吉雨恬，劉戀戀，劉嬌莉，張 淳，李開遠，郭立榮，曾俊偉，韓 勇

（遵義醫(yī)科大學生理學教研室，貴州 遵義 563000）

G蛋白偶聯受體（G-protein-coupled receptors，GPCRs）是已知人類基因組中最大的一類膜蛋白受體家族，包括A類視紫紅質樣受體、B類分泌素受體、C類代謝型谷氨酸受體、D類真菌交配信息素受體、E類環(huán)腺苷酸受體及F類卷曲受體（Frizzled/Smoothened家族）［1-2］。其中A類視紫紅質樣受體包含了GPCRs中大部分種類，共含有19個子類（A1～A19）719種，是目前臨床上大多數藥物作用的潛在靶點［3-4］。在A類視紫紅質樣受體家族中，目前已知197種受體存在明確的配體（不包括嗅覺、視覺、味覺及犁鼻器感覺受體），但87種受體目前尚不清楚其內源性配體，被稱為“孤兒（orphan）受體”，其中54種孤兒受體至少有一篇文獻報道了其可能的內源性配體［5］。探尋并鑒定孤兒GPCRs的內源性配體的研究即為GPCRs的去孤兒化（deorphanization）［6］，但由于大部分內源性配體的特性未知及相關工具藥物的缺乏，相關受體的去孤兒化研究受到較大限制。目前，鑒定內源性配體的研究策略主要有受體-配體綁定分析、受體內化激活分析、β-arrestin募集分析及環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）生成、鈣離子信號通路檢測等方法［6-7］。

G蛋白偶聯受體75（G-protein-coupled receptor 75，GPR75）被國際基礎與臨床藥理學聯合會列為孤兒受體之一［5］。在最近的研究中發(fā)現，GPR75可與CC基序趨化因子配體5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）或20-羥二十烷四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）交互作用［8-9］，與高血壓、神經退行性病變、腫瘤、肥胖相關代謝綜合征等疾病相關。

1 GPR75概述

1999年，Tarttelin等［10］在人類基因組中鑒定出Gpr75基因，它定位于人類染色體2p16區(qū)，可編碼分子量為59.4 kD、含有540個氨基酸的蛋白質，該蛋白具有典型的GPCRs特征，即7個跨膜結構域、位于N末端的N-糖基化位點及位于C末端的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點。后續(xù)研究證實GPR75屬于A類視紫紅質樣家族的Gαq蛋白偶聯受體，與秀麗隱桿線蟲神經肽Y受體（24%同源）、大鼠甘丙肽受體3（25%同源）和豬生長激素促分泌素1b型受體（25%同源）具有相關同源性［10-11］。早期的研究認為，GPR75主要在視網膜和中樞神經系統(tǒng)中表達，但其具體功能或者與相關疾病的關系不清楚，如Sauer等［12］研究未發(fā)現GPR75與視網膜相關疾病有密切關聯。后續(xù)研究證實，GPR75有廣泛的表達譜，在中樞神經系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)以及胰島、前列腺等組織、器官中表達［8-9］，且其功能以及與相關疾病聯系逐漸被揭示。

2 GPR75去孤兒化研究

2.1 GPR75與CCL5CCL5屬于CC類亞族的炎癥趨化因子，主要在T淋巴細胞和單核細胞中表達［13］。CCL5作為配體可與CC類趨化因子受體1（CC chemokine receptor 1，CCR1）、CCR3和CCR5結合，尤其與CCR5親和力最高［14］。CCL5/CCR5配對與細胞增殖、遷移以及血管生成相關，在炎癥、腫瘤發(fā)生、病毒感染等疾病中發(fā)揮重要作用［15-16］。

2006年，Ignatov等［8］報道CCL5可能與另外一種視紫紅質樣孤兒受體GPR75結合。該研究分別在過表達GPR75的HEK293細胞、內源性表達GPR75的小鼠海馬神經元HT22細胞以及CV-1細胞中，發(fā)現CCL5具有刺激細胞內IP3累積、Ca2+濃度增加以及激活蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路作用。而CCL5的上述效應可被磷酯酶C（phospholipase C，PLC）信號通路 抑 制劑U73122或者磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑渥曼青霉素所阻斷。Liu等［17］在小鼠及人類胰島的β細胞中觀察到，已知的CCL5受體CCR1、CCR3和CCR5的表達水平非常低，但卻顯著表達GPR75，當下調Gpr75表達后，可有效阻斷CCL5誘導的Ca2+增加和促胰島素分泌作用。Dedoni等［18］的研究發(fā)現，在神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中，分別 應用CCR1抑制劑BX471、CCR3抑 制 劑SB328437或者CCR5抑制劑DAPTA，不能阻斷CCL5所誘導的AKT、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）及細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的磷酸化。但敲減Gpr75表達后，卻可有效阻斷CCL5的上述效應。最近，在一項關于GPR54、GPR56和GPR75在胰腺β細胞功能調控中的作用研究中發(fā)現，CCL5作為GPR75配體參與刺激胰島素分泌和改善血糖穩(wěn)態(tài)，可促進MIN6胰腺β細胞胰島素分泌［19］。

