與核酸酶的污染［20］。另一類是基于細(xì)胞提取物的CFPS 系統(tǒng)，通過裂解細(xì)胞在保留轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制的同時(shí)去除細(xì)胞碎片和染色體DNA，它相比“PURE”系統(tǒng)成本更低且更通用，尤其在大規(guī)模生產(chǎn)中顯示出更高的性價(jià)比［20］，所以本文主要討論基于細(xì)胞提取物的CFPS 系統(tǒng)。最近已有幾篇優(yōu)秀的綜述總結(jié)了CFPS 系統(tǒng)中反應(yīng)混合物的制備、優(yōu)化蛋白表達(dá)量方面的研究進(jìn)展［5，21］，本文主要總結(jié)了CFPS 系統(tǒng)中另外兩個(gè)關(guān)鍵因素——細(xì)胞提取物和模板DNA 方面的研究進(jìn)展。本文將介紹細(xì)胞提取物制備方法的發(fā)展歷程，重點(diǎn)討論了近幾年來新開發(fā)的原核細(xì)胞提取物系統(tǒng)的特點(diǎn)及應(yīng)用前景。同時(shí)，詳細(xì)總結(jié)了質(zhì)粒DNA 模板和線性DNA 模板的研究進(jìn)展，這些研究進(jìn)展為構(gòu)建更加高效可控的CFPS 系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。

1 細(xì)胞提取物的研究進(jìn)展

1.1 細(xì)胞提取物的制備

在無細(xì)胞蛋白合成過程中，細(xì)胞提取物的制備是建立高效、可重復(fù)的工作流程的關(guān)鍵步驟。隨著工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)和對(duì)生產(chǎn)率的高要求，細(xì)胞提取物的制備方法也隨之不斷發(fā)展［22］。最初的細(xì)胞提取物制備流程為：首先使用發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)胞至指數(shù)中期，再使用高壓均質(zhì)器裂解細(xì)胞，之后通過30 000×g 離心去除細(xì)胞碎片和基因組DNA，最后經(jīng)過徑流反應(yīng)和透析等步驟獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞提取物。制備好的細(xì)胞提取物再加入模板DNA、氨基酸、三磷酸腺苷（ATP）、能量分子、鹽和緩沖液的混合物以啟動(dòng)CFPS 反應(yīng)［13］。傳統(tǒng)的細(xì)胞提取物制備流程步驟復(fù)雜且試劑成本較高，之后不同的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)細(xì)胞提取物的制備工藝進(jìn)行了幾點(diǎn)改進(jìn)。Kigawa等［23］報(bào)道了搖瓶發(fā)酵簡(jiǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法與發(fā)酵罐獲得的產(chǎn)率相當(dāng)。Liu 等［24］簡(jiǎn)化了制備過程中的幾個(gè)步驟如提高均質(zhì)化速度使制備時(shí)間縮短了近50%，同時(shí)通過優(yōu)化徑流培養(yǎng)使總試劑成本降低了70%。Kim 等［25］用較低的離心率（12 000×g）替代高速離心并省去了透析步驟，發(fā)現(xiàn)提取物仍保留完整的轉(zhuǎn)錄翻譯活性，但總成本和處理時(shí)間分別減少了80%和60%。除此之外，為了進(jìn)一步降低提取物制備的成本，研究者們也探索了能夠替代高壓均質(zhì)器裂解細(xì)胞的方法，包括使用凍融循環(huán)［26-27］、超聲［28-29］、珠渦混合［28］、溶菌酶［30］來裂解細(xì)胞。細(xì)胞提取物制備工藝的簡(jiǎn)化與優(yōu)化大大節(jié)省了CFPS反應(yīng)的時(shí)間和成本，有助于推動(dòng)CFPS 的工業(yè)化發(fā)展及其在合成生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

除了對(duì)細(xì)胞提取物制備過程的簡(jiǎn)化和優(yōu)化，在源細(xì)胞中刪除或過表達(dá)某些基因，還可以獲得更加滿足需求的無細(xì)胞提取物。Michel-Reydellet 等［31］先刪除了大腸桿菌菌株中編碼影響氨基酸穩(wěn)定性的酶的基因，再獲取細(xì)胞提取物，最終使蛋白質(zhì)產(chǎn)量大大提高。Kim 等［25］在細(xì)胞提取物制備過程中使用商業(yè)BL21（DE3）菌株過表達(dá)T7 RNA 聚合酶，從而不需要再添加獨(dú)立純化的T7 RNA 聚合酶。Jewett團(tuán)隊(duì)利用缺乏釋放因子（release factor 1，RF1）且過表達(dá)T7 RNA 聚合酶的大腸桿菌提取物系統(tǒng)建立了一個(gè)高產(chǎn)量一鍋式CFPS 平臺(tái)，該平臺(tái)可合成包含40 種非天然氨基酸的產(chǎn)品［32］。該團(tuán)隊(duì)還將多個(gè)提取物組合在一起，每個(gè)提取物都含有一種過表達(dá)酶，構(gòu)建了一個(gè)完整的生物合成途徑［33-34］。這些進(jìn)展表明，提取物的制備流程可以根據(jù)最終目標(biāo)進(jìn)行修改。

