馬伯利，劉悅陽，聶雪伊，李夢媛，楊 易，徐金瑞

（寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川750021）

結(jié)核病（tuberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的一種慢性呼吸道傳染?。?］，中國結(jié)核病患者數(shù)量排名位于全球前列，結(jié)核病和艾滋病雙重感染［2］和耐藥結(jié)核?。?］的出現(xiàn)是造成人類結(jié)核病死亡的重要原因，Mtb能夠在宿主體內(nèi)進(jìn)入潛伏狀態(tài)。巨噬細(xì)胞是阻止Mtb入侵肺正常細(xì)胞的首要宿主免疫細(xì)胞［4］。Mtb被巨噬細(xì)胞吞噬后，可以分泌毒力因子與膜上的絲氨酸蛋白酶阻止蛋白酶G結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞焦亡（pyroptosis），逃逸固有免疫的清除。Mtb分泌的EST12（12 kD early secreted antigen target）蛋白可激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）-caspase-1/11-消皮素D（gasdermin D，GSDMD）-白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）介導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡［5］；Mtb早期分泌性靶抗原分泌系統(tǒng)1分泌的ESAT-6等蛋白導(dǎo)致宿主細(xì)胞質(zhì)膜損傷，促進(jìn)K+外流，進(jìn)而釋放IL-1β和IL-18等炎癥因子并引發(fā)細(xì)胞焦亡［6］。牛型結(jié)核分枝桿菌減毒株（即卡介苗，Bacillus Calmette-Guérin，BCG）感染巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體表達(dá)及IL-1β和IL-18釋放［7］，且NLRP3炎癥小體、IL-1β和IL-18與巨噬細(xì)胞焦亡有密切關(guān)系［8］。

已有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡具有重要的調(diào)控作用，但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3條通路——蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase Rlike endoplasmic reticulum kinase，PERK）、肌醇需求酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）［9］各自在BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡中發(fā)揮的作用尚未見報(bào)道。大量文獻(xiàn)研究顯示，ATF6通路在炎癥反應(yīng)［10］、細(xì)胞凋亡［11］、自噬［12］及腫瘤細(xì)胞增殖［13］等方面具有重要調(diào)控作用?；谝陨涎芯勘尘?，本研究采用siRNA敲減ATF6和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）表達(dá)，經(jīng)BCG感染THP-1細(xì)胞，采用Western blot檢測NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白、GSDMD的N端片段（N-terminal fragment of GSDMD，GSDMDN）、IL-1β p17及IL-18 p22蛋白的表達(dá)，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，采用免疫熒光檢測GSDMD蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。本研究旨在揭示ATF6/CHOP信號通路在BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡中的作用，為深入研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在結(jié)核分枝桿菌與宿主巨噬細(xì)胞互作中的調(diào)控作用提供參考資料。

材料和方法

1 細(xì)胞、試劑和儀器

人單核巨噬細(xì)胞THP-1購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；BCG購自成都生物制品研究所；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；佛波酯和Protease Inhibitor Cocktail購自Sigma-Aldrich；ATF6和CHOP干擾序列（表1）及GP-transfect-Mate購自上海吉瑪制藥有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；蛋白提取試劑M-PER?購自Thermo Fisher Scientific；β-巰基乙醇購自北京索萊寶科技有限公司；兔源β-actin、CHOP和GSDMD多克隆抗體，F(xiàn)ITC偶聯(lián)的羊抗兔IgG，熒光素偶聯(lián)的羊抗兔IgG購自Proteintech；兔源GSDMD、含caspase募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck

表1 siRNA所用引物信息Table 1.The primer information of siRNA

like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）、caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；兔源ATF6和cleaved caspase-1兔源多克隆抗體購自Affinity；CCK-8試劑盒購自北京愛必信生物科技有限公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自Bio-Rad；光學(xué)顯微鏡購自Motic；Amersham?Imager 600自動化學(xué)發(fā)光成像儀購自GE；Enspire熒光酶標(biāo)儀購自PerkinElmer；NanoDrop 8000和熒光共聚焦顯微鏡購自Thermo Fisher Scientific。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞按照每孔1×106個(gè)接種于6孔板中，并加入50 μg/L佛波酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 BCG培養(yǎng)配制含0.2% Tween-80的H7N9培養(yǎng)液，110℃、30 min高壓滅菌后，加入10%的ADC enrichment增菌劑。將BCG接種至7H9培養(yǎng)液中，在無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。BCG濃度通過Nano-Drop 8000測定600 nm的吸光度（absorbance，A）。BCG菌濃度計(jì)算方法：當(dāng)A600=0.01時(shí)，表示BCG的菌濃度為1×1010L-1。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞（1×106個(gè)）接種于6孔板中，細(xì)胞生長密度至80%～90%時(shí)，根據(jù)上海吉瑪制藥有限公司siRNA說明書分別轉(zhuǎn)染陰性對照si-NC、si-ATF6及si-CHOP。

