龍嘉莉，劉曙光，馬紅梅，曾超

(中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518033)

目前，宮頸癌仍是婦女癌癥相關(guān)死亡的主要原因。雖然近年來宮頸癌在全世界的發(fā)病率已顯著下降，但其死亡率在發(fā)展中國家仍在增加。一般來說，早期宮頸癌患者治療后的5年生存率可達(dá)90%以上，而中晚期患者的5年生存率不到30%[1]。因此，找到驅(qū)動宮頸癌進(jìn)展的因素尤為重要。本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究[2]發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變級別的增加，叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)表達(dá)強(qiáng)度和陽性率增加，證實(shí)Foxp3在宮頸癌的進(jìn)展過程中起著重要作用。為進(jìn)一步探究Foxp3對宮頸癌生物學(xué)行為的影響及分子調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片篩選出Foxp3下游基因SMARCE1，并證實(shí)Foxp3調(diào)控SMARCE1促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲和遷移。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌Hela細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000均購自美國賽默飛公司；蛋白濃度測量試劑盒購自上海碧云天公司；一抗兔抗人單克隆抗體Foxp3、SMARCE1購自美國Abcam公司；兔多抗GAPDH購自杭州賢至生物公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；Transwell小室購自美國康寧公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 宮頸癌Hela細(xì)胞采用含10%胎牛血清及1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。將生長狀態(tài)良好、匯合度為85%左右的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。Foxp3 shRNA序列為：

CCTCCAGAGAGAGATGGTA，質(zhì)粒表達(dá)載體由上海吉瑪公司合成。Foxp3 shRNA配套的陰性對照質(zhì)粒的Hela細(xì)胞作為對照組。利用從Hela細(xì)胞中提取的mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增人Foxp3全長cDNA。引物序列設(shè)計(jì)如下：

Foxp3-F:5-′TGGTACCGAGCTCGCCACCATGCCCACCAGGCCTGGCAAG-3′；

Foxp3-R:5-′GATATCTGCAGAATTCTCAGGGGCCAGGTGTAGGGTTG-3′。將Foxp3 DNA片段克隆入pcDNA3.1構(gòu)建重組pcDNA3.1-Foxp3質(zhì)粒。取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染干擾或過表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染對應(yīng)的空質(zhì)粒的Hela細(xì)胞作為對照組。

1.2.2 Western blot(WB)實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后采用WB法檢測Hela細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)情況。采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后使用1∶1 000稀釋后的一抗過夜孵育，選擇HRP標(biāo)記的二抗標(biāo)記后采用ECL發(fā)光試劑盒顯影后采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測染色條帶的強(qiáng)度，計(jì)算目的蛋白和內(nèi)參蛋白的光密度比值。

1.2.3 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染24 h的后的Hela細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化收集，無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個/mL備用。在24孔板中預(yù)先加入1 mL的DMEM完全培養(yǎng)基(含雙抗)，并放入Transwell小室，1 h后在Transwell上室分別接入200 μL各組細(xì)胞懸液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，取出Transwell，固定、清洗后染色，于顯微鏡下觀察拍照。侵襲實(shí)驗(yàn)需制備帶Matrigel膠的Transwell上室，余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 生物信息分析 基因芯片分析Hela細(xì)胞敲低Foxp3表達(dá)后的差異表達(dá)基因。生物信息分析由上海GENECHEM公司進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)。兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

采用WB法觀察Foxp3 shRNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的Foxp3表達(dá)情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)oxp3 shRNA轉(zhuǎn)染組的Hela細(xì)胞中Foxp3蛋白表達(dá)比對照組下降(P<0.05)。見圖1。

2.2 Foxp3 shRNA轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Foxp3 shRNA的Hela細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量較對照組Hela細(xì)胞細(xì)胞遷移數(shù)量少(P<0.05)。見圖2。

2.3 Foxp3 shRNA轉(zhuǎn)染后對宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Foxp3 shRNA的Hela細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量較對照組Hela細(xì)胞細(xì)胞侵襲數(shù)量少(P<0.05)。見圖3。