1.2 新開發(fā)的細(xì)胞提取物系統(tǒng)

理論上從任何生物中都可以獲取細(xì)胞提取物，提取物的選擇要考慮原料的可獲得性和提取物制備的便利性，還需考慮目標(biāo)蛋白質(zhì)的生化特性及下游應(yīng)用。細(xì)胞提取物系統(tǒng)根據(jù)來源可分為真核系統(tǒng)和原核系統(tǒng)［35］（表1）。真核系統(tǒng)具有翻譯后修飾功能，可被用來生產(chǎn)具有藥用價(jià)值的復(fù)雜蛋白質(zhì)。目前已被開發(fā)的真核細(xì)胞提取物種類很多，包括小麥胚芽提取物（wheat germ extract）［58］、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物（rabbit reticulocyte lysate）［59］、昆蟲細(xì)胞提取物（insect cell extract）［60］、倉鼠卵巢細(xì)胞提取物（Chinese hamster ovary/CHO cells）［61］、酵母提取物（yeast extract）［62］、煙草細(xì)胞提取物（tobacco extract）［63］、人類細(xì)胞系提取物（human cell lines）［64］?；谛←溑哐康腃FPS 系統(tǒng)具有高效的翻譯機(jī)制，合成真核蛋白范圍廣、產(chǎn)量高，但在翻譯后修飾方面存在局限性［65］。基于酵母、昆蟲細(xì)胞、倉鼠卵巢細(xì)胞、煙草細(xì)胞和人類細(xì)胞系的CFPS 系統(tǒng)含有內(nèi)源性微粒體，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)的共翻譯易位和基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的翻譯后修飾，如糖基化和脂化修飾［66］。然而，真核細(xì)胞普遍培養(yǎng)成本較高，提取物制備過程復(fù)雜，且批量反應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)量低。與此相比，原核系統(tǒng)提取物制備更方便、蛋白質(zhì)產(chǎn)量更高、下游加工要求和成本更低。目前應(yīng)用最廣泛的原核細(xì)胞提取物是大腸桿菌提取物（Escherichia coliextract）［67］，它是CFPS 系統(tǒng)的首選宿主，已被廣泛用于商業(yè)化生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)。與真核系統(tǒng)相比，原核細(xì)胞提取物種類偏少，以往的研究主要集中于大腸桿菌系統(tǒng)。為了探索更多原核細(xì)胞在CFPS 系統(tǒng)中的應(yīng)用潛力，新的原核細(xì)胞提取物系統(tǒng)不斷被開發(fā)出來。本文詳細(xì)介紹4 種新開發(fā)的原核細(xì)胞提取物系統(tǒng)。

表1 不同細(xì)胞提取物系統(tǒng)的特點(diǎn)Table 1 Features of different cell extract systems

1.2.1 基于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的CFPS系統(tǒng) 枯草芽孢桿菌是一種桿狀的革蘭氏陽性土壤細(xì)菌，作為工業(yè)模式微生物在重組蛋白的生產(chǎn)和化學(xué)物質(zhì)的合成方面表現(xiàn)出很大潛力［68］?；诳莶菅挎邨U菌的CFPS 系統(tǒng)在很早就開始了研究，但由于需要外源添加mRNA、DNAse 處理、能源系統(tǒng)效率低等因素限制了其發(fā)展［69-71］。近幾年，研究者們努力克服這些限制開發(fā)了更加高效的枯草芽孢桿菌細(xì)胞提取物系統(tǒng)。Freemont 團(tuán)隊(duì)開發(fā)并改良了基于枯草芽孢桿菌WB800N 的CFPS 系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過使用蛋白酶缺陷的菌株能夠持續(xù)幾個(gè)小時(shí)進(jìn)行高效的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)，該系統(tǒng)還可以用于枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子庫的原型構(gòu)建［52］。Tian 等［53］通過優(yōu)化細(xì)胞裂解條件、添加蛋白酶抑制劑和調(diào)整緩沖液組成，構(gòu)建了基于枯草芽孢桿菌的無細(xì)胞N-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuAc）生物合成體系，該系統(tǒng)的合成效率比體內(nèi)高305 倍。由此可見，基于枯草芽孢桿菌的CFPS 系統(tǒng)在基因調(diào)控元件的原型構(gòu)建、代謝工程的研究方面具有一定的發(fā)展前景。