2.4 BCG感染及分組設(shè)置si-NC組、si-NC+BCG組、si-ATF6+BCG組和si-CHOP+BCG組。si-NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾si-NC 24 h后正常培養(yǎng)；si-NC+BCG組細(xì)胞用GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染si-NC 24 h后，以感染復(fù)數(shù)為10∶1的BCG感染24 h（感染復(fù)數(shù)的計(jì)算參照Zheng等［14］的方法）；si-ATF6+BCG組細(xì)胞用GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染si-ATF6 24 h后，以感染復(fù)數(shù)為10∶1的BCG感染24 h；si-CHOP+BCG組細(xì)胞用GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染si-CHOP 24 h后，以感染復(fù)數(shù)為10∶1的BCG感染24 h。BCG感染24 h后，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)使用含EDTA和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂乳粉室溫封閉1 h，分別過夜孵 育β-actin（1∶3 000）、NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、pro-caspase-1（1∶1 000）、caspase-1 p20（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）、ATF6（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000）和GSDMD（1∶1 000）蛋白抗體，用TBST洗滌6次，每次5 min，用熒光素偶聯(lián)的羊抗兔IgG（1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。用Amersham?Imager 600儀器對蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測，使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算相關(guān)蛋白灰度值。

2.6 免疫熒光染色將按照2.1和2.3處理后的細(xì)胞使用PBS洗3遍，以4%多聚甲醛/PBS（pH 7.4）室溫固定20 min。0.1% Triton X-100通透20 min，5%驢血清蛋白封閉，抗GSDMD多克隆抗體（Proteintech，1∶250）孵育過夜。次日，37℃避光孵育FITC偶聯(lián)的熒光Ⅱ抗，DAPI染色，封片，用熒光共聚焦顯微鏡拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析各實(shí)驗(yàn)組的熒光圖片灰度值。

2.7 CCK-8法檢測細(xì)胞活力將THP-1細(xì)胞按照每孔104個(gè)接種至96孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)液孔作為空白對照，每組樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按照2.1和2.3方法處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，室溫3 h后，按照說明書要求，使用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測細(xì)胞A值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 9.0軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BCG感 染THP-1細(xì) 胞 后GSDMD-N、cleaved ATF6及CHOP蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，GSDMD-N、cleaved ATF6和CHOP蛋白的表達(dá)隨BCG感染時(shí)間的延長逐漸升高，GSDMD-N蛋白24 h達(dá)到最高，顯著高于0 h（P＜0.01），而CHOP和cleaved ATF6蛋白在48 h達(dá)到最高，顯著高于0 h（P＜0.01），見圖1。

2 敲減ATF6對BCG感染的THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的作用

Western blot結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-NC+BCG組cleaved ATF6、CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與si-NC+BCG組相比，si-ATF6+BCG組cleaved ATF6、CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖2。

Figure 1.The protein levels of GSDMD-N，cleaved ATF6 and CHOP in THP-1 cells of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 h.圖1各組細(xì)胞中GSDMD-N、cleaved ATF6及CHOP蛋白水平

Figure 2.The protein levels of cleaved ATF6，CHOP，NLRP3，ASC，pro-caspase-1，caspase-1 p20，IL-1β p17 and IL-18 p22 in THP-1 cells of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs si-NC+BCG group.圖2各組細(xì)胞中cleaved ATF6、CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22蛋白的表達(dá)

3 敲減ATF6對BCG感染的THP-1細(xì)胞焦亡的作用

Western blot檢測結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-NC+BCG組GSDMD-N蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；敲 減ATF6后，si-ATF6+BCG組GSDMD-N蛋白表 達(dá)較si-NC+BCG組顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖3A。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與si-NC組相比，si-NC+BCG組細(xì)胞活力顯著下調(diào)（P＜0.01）；敲減ATF6后，si-ATF6+BCG組細(xì)胞活力與si-NC+BCG組相比顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖3B。免疫熒光染色結(jié)果顯示，si-NC+BCG組的GSDMD蛋白表達(dá)量顯著高于si-NC組（P＜0.01），si-ATF6+BCG組GSDMD蛋白表達(dá)量顯著低于si-NC+BCG組（P＜0.01），見圖3C。

Figure 3.Pyroptosis of THP-1 cells infected with BCG after knockdown of ATF6.A：GSDMD-N protein expression in THP-1 cells of each group；B：the cell viability was determined by the CCK-8 assay；C：immunofluorescence of GSDMD protein in THP-1 cells（scale bar=100 μm）.GSDMD was labeled by green fluorescent antibody；blue fluorescence labeled nuclei.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs si-NC+BCG group.圖3敲減ATF6后BCG感染的THP-1細(xì)胞的焦亡情況

4 敲減CHOP對BCG感染的THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化的作用

Western blot結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-NC+BCG組CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與si-NC+BCG組 相 比，si-CHOP+BCG組CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖4。