2.4 SMARCE1是Foxp3下游表達(dá)相關(guān)基因

采用基因芯片技術(shù)尋找Foxp3下游基因。通過shRNA敲除Hela細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)1 427個基因上調(diào)，1 511個基因下調(diào)，其中包括SMARCE1。見圖4。

2.5 Foxp3 shRNA轉(zhuǎn)染后宮頸癌Hela細(xì)胞SMARCE1表達(dá)下調(diào)

WB驗(yàn)證Foxp3 shRNA轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞中SMARCE1的表達(dá)情況。WB顯示，轉(zhuǎn)染Foxp3 shRNA后，與對照組相比，SMARCE1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖5。

2.6 Foxp3 shRNA和轉(zhuǎn)染SMARCE1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后宮頸癌Hela細(xì)胞遷移情況

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明，共轉(zhuǎn)染Foxp3 shRNA和SMARCE1質(zhì)粒組的細(xì)胞較共轉(zhuǎn)染Foxp3 shRNA和pcDNA3.1空質(zhì)粒組細(xì)胞遷移數(shù)量多(P<0.05)。見圖6。

2.7 Foxp3 shRNA和轉(zhuǎn)染SMARCE1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲情況

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，共轉(zhuǎn)染Foxp3 shRNA和SMARCE1質(zhì)粒組的細(xì)胞較共轉(zhuǎn)染Foxp3 shRNA和pcDNA3.1空質(zhì)粒組細(xì)胞侵襲數(shù)量多(P<0.05)。見圖7。

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，近年來更有向年輕化發(fā)展的趨勢。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因改變且多步驟的復(fù)雜過程，因此，探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制，尋找有效分子的靶向治療方法，將對加強(qiáng)和促進(jìn)宮頸癌的防治工作提供實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。

最新研究[3]表明，除了T細(xì)胞譜系之外，F(xiàn)oxp3在一系列癌癥中表達(dá)，包括卵巢[4]、肺[5]和前列腺癌。然而，F(xiàn)oxp3對癌癥的影響非常有爭議。在結(jié)腸直腸癌[6]、黑色素瘤[7]和肺癌[8]中，高水平的Foxp3提示與不良的預(yù)后有關(guān)。相反，高水平的Foxp3卻有利于乳腺癌的預(yù)后[9]。本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變級別的增加，F(xiàn)oxp3表達(dá)強(qiáng)度和陽性率增加，提示Foxp3可能在宮頸病變組織水平的分化和生長中發(fā)揮重要作用[2]。研究組進(jìn)一步證實(shí)，F(xiàn)oxp3通過外源敲低Foxp3表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。染色質(zhì)重塑對于全身性生理穩(wěn)態(tài)是必不可少的。染色質(zhì)重塑的異常通常導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展[10]。因此，在許多類型的癌癥中經(jīng)常觀察到參與染色質(zhì)重塑的基因突變[11]。SMARCE1是SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的組分，通過以ATP依賴性方式改變核小體內(nèi)的DNA-組蛋白觸點(diǎn)而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)[12]。證據(jù)[13-15]表明，較高的SMARCE1表達(dá)與乳腺癌、胃癌和卵巢癌的預(yù)后相關(guān)，SMARCE1可以作為預(yù)測癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的指標(biāo)。在本研究中，課題組通過基因芯片分析，篩選出SMARCE1作為宮頸癌細(xì)胞中Foxp3的下游差異表達(dá)基因。此外，SMARCE1的過表達(dá)可以拮抗Foxp3敲低介導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制，表明SMARCE1至少部分促進(jìn)Foxp3介導(dǎo)的遷移和宮頸癌細(xì)胞的侵襲。這是首次提出SMARCE1可作為Foxp3下游作用基因，并揭示了SMARCE1調(diào)節(jié)對Foxp3在宮頸癌中的致癌作用的功能意義。

綜上，F(xiàn)oxp3可調(diào)控下游SMARCE1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，該結(jié)果對Foxp3在宮頸癌中的致癌功能提供了新線索，這表明Foxp3/SMARCE1信號軸可能是宮頸癌進(jìn)展的新途徑。