1.2.2 基于鏈霉菌（Streptomyces）的CFPS 系統(tǒng) 鏈霉菌是一類革蘭氏陽性細(xì)菌，其基因組GC 含量高（＞70%），含有許多復(fù)雜的天然產(chǎn)物生物合成基因簇［72-73］，開發(fā)基于鏈霉菌的CFPS 系統(tǒng)對(duì)于研究天然產(chǎn)物的生物合成具有諸多優(yōu)勢(shì)。最初，Li 等［74］開發(fā)了一種適用于多種變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）和天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）的CFPS 系統(tǒng)，該系統(tǒng)以密碼子優(yōu)化的綠色熒光增強(qiáng)蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP，62% GC）為報(bào)告基因，批次反應(yīng)的蛋白產(chǎn)量大于50 μg/mL。用濃縮細(xì)胞提取物進(jìn)行CFPS 反應(yīng)后，eGFP的產(chǎn)量提高到近120 μg/mL［54］。利用該系統(tǒng)還成功表達(dá)了4 種鏈霉菌來源的高GC 含量基因，與大腸桿菌CFPS 系統(tǒng)相比蛋白在鏈霉菌CFPS 系統(tǒng)中的溶解度更高。雖然該系統(tǒng)有助于提高表達(dá)蛋白的溶解度，但該平臺(tái)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量與大腸桿菌CFPS 系統(tǒng)仍有一定差距。Xu 等［75-76］為了進(jìn)一步提高鏈霉菌CFPS 系統(tǒng)的生產(chǎn)力，在反應(yīng)中添加了蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)因子，獲得了約400 μg/mL 的蛋白產(chǎn)量，這也是迄今為止報(bào)道的最高產(chǎn)率。與此同時(shí)，Moore等［55，77］開發(fā)了基于委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）的CFPS 系統(tǒng)，蛋白產(chǎn)量達(dá)266 μg/mL，該系統(tǒng)還揭示了通過鏈霉菌的土霉素合成途徑合成多種酶的能力。總之，基于鏈霉菌的CFPS 系統(tǒng)將成為表達(dá)高GC 含量基因和復(fù)雜天然產(chǎn)物基因簇的重要工具，也為天然產(chǎn)物生物合成途徑的獲取和研究提供了新的思路。

1.2.3 基于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的CFPS 系統(tǒng) 惡臭假單胞菌是一種革蘭陰性桿菌，已具有成熟的培養(yǎng)技術(shù)和遺傳操作手段，被廣泛用于天然產(chǎn)物的生物合成［78］，是實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)生產(chǎn)的強(qiáng)大功能底盤［79-80］。早在2004年，Nakashima 等［81］就開發(fā)了基于熒光假單胞菌的CFPS 系統(tǒng)，但該系統(tǒng)中細(xì)胞提取物制備方法復(fù)雜且蛋白產(chǎn)量低，具有很大的改進(jìn)空間。直到2018年，Jewett 團(tuán)隊(duì)參照大腸桿菌CFPS 系統(tǒng)開發(fā)了基于惡臭假單胞菌的CFPS系統(tǒng)，通過降低反應(yīng)溫度、提高提取物濃度、提高質(zhì)粒濃度和優(yōu)化鎂離子濃度成功對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的sfGFP（superfolder green fluorescent protein）產(chǎn)量與未優(yōu)化的系統(tǒng)相比提高了10 倍以上，可達(dá)198 μg/mL［56］。研究團(tuán)隊(duì)還利用該系統(tǒng)對(duì)15 個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site，RBS）序列的表達(dá)效率進(jìn)行表征，證明了該平臺(tái)快速評(píng)估和篩選基因調(diào)控元件的能力。2019年，Yim 和Johns［82］構(gòu)建、測(cè)試和優(yōu)化了10 種不同細(xì)菌來源的細(xì)胞提取物并對(duì)其轉(zhuǎn)錄翻譯能力進(jìn)行了測(cè)試，其中惡臭假單胞菌細(xì)胞提取物系統(tǒng)表現(xiàn)出了穩(wěn)定持續(xù)的轉(zhuǎn)錄翻譯能力。由此可見，基于惡臭假單胞菌的CFPS 系統(tǒng)不僅為體外蛋白合成提供了新的可能性，還將為基因調(diào)控元件的篩選和原型構(gòu)建提供平臺(tái)。

1.2.4 基于需鈉弧菌（Vibrio natriegens）的CFPS 系統(tǒng) 需鈉弧菌是迄今為止發(fā)現(xiàn)的增長(zhǎng)最快的非致病性微生物，其在分子生物學(xué)、蛋白表達(dá)和代謝工程方面具有廣泛的應(yīng)用前景，有可能取代大腸桿菌成為實(shí)驗(yàn)室的常用底盤［83-85］。快速分裂的需鈉弧菌細(xì)胞擁有高度活躍的蛋白質(zhì)翻譯機(jī)制，研究表明指數(shù)增長(zhǎng)的需鈉弧菌每細(xì)胞含有約115 000 個(gè)核糖體，顯著高于大腸桿菌中觀察到的每細(xì)胞約70 000 個(gè)核糖體［86］，這些特性顯示出了需鈉弧菌可以被開發(fā)為CFPS 平臺(tái)的潛力。Failmezger 等［57］利用需鈉弧菌細(xì)胞提取物可以在小批量反應(yīng)中成功合成高達(dá)0.4 g/L 的eGFP，并利用該系統(tǒng)進(jìn)行了啟動(dòng)子庫的篩選，展現(xiàn)了該系統(tǒng)作為CFPS 平臺(tái)的適用性和篩選潛在遺傳調(diào)控元件的能力。與此同時(shí)，研究者們也在探索需鈉弧菌細(xì)胞提取物的簡(jiǎn)易制備工藝，Wiegand團(tuán)隊(duì)［87］設(shè)計(jì)了一種不需要專門設(shè)備和冗長(zhǎng)純化步驟的簡(jiǎn)化提取物制備方案，該方案在3 h 的小批量反應(yīng)中可以獲得＞260 μg/mL 的sfGFP。Des Soye等［88］使用標(biāo)準(zhǔn)超聲設(shè)備來代替昂貴的高壓均質(zhì)機(jī)制備了需鈉弧菌細(xì)胞提取物，之后通過優(yōu)化提取物制備工藝和無細(xì)胞反應(yīng)條件使該系統(tǒng)的sfGFP 產(chǎn)量達(dá)（1.6±0.05）g/L。利用該系統(tǒng)還成功地進(jìn)行了抗菌肽的合成，并證明該系統(tǒng)在凍干后仍可以保持生物合成能力。以上研究成果可以看出，基于需鈉弧菌開發(fā)的CFPS 平臺(tái)作為大腸桿菌細(xì)胞提取物系統(tǒng)的有力替補(bǔ)，具有高度的靈活性和廣闊的發(fā)展空間，可能會(huì)使蛋白表達(dá)和基因元件篩選向著更快速的方向發(fā)展。