5 敲減CHOP對BCG感染的THP-1細(xì)胞焦亡的作用

Western blot結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-NC+BCG組GSDMD-N蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；敲減CHOP后，si-CHOP+BCG組GSDMD-N蛋白表達(dá)較si-NC+BCG組顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖5A。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與si-NC組相比，si-NC+BCG組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；敲減CHOP后，si-CHOP+BCG組細(xì)胞活力顯著高于si-NC+BCG組（P＜0.01），見圖5B。免疫熒光染色結(jié)果顯示，si-NC+BCG組的GSDMD蛋白表達(dá)量極顯著高于si-NC組（P＜0.01），si-CHOP+BCG組GSDMD蛋白表達(dá)量顯著低于si-NC+BCG組（P＜0.01），見圖5C。

討 論

Figure 4.The protein levels of CHOP，NLRP3，ASC，pro-caspase-1，caspase-1 p20，IL-1β p17，and IL-18 p22 in THP-1 cells of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs si-NC+BCG group.圖4各組細(xì)胞中CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22蛋白的表達(dá)

結(jié)核病是一種由Mtb引起的慢性傳染病，由于傳染范圍廣、感染人數(shù)多以及死亡病例多的原因，使得結(jié)核病成為一個(gè)全球性健康問題。當(dāng)Mtb被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬，巨噬細(xì)胞通過清除細(xì)菌和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)阻止Mtb入侵巨噬細(xì)胞［4，15］。Mtb通過細(xì)胞表面Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）、核甘酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）、C型凝集素受體（C-type lectin receptor，CLR）、甘露糖受體（mannose receptor）受體及信號通路調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡、自噬及焦亡發(fā)生［16-18］。Mtb與巨噬細(xì)胞作用機(jī)制復(fù)雜，闡明結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞相互作用機(jī)制對于治療結(jié)核病具有重要意義。

細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式［19］。當(dāng)巨噬細(xì)胞內(nèi)模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）受到Mtb刺激后，促進(jìn)NLRP3炎癥小體的組裝，NLRP3炎癥小體進(jìn)一步激活caspase-1，切割GSDMD，使其成為有成孔活性的GSDMD-N，并導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，破壞細(xì)胞的完整性，引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓改變而最終腫脹、破裂［20］。有文獻(xiàn)報(bào)道，Mtb可通過激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號促進(jìn)巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以caspase-1/NLRP3/GSDMD依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡［21-22］；Mtb通過激活I(lǐng)L-1β的釋放引發(fā)細(xì)胞焦亡，促進(jìn)Mtb逃逸至鄰近細(xì)胞［23］。本研究中，Western blot結(jié)果顯示，BCG感染的THP-1細(xì)胞GSDMD-N蛋白表達(dá)水平隨感染時(shí)間逐漸上升，引起THP-1細(xì)胞焦亡，這與聶雪伊等［24］的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)Mtb感染可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡。

Figure 5.Pyroptosis of THP-1 cells infected with BCG after knockdown of CHOP.A：GSDMD-N protein expression in THP-1 cells of each group；B：the cell viability was determined by the CCK-8 assay；C：immunofluorescence of GSDMD protein in THP-1 cells（scale bar=100 μm）.GSDMD was labeled by green fluorescent antibody；blue fluorescence labeled nuclei.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs si-NC+BCG group.圖5敲減CHOP經(jīng)BCG感染的THP-1細(xì)胞焦亡檢測

當(dāng)Mtb感染巨噬細(xì)胞時(shí)，巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變可擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能則引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)活化會引發(fā)炎癥和細(xì)胞凋亡［25］。Mtb感染巨噬細(xì)胞能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子CHOP、ATF3、磷酸化真核起始因子2α（phosphorylated eukaryotic initiation factor 2α，p-eIF2α）及p-IRE1α在巨噬細(xì)胞中表達(dá)升高［26］，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡［27-28］。聶雪伊等研究表明，BCG感染可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并引起巨噬細(xì)胞焦亡［24］。Li等［29］的研究表明，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減弱了Mtb感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡。盡管已有研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在結(jié)核菌感染巨噬細(xì)胞焦亡中發(fā)揮調(diào)控作用，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3條信號通路各自在Mtb感染巨噬細(xì)胞焦亡中發(fā)揮怎樣的作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，BCG感染引起巨噬細(xì)胞焦亡和ATF6/CHOP信號通路激活，而在敲減ATF6和CHOP后，BCG感染的THP-1細(xì)胞焦亡水平下降，表明ATF6/CHOP信號通路參與調(diào)控BCG感染的THP-1細(xì)胞焦亡。

綜上所述，本研究首次證實(shí)ATF6-CHOP信號通路可以介導(dǎo)BCG感染的THP-1細(xì)胞焦亡，進(jìn)而發(fā)揮對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。本研究結(jié)果為結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制研究提供了參考資料。