CCL5與GPR75之間作用關系，目前僅有如上4項相關研究（表1）提出CCL5可能是孤兒受體GPR75內源性配體的觀點，但這些研究均未觀察CCL5與GPR75之間直接綁定或相互結合作用，并且Southern等［20］通過β-arrestin募集試驗篩選孤兒GPCRs天然配體的研究中，未能證實CCL5對GPR75的激活作用。

2.2 GPR75與20-HETE20-HETE是由細胞色素P450酶（Cytochrome P450，CYP450）家族中CYP4A/4F酶催化花生四烯酸代謝生成的血管活性物質［21］。近年在臨床以及動物模型研究中發(fā)現，20-HETE參與高血壓、腦卒中、缺血性心肌病、心力衰竭等心腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展［22-25］。研究證實，20-HETE存在結構類似物并且可拮抗20-HETE的生物學作用［26］，提示20-HETE作用受體的存在。但是，由于20-HETE具有較高的脂溶特性，會被快速酯化成磷脂，因而對于20-HETE是否綁定并結合膜受體蛋白繼而發(fā)揮生物學作用的研究進展緩慢。

2017年，Garcia等［9］在血管系統(tǒng)中發(fā)現GPR75表達，并鑒定出20-HETE可激活并綁定該受體，證實20-HETE以GPR75依賴機制誘導血管內皮功能紊亂及平滑肌細胞收縮。該研究發(fā)現，在血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）中，20-HETE具有激活GPR75作用，引起后者與其偶聯的Gαq蛋白解離，繼而激活PLC信號通路引起細胞內IP3生成；IP3生成不僅是GPCRs激活的標志物，并能通過蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）途徑以及肌漿網IP3受體門控通道誘發(fā)細胞內Ca2+濃度升高，從而增強VSMC收縮［9］。同樣，在血管內皮細胞中，20-HETE通過與GPR75配對機制，激活G蛋白偶聯受體激酶相互作用蛋白1（G-protein-coupled receptor kinase-interacting protein 1，GIT1），誘導表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）磷酸化，通過NF-κB信號通路引起血管緊張素轉換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）表達，導致內皮細胞功能紊亂［9］。另外，該研究中未觀察到CCL5處理后GPR75與Gαq蛋白解離現象，這與Southern等［20］發(fā)現CCL5不具有激活GPR75作用的報道相一致。

最近，包括本課題組在內的多項研究，證實了20-HETE/GPR75信號途徑在多種器官組織及相關疾病中發(fā)揮重要作用（表1）。Cárdenas等［27］在前列腺癌PC-3細胞中發(fā)現GPR75表達，且20-HETE處理后促進了EGFR、NFκB、AKT和p38的磷酸化；而沉默Gpr75表達，或應用一種水溶性的20-HETE受體拮抗劑——N-disodium succinate-20-hydroxyeicosa 6（Z），15（Z）-diencarboxamide（AAA）阻斷GPR75的作用，則可逆轉20-HETE的上述效應。Gilani等［28］在3T3-1分化的脂肪細胞中發(fā)現類似現象，觀察到AAA可阻斷20-HETE對胰島素受體Tyr972位點磷酸化的抑制作用。在最近的一項研究中，Pascale等［29］觀察了20-HETE、CCL5與GPR75之間的交互作用關系。一方面發(fā)現，CCL5雖然可誘導HTLA細胞和人內皮細胞內Ca2+濃度增加，但并非呈GPR75依賴性；反之，過表達GPR75后CCL5誘導的細胞內肌醇1-磷酸（inositol 1-phosphate，IP-1）的累積和Ca2+濃度呈下降趨勢；另一方面，使用CCL5處理后卻明顯抑制20-HETE誘導細胞內Ca2+濃度增加以及IP-1的積累，還阻斷了20-HETE誘導的β-arrestin募集增加［29］。如上結果提示，20-HETE、CCL5與GPR75具有不同的結合位點，20-HETE是GPR75的高親和力配體，而CCL5作為低親和性配體結合GPR75后，競爭性抑制20-HETE對GPR75的激活 作 用，因 此CCL5可能 是20-HETE/GPR75綁定的負性調控因子。

表1 GPR75的潛在配體及在疾病中作用Table 1.Putative ligands of G-protein-coupled receptor 75（GPR75）and its role in diseases