基于更多底盤生物的CFPS 平臺(tái)的開發(fā)不僅給體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)提供了更多選擇，而且有望更好地模擬宿主細(xì)胞的原型應(yīng)用過程，開辟新的研究領(lǐng)域。以上新開發(fā)的原核細(xì)胞提取物系統(tǒng)與大腸桿菌CFPS系統(tǒng)相比有不同的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)，比如枯草芽孢桿菌和需鈉弧菌細(xì)胞提取物系統(tǒng)不需要密碼子優(yōu)化，且細(xì)胞提取物中細(xì)菌內(nèi)毒素含量遠(yuǎn)低于大腸桿菌，可減輕生物制藥行業(yè)的下游加工負(fù)擔(dān)，在設(shè)計(jì)和生產(chǎn)未來蛋白藥物方面具有更大的潛力。然而，這些CFPS 系統(tǒng)的蛋白合成水平仍低于大腸桿菌，一些需要更高蛋白質(zhì)產(chǎn)量的應(yīng)用如需要更強(qiáng)輸出信號(hào)的無細(xì)胞生物傳感器仍然最適用于大腸桿菌系統(tǒng)［89］，所以還需對(duì)新開發(fā)的CFPS 系統(tǒng)有針對(duì)性的優(yōu)化以提高系統(tǒng)的效率和表達(dá)水平，將在大腸桿菌CFPS系統(tǒng)中的應(yīng)用在其他CFPS 系統(tǒng)中進(jìn)行嘗試，擴(kuò)大CFPS 系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。

2 模板DNA 的研究進(jìn)展

DNA 模板的合理設(shè)計(jì)是提高CFPS 效率的關(guān)鍵之一，隨著CFPS 系統(tǒng)的快速發(fā)展，模板DNA 在制備和應(yīng)用方面也取得了一定的進(jìn)步，如何降低制備成本、提高利用效率是研究者們重點(diǎn)關(guān)注的問題，本文將分別討論質(zhì)粒DNA 模板和線性DNA 模板在CFPS 系統(tǒng)中的研究進(jìn)展。

2.1 質(zhì)粒DNA模板

2.1.1 制備大量高純度DNA 在大多數(shù)情況下，含有目的基因的超螺旋質(zhì)粒DNA 由于其良好的穩(wěn)定性被廣泛用于無細(xì)胞系統(tǒng)。質(zhì)粒DNA 模板是決定CFPS 系統(tǒng)吞吐量的重要因素，當(dāng)目標(biāo)是生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)時(shí)，質(zhì)粒DNA 模板是首選。近年來，隨著細(xì)胞提取物制備方法的進(jìn)步以及能量底物成本的降低，大量高純度DNA 變成了CFPS 反應(yīng)中最昂貴的底物之一，為了解決這一問題，DNA 體外擴(kuò)增技術(shù)被用于生產(chǎn)CFPS 系統(tǒng)中的模板DNA（圖1-a）。滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，該技術(shù)以環(huán)狀DNA 為模板，利用φ29 高保真DNA 聚合酶和耐外切酶的隨機(jī)引物，可以方便地等溫?cái)U(kuò)增表達(dá)質(zhì)粒［90］。Nojima 等［91］將利用滾環(huán)擴(kuò)增制備的重復(fù)DNA 序列用于無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄-翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)，反應(yīng)效率高于質(zhì)粒模板和PCR擴(kuò)增的線性DNA。Kumar 等［92］利用φ29DNA 聚合酶多重引物RCA 從100 ng 的起始材料中擴(kuò)增出了5 μg 的環(huán)狀DNA，擴(kuò)增出的DNA 生成的轉(zhuǎn)錄本在體外轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)中具有與純化質(zhì)粒獲得的轉(zhuǎn)錄本幾乎相同的效率，可以作為蛋白質(zhì)合成的高質(zhì)量模板。Su’etsugu 等［93］在體外用14 種純化的酶重構(gòu)了基于oriC 的大腸桿菌基因組復(fù)制循環(huán)（圖1-a），并證明了這種復(fù)制周期反應(yīng)（replication-cycle reaction，RCR）可以選擇性地?cái)U(kuò)增由多片段組裝反應(yīng)構(gòu)建的環(huán)狀分子。OriCiro Genomics 基于此開發(fā)了一種無細(xì)胞克隆系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過多個(gè)重疊DNA 片段的無縫組裝和RCR 擴(kuò)增，在一天內(nèi)可以得到與從大腸桿菌中分離的質(zhì)粒DNA 相同的超螺旋DNA（表2）。

圖1 質(zhì)粒DNA 模板在CFPS 系統(tǒng)中的研究進(jìn)展Fig.1 Research progress of plasmid DNA template in CFPS system

2.1.2 質(zhì)粒DNA 模板的高效克隆 質(zhì)粒DNA 模板制備的另一個(gè)研究進(jìn)展是快速高效克隆（表2）。質(zhì)粒DNA 模板制備需要設(shè)計(jì)、構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與提取等步驟，這個(gè)過程往往耗時(shí)又耗力，如何縮短質(zhì)粒DNA模板的制備周期以加速其在CFPS 系統(tǒng)中的應(yīng)用逐漸成為了研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。由Invitrogen 開發(fā)的Gateway 克隆系統(tǒng)可以利用整合酶一步插入所需基因到載體中（圖1-b），為實(shí)現(xiàn)高通量的基因功能分析和快速的蛋白質(zhì)表達(dá)提供了平臺(tái)［99］。Goshima 等［50］利用該平臺(tái)高通量生產(chǎn)了33 275 個(gè)入門克?。╡ntry clone），這些克隆隨后用于人類蛋白的無細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)行體外蛋白質(zhì)組學(xué)研究。除此之外，GoldenGate克隆系統(tǒng)也被證明可以用于CFPS 中，GoldenGate克隆系統(tǒng)采用IIS 型限制性內(nèi)切酶在識(shí)別序列外部切割DNA，可以做到高效無痕組裝［100］（圖1-b）。Freemont 團(tuán)隊(duì)基于GoldenGate 克隆系統(tǒng)開發(fā)了一種試劑盒EcoFlex，該試劑盒包含一個(gè)簡(jiǎn)化的DNA 模塊化包（啟動(dòng)子、RBS、終止子等），可以用于以大腸桿菌細(xì)胞為底盤的CFPS 中［94］。Dudley 等［95］也基于GoldenGate 克隆系統(tǒng)開發(fā)了一種適用于植物蛋白表達(dá)的DNA 組裝工具包，該工具包含有用于大腸桿菌或小麥胚芽CFPS 系統(tǒng)的質(zhì)粒受體和用于純化、檢測(cè)和提高可溶性蛋白產(chǎn)量的標(biāo)簽，研究者們利用該工具包優(yōu)化了一系列植物蛋白的表達(dá)。這些基于GoldenGate 克隆系統(tǒng)開發(fā)的試劑盒/工具包將DNA部件的自動(dòng)化組裝和無細(xì)胞反應(yīng)結(jié)合，顯著加速了蛋白功能的表征以及組合路徑的優(yōu)化。

表2 質(zhì)粒DNA 模板在CFPS 系統(tǒng)中的制備策略Table 2 Plasmid DNA template preparation strategies in CFPS system