筆者所在實驗室在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞及大鼠H9c2心肌細胞中觀察到，GPR75在mRNA和蛋白水平表達，使用20-HETE處理后心肌細胞內IP3含量、Ca2+濃度及活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，同時PKC、NADPH氧化酶活性增強；敲減Gpr75表達或者阻斷PLC以及PKC信號通路，則可逆轉20-HETE如上效應［30-31］。這提示20-HETE/GPR75信號途徑在心臟生理、病理進程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，Ignatov等［8，17-19］認為GPR75是趨化因子受體CCR1、CCR3和CCR5之外CCL5的第4種受體，主要證據來自于CCL5誘導IP3累積和Ca2+濃度升高等作用，但這些研究均未開展二者之間直接綁定作用的研究，且不能被β-arrestin募集試驗所證實［20］。Garcia等［9，27-31］在不同組織器官中鑒定出一種新的GPR75可能配體——20-HETE，其中Pascale等［29］探討了CCL5和20-HETE與GPR75之間的作用關系，認為CCL5可能是20-HETE與GPR75相互作用的負性調控因子。雖然GPR75內源性配體的研究尚存爭議，但GPR75生物學功能及與相關疾病關系的研究得以逐步深入。

3 GPR75功能及與相關疾病關系

3.1 GPR75在神經系統(tǒng)中的作用GPR75首先被鑒定在腦、脊髓以及視網膜等部位表達，但初期研究并未發(fā)現其與相關神經系統(tǒng)疾病關聯［10-12］。Ignatov等［8］在對CCL5和GPR75配對的作用和機制研究中，發(fā)現GPR75介導了CCL5的神經保護功能。β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）在神經組織中的累積被認為具有較強的神經毒性作用，與阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）中神經元變性相關［32］。Ignatov等［8］發(fā)現在內源性表達GRP75的海馬神經元HT22細胞中，CCL5可有效抑制Aβ誘導的神經細胞凋亡，而過表達GPR75后增強了該效應。Dedoni等［18］在神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中研究發(fā)現，CCL5可 通 過GPR75誘 導Gαq蛋 白 下 游AKT和MAPK等蛋白磷酸化激活，這兩種蛋白激活具有抗凋亡和促神經細胞存活作用，這可能是GPR75發(fā)揮神經保護功能的分子機制。

與CCL5在神經系統(tǒng)中的作用不同，20-HETE被認為具有神經毒性作用，參與腦卒中、認知障礙和AD的發(fā)生、發(fā)展［33］。神經系統(tǒng)的活動增強需與局部血流的增加相匹配，被稱為神經血管偶聯（neurovascular coupling，NVC）［34］。在腦卒中患者的腦脊液和血漿中，20-HETE含量增加，導致卒中后腦血流量減少，不能滿足神經元活動增加后的能量需求，從而誘發(fā)NVC受損，抑制20-HETE生成可有效改善缺血后腦血管痙攣及梗死面積的增加［35-36］。最近Gonzalez-Fernandez等［37］進一步檢測了20-HETE合成酶——CYP4A與GPR75在大鼠腦組織中的表達關系。發(fā)現在腦的新皮層、內嗅皮層等多個部位同時表達CYP4A和GPR75，但星形膠質細胞中只表達CYP4A。此外，二者在腦血管的軟腦膜動脈、穿通小動脈的內皮細胞、VSMC以及周細胞中均有表達［37］，提示20-HETE可能以旁分泌方式通過GPR75介導，影響腦血管VSMC和周細胞功能。

3.2 GPR75對心血管系統(tǒng)功能的影響血管系統(tǒng)中，近年來在多種動物模型中觀察到GPR75參與高血壓發(fā)生、發(fā)展。如在Cyp4a12轉基因小鼠誘導的20-HETE依賴性高血壓的動物模型中，敲減Gpr75表達可有效降低多西環(huán)素處理的Cyp4a12小鼠血壓升高，同時降低ACE表達并明顯改善Cyp4a12轉基因小鼠血管內皮功能紊亂［9］。在另一種Cyp1a1-Ren-2轉基因大鼠誘導的血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）依賴性惡性高血壓動物模型中，應用20-HETE受體拮抗劑AAA阻斷GPR75作用，可有效逆轉3-吲哚甲醇處理后大鼠惡性高血壓的發(fā)生與發(fā)展，這與阻斷GPR75作用后減少血漿及腎臟中Ang II水平有關［38］。最近，Agostinucci等［39］構建了一種VSMC靶向過表達Cyp4a12轉基因小鼠，該動物模型特異性表現出VSMC收縮特性增強并呈20-HETE依賴性高血壓和血管功能障礙，應用AAA處理后同樣可有效降低動物血壓，并可改善由乙酰膽堿誘導的