2.1.3 質(zhì)粒DNA 模板與水凝膠結(jié)合 將質(zhì)粒DNA模板與水凝膠材料結(jié)合構(gòu)建更高效可控的CFPS 平臺(tái)是質(zhì)粒DNA 模板制備的又一個(gè)新的研究進(jìn)展。水凝膠是一種很有前途的生物相容性材料，近年來已被證明可以用于CFPS 系統(tǒng)中為蛋白質(zhì)合成提供一個(gè)高通量表達(dá)、可循環(huán)使用的腔室微環(huán)境［101］。已有研究將模板DNA 與水凝膠結(jié)合使其固定在一個(gè)區(qū)域化和局部化的空間中來進(jìn)行無細(xì)胞蛋白表達(dá)，Luo團(tuán)隊(duì)通過線性化質(zhì)粒的共價(jià)連接制備了DNA 水凝膠［102-103］；Thiele 等［104］制備了透明質(zhì)酸水凝膠微球作為原始細(xì)胞的“細(xì)胞核”，線性化的質(zhì)粒通過共價(jià)鍵附著在微球上。然而，由于質(zhì)粒的線性化或共價(jià)連接，這些系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄和翻譯方面效率較低，為了避免這種情況，一些不需要質(zhì)粒線性化且制備簡(jiǎn)單的水凝膠系統(tǒng)不斷被開發(fā)出來（表2）。Yang 團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種黏土水凝膠系統(tǒng)作為CFPS 的有效平臺(tái)（圖1-c）［96］，該系統(tǒng)中黏土微凝膠的制備以及質(zhì)粒與黏土微凝膠的結(jié)合都只涉及簡(jiǎn)單的靜電相互作用，由于質(zhì)粒集中在微凝膠內(nèi)具有較高的局部濃度且黏土微凝膠保護(hù)了質(zhì)粒不被裂解液中的脫氧核糖核酸酶消化［105］，該系統(tǒng)顯著提高了蛋白質(zhì)生產(chǎn)水平。該團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的基因/黏土/磁性納米顆粒（magnetic nanoparticle，MNP）微凝膠系統(tǒng)也為回收再利用微凝膠、實(shí)現(xiàn)重復(fù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)提供了可能［96］。Lu 團(tuán)隊(duì)也利用納米黏土的凝膠荷電特性將質(zhì)粒固定在了納米黏土表面，通過增加無細(xì)胞體系中的局部基因濃度使蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加1.75 倍［97］。該團(tuán)隊(duì)還開發(fā)了聚N-異丙基丙烯酰胺（pNIPAM）水凝膠系統(tǒng)來攜帶質(zhì)粒DNA［98］（圖1-c），pNIPAM 隨著溫度升高會(huì)發(fā)生體積相變（volume phase transition，VPT），利用這一特性質(zhì)粒可以固定在水凝膠表面形成聚集態(tài)。當(dāng)包被質(zhì)粒濃度為10-20 ng/μL 時(shí)，無細(xì)胞蛋白產(chǎn)量比液相體系提高了兩倍，蛋白質(zhì)合成的有效時(shí)間也翻了一番。將質(zhì)粒DNA 模板與水凝膠結(jié)合不僅可以增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量和實(shí)現(xiàn)蛋白的重復(fù)生產(chǎn)，還能為研究者們提供功能或結(jié)構(gòu)上的好處（例如生物相容性或黏接特性），為構(gòu)建高效可控的CFPS 平臺(tái)用于功能性蛋白的表達(dá)和檢測(cè)提供了新的思路。

2.1.4 質(zhì)粒DNA 模板的來源 除了質(zhì)粒DNA 模板的制備方法會(huì)影響CFPS 系統(tǒng)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，已有研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的來源也會(huì)影響無細(xì)胞蛋白表達(dá)水平（圖1-d）。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄受宿主背景的影響和宿主因子的調(diào)控［106］，因此來自不同宿主背景的表達(dá)質(zhì)粒在進(jìn)行無細(xì)胞蛋白表達(dá)時(shí)會(huì)出現(xiàn)一定的差異（表2）。Zhang 等［89］選擇了大腸桿菌常見的7 個(gè)感受態(tài)細(xì)胞來檢測(cè)不同質(zhì)粒來源對(duì)基于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞提取物系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示不同感受態(tài)細(xì)胞的蛋白產(chǎn)量相差近兩倍。Failmezger 等［57］從需鈉弧菌和大腸桿菌中均純化了質(zhì)粒用于基于需鈉弧菌細(xì)胞提取物系統(tǒng)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)，結(jié)果表明當(dāng)質(zhì)粒來源于需鈉弧菌時(shí)的蛋白表達(dá)量比來源于大腸桿菌要好40%，由此可以推測(cè)，兩種物種之間限制修飾系統(tǒng)的差異會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄和翻譯性能，所以在進(jìn)行無細(xì)胞蛋白表達(dá)時(shí)最好選擇與它所應(yīng)用的CFPS 系統(tǒng)具有相同細(xì)胞來源的表達(dá)質(zhì)粒。

2.2 線性DNA模板

CFPS 系統(tǒng)與體內(nèi)系統(tǒng)相比的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是它能夠直接利用線性DNA 模板來實(shí)現(xiàn)蛋白的表達(dá)，線性DNA 模板省去了質(zhì)粒構(gòu)建、驗(yàn)證和提取步驟，可以通過PCR 在體外數(shù)小時(shí)內(nèi)高效合成，大大加快了遺傳電路原型制作周期［107］，也使有毒蛋白的表達(dá)和分析成為可能。然而，細(xì)胞中的內(nèi)源性核酸酶會(huì)降解線性DNA 模板，使蛋白表達(dá)量大大降低。由于使用線性DNA 模板替代質(zhì)粒DNA 模板具有顯著的優(yōu)勢(shì)，許多提高線性DNA 模板在CFPS 系統(tǒng)中穩(wěn)定性的方法已經(jīng)被開發(fā)出來［108-109］（表3），主要包括基因組改造、添加核酸酶抑制劑、對(duì)線性DNA 模板進(jìn)行修飾和設(shè)計(jì)以及添加DNA 結(jié)合蛋白4 個(gè)方面（圖2）。

表3 CFPS 系統(tǒng)中穩(wěn)定線性DNA 模板的策略比較Table 3 Comparison of different linear DNA template protection strategies in CFPS system

2.2.1 基因組改造 早期的工作主要集中于對(duì)大腸桿菌的基因組改造上（圖2-a），大腸桿菌的內(nèi)源性外切酶復(fù)合物RecBCD 對(duì)線性DNA 具有很高的降解率［119-120］，Michel-Reydellet 等［110］通過λ-Red 重組系統(tǒng)替換了大腸桿菌基因組中的recBCD基因，基于此突變菌株的提取物系統(tǒng)與野生型提取物相比，線性DNA 模板的蛋白質(zhì)產(chǎn)量超過3 倍。Ahn 等［113］制備了一個(gè)RNase 缺陷的大腸桿菌菌株的細(xì)胞提取物，通過減少mRNA 的降解提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)量。但這些突變菌株的生長(zhǎng)缺陷使制備提取物的周期變長(zhǎng)，其蛋白質(zhì)合成活性也明顯降低［122］。

2.2.2 添加核酸酶抑制劑 與基因組改造相比，抑制提取物中的核酸酶往往更易于操作和推廣（圖2-b）。應(yīng)用最廣泛的核酸酶抑制劑為噬菌體λ 蛋白GamS，在大腸桿菌提取物中加入純化的GamS 蛋白，可以使PCR 模板達(dá)到與質(zhì)粒DNA 模板相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)合成水平［122］。雖然此種方法效果較好，但需要重組表達(dá)和蛋白純化步驟，開發(fā)更為簡(jiǎn)易有效的核酸酶抑制劑仍是研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)RecBCD 的活性可以被有機(jī)小分子所抑制［111］，Shrestha 等［123］選擇了兩種最具抑制性的分子（CID 697851 和CID 1517823）添加到無細(xì)胞反應(yīng)中，與沒有RecBCD 抑制劑的反應(yīng)相比，線性DNA 模板的表達(dá)提高了200%。Marshall 等［112］證明了一個(gè)包含多個(gè)Chi 位點(diǎn)的短dsDNA 序列可以穩(wěn)定線性DNA模板，并大大提高不同蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生物合成，盡管線性DNA 模板的蛋白質(zhì)產(chǎn)量仍然小于質(zhì)粒模板，但生成Chi DNA 成本低廉，使用簡(jiǎn)單，可以作為標(biāo)準(zhǔn)成分納入CFPS 反應(yīng)。

圖2 CFPS 系統(tǒng)中保護(hù)線性DNA 模板的研究進(jìn)展Fig.2 Research progress of protecting linear DNA template in CFPS system

2.2.3 對(duì)線性DNA 模板進(jìn)行修飾和設(shè)計(jì) 對(duì)線性DNA 模板進(jìn)行修飾和設(shè)計(jì)可以降低其對(duì)核酸酶降解的敏感性，從而提高線性DNA 模板在CFPS 反應(yīng)中的穩(wěn)定性（圖2-c）。通過對(duì)線性DNA 模板進(jìn)行合理設(shè)計(jì)可以延長(zhǎng)mRNA 的半衰期從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量，Ahn 等［113］發(fā)現(xiàn)T7 終止序列和Poly（G）序列的加入可以增強(qiáng)mRNA 的穩(wěn)定性，分別使蛋白產(chǎn)量提高近2 倍和3 倍。核酸酶與線性DNA 的結(jié)合位點(diǎn)往往位于線性DNA 的末端，因此在線性DNA 末端合理設(shè)計(jì)保護(hù)序列也是一種保護(hù)線性DNA 不受核酸酶侵害的有效方法。Chen 等［114］運(yùn)用電腦模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法合理設(shè)計(jì)了線性DNA 末端的保護(hù)序列，包括GC 含量、GC 排列、GC 分布和莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該序列設(shè)計(jì)策略可將線性DNA 模板的蛋白表達(dá)量提高到質(zhì)粒的75%。該團(tuán)隊(duì)在篩選影響位點(diǎn)特異性非天然氨基酸嵌入效率的因素時(shí)，也利用了添加保護(hù)序列的線性DNA 作為模板［124］，進(jìn)一步證實(shí)了該方法的可行性和有效性。Luo團(tuán)隊(duì)將線性DNA與X-DNA交聯(lián)成水凝膠進(jìn)行無細(xì)胞蛋白表達(dá)，解決了線性DNA 模板的溶解度限制和對(duì)核酸酶降解的脆弱性，結(jié)果蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加了近300 倍［102］，之后開發(fā)的黏土水凝膠［105］和混合水凝膠［125］也被證明可以作為批量或連續(xù)蛋白表達(dá)的可循環(huán)基因載體。除此之外，已有研究發(fā)現(xiàn)將線性DNA 連接成環(huán)、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）后用于CFPS 反應(yīng)中，可解決線性DNA 模板被核酸酶降解的問題，并可以在省去質(zhì)?？寺〔襟E的同時(shí)達(dá)到和質(zhì)粒模板相當(dāng)?shù)乃剑?15，126］。