血管舒張功能受損。Tunctan等［40］在膿毒癥休克大鼠模型中，發(fā)現20-HETE類似物——5，14-HEDGE，同樣具有激活GPR75作用，并可有效抑制脂多糖誘導的大鼠低血壓及心動過速反應，而使用AAA可逆轉5，14-HEDGE如上作用。這些研究初步揭示了GPR75參與高血壓的作用和機制，敲減GPR75表達或者阻斷其作用可有效發(fā)揮降低血壓作用，為臨床治療高血壓疾病提供了新的思路和動物實驗依據。

GPR75對心臟功能的影響研究較少。筆者所在實驗室報道了GPR75在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞及大鼠H9c2心肌細胞中表達，慢病毒敲減Gpr75表達或阻斷GPR75下游信號通路作用，可有效抑制20-HETE誘導的心肌細胞凋亡，這可能是20-HETE參與誘導缺血性心肌病重要受體機制，為拓展GPR75在心臟中的功能提供了新的線索［30-31］。但20-HETE在心臟中對GPR75的激活作用及其機制尚需進一步研究。

3.3 GPR75在代謝綜合征中作用GPR75的兩個潛在假定配體CCL5與20-HETE在代謝綜合征中均發(fā)揮重要作用。有研究報道，CCL5具有抑制葡萄糖刺激誘導胰高血糖素樣肽1和胰高血糖素樣肽2的分泌作用，從而導致小鼠葡萄糖依賴性的胰島素分泌受損［41］。此外，在超重和肥胖者血漿內CCL5水平顯著升高，與體重指數（body mass index，BMI）及體脂率呈正相關，且CCL5/CCR5信號通路的激活加劇肥胖發(fā)生和胰島素抵抗［42-43］。同樣，20-HETE也與BMI、高血糖和血漿胰島素水平呈正相關，是導致體重增加、升高空腹血糖水平和胰島素抵抗的重要因素［44］。最近，Gilani等［28］證實，GPR75的激活是20-HETE誘導肥胖相關糖尿病及胰島素分泌信號通路障礙的必要條件。

GPR75參與肥胖相關代謝綜合征的重要發(fā)現來自Akbari等［45-46］最近在《Science》的報道。該研究通過人類大規(guī)模外顯子組測序技術，對分別來自英國、美國和墨西哥共64.5萬名個體的外顯子組樣本進行測序，評估罕見基因編碼變異與BMI之間的相關性，共鑒定出16個與BMI高度相關的外顯子基因突變，包括5種在神經系統(tǒng)表達的GPCRs（CALCR、MC4R、GIPR、GPR151和GPR75）；在約4/10 000個測序個體中發(fā)現存在GPR75蛋白截斷突變（proteintruncating variants），這些個體的BMI平均降低1.8 kg/m2，體重降低5.3 kg，較非雜合子個體肥胖風險幾率降低54%［45］。為進一步確證GPR75在抑制肥胖發(fā)生中的作用，該研究在高脂飲食誘導的小鼠肥胖模型中發(fā)現，喂食14周后未處理小鼠體重增加1倍，而Gpr75基因缺失的雜合子（Gpr75+/-）小鼠體重較正常小鼠減輕25%，而Gpr75基因缺失的純合子（Gpr75-/-）小鼠體重減輕達到45%。此外，缺失1個或2個Gpr75基因拷貝的小鼠在對葡萄糖耐受性和胰島素敏感性方面也得到有效改善［45］。該研究通過遺傳學分析證據及動物實驗研究揭示了Gpr75基因在肥胖中的重要作用，提示抑制GPR75活性或研發(fā)靶向GPR75的基因沉默藥物、抗體或小分子調節(jié)劑，對于預防肥胖及治療代謝綜合征具有廣闊應用前景。

4 問題與展望

近年來，盡管GPR75的去孤兒化研究及對相關疾病的影響得到深入開展，但仍存在諸多問題尚待揭示。首先，GPR75的內源性天然配體研究尚存爭議，目前國際基礎與臨床藥理學聯合會仍將GPR75列為孤兒受體［5］?；谀壳暗难芯浚贕PR75的2個潛在假定配體中，20-HETE與GPR75的親和力要高于CCL5，Pascale等［29］認為CCL5可作為負性調控因子影響20-HETE與GPR75的綁定結合。因此，尚需在更多的組織器官中深入研究GPR75、20-HETE和CCL5之間是否存在類似的交互作用關系。其次，作為GPR75可能的配體，20-HETE/GPR75配對機制也需在其他組織、器官中進一步確認。如心臟是20-HETE發(fā)揮生理、病理作用的重要器官，但目前尚待明確GPR75在20-HETE誘導的心肌損傷中的重要作用，尤其是20-HETE對GPR75激活的機制還不清楚。此外，尚不能確定GPR75是否是20-HETE的