2.2.4 添加DNA 結(jié)合蛋白 DNA 結(jié)合蛋白通過結(jié)合在線性DNA 模板的兩端，可以使其免受核酸酶的降解（圖2-d）。隨著新的細(xì)胞提取物系統(tǒng)不斷被開發(fā)出來，DNA 結(jié)合蛋白對(duì)線性DNA 模板的保護(hù)不再僅局限于大腸桿菌CFPS 系統(tǒng)［56，87］。一種DNA結(jié)合蛋白Ku 已被證明可以保護(hù)dsDNA 末端不受分枝桿菌解旋酶/核酸酶AdnAB 的降解［127］，Yim等［116］基于此發(fā)現(xiàn)評(píng)估了Ku 在CFPS 反應(yīng)中對(duì)線性DNA 模板的保護(hù)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然Ku 在大腸桿菌CFPS 中不如GamS 和Chi DNA 有效，但其在多種細(xì)菌的CFPS 中都展現(xiàn)了一定程度的線性DNA保護(hù)能力，特別是在革蘭氏陽性菌株枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌的CFPS 反應(yīng)中，與不加DNA 結(jié)合蛋白的對(duì)照組相比，Ku 保護(hù)的線性DNA 模板的基因表達(dá)水平分別提高了4.43 倍和1.58 倍。Zhu等［117］鑒定了一種DNA 結(jié)合蛋白——單鏈Cro 蛋白（scCro），該蛋白除了在大腸桿菌CFPS 系統(tǒng)中展現(xiàn)了優(yōu)秀的線性DNA 模板保護(hù)能力，在需鈉弧菌CFPS 系統(tǒng)中也展現(xiàn)了很好的適用性，使sfGFP 的表達(dá)量增加了18 倍。Norouzi 等［118］基于“Tus-Ter”大腸桿菌DNA 復(fù)制終止系統(tǒng)開發(fā)了一種在CFPS 中保護(hù)線性DNA 的方法，通過將Ter 序列附加到線性DNA 模板的末端，并與Tus 蛋白結(jié)合，可以保護(hù)線性DNA 模板不被外切酶降解。該Tus-Ter 線性DNA模板保護(hù)策略在大腸桿菌和需鈉弧菌的CFPS 中都很有效，可以達(dá)到與質(zhì)粒模板相似或更高的蛋白表達(dá)。

3 總結(jié)與展望

過去的十年里，CFPS 系統(tǒng)取得了的巨大技術(shù)進(jìn)步，逐漸向著更大規(guī)模、更短時(shí)間、更低成本的方向發(fā)展。其應(yīng)用領(lǐng)域也不斷擴(kuò)大，從合成重要蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)高通量篩選以及生產(chǎn)蛋白類藥物，到如今在人造細(xì)胞、遺傳網(wǎng)絡(luò)、生物傳感、生物制造，甚至是合成生物學(xué)教育方面的應(yīng)用［4］，都體現(xiàn)出了CFPS系統(tǒng)替代傳統(tǒng)生物系統(tǒng)的無限潛力。

CFPS 系統(tǒng)在取得巨大進(jìn)展的同時(shí)也面臨著許多挑戰(zhàn)。為了生產(chǎn)更多更復(fù)雜的蛋白質(zhì)、探索更豐富的生物合成路徑，許多新的細(xì)胞提取物系統(tǒng)被開發(fā)出來，但這些新的細(xì)胞提取物系統(tǒng)的蛋白產(chǎn)量與大腸桿菌系統(tǒng)仍有差距，大腸桿菌作為目前唯一能夠達(dá)到與活細(xì)胞蛋白產(chǎn)量相當(dāng)?shù)臒o細(xì)胞底盤，依然是蛋白表達(dá)的最優(yōu)選擇。目前研究者們對(duì)其他細(xì)胞提取物系統(tǒng)的探索還處于起步階段，如何進(jìn)一步將它們的活細(xì)胞功能重現(xiàn)在無細(xì)胞體系中還需要做更多的工作，比如細(xì)胞提取物制備方案要根據(jù)不同的底盤細(xì)胞進(jìn)行修改、對(duì)提高蛋白產(chǎn)量的輔助因子進(jìn)行探索等。同時(shí)，為了進(jìn)一步加快CFPS 系統(tǒng)的反應(yīng)周期和降低CFPS 系統(tǒng)的成本，模板DNA 的制備步驟也逐漸簡(jiǎn)便化，并且可以根據(jù)不同的細(xì)胞提取物系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整。但這也意味著模板DNA 的制備不再遵循統(tǒng)一的原則，使得制備策略還不能標(biāo)準(zhǔn)化的納入CFPS 反應(yīng)。此外，目前CFPS 系統(tǒng)主要致力于研究單個(gè)基因的表達(dá)，使制備策略也局限于單個(gè)基因的模塊化構(gòu)建，后續(xù)可以對(duì)一些基因組DNA 和大片段DNA 的制備策略進(jìn)行研究，將有助于擴(kuò)大CFPS系統(tǒng)在噬菌體人工合成和多基因功能性表達(dá)方面的應(yīng)用。

總之，CFPS 系統(tǒng)已經(jīng)成為了體外蛋白表達(dá)的有效平臺(tái)，并且正在向著更廣闊的領(lǐng)域繼續(xù)發(fā)展。合成生物學(xué)領(lǐng)域新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)使CFPS 系統(tǒng)的各個(gè)環(huán)節(jié)都取得了一定的技術(shù)進(jìn)展，CFPS 系統(tǒng)的進(jìn)步也將給合成生物學(xué)領(lǐng)域帶來新的機(jī)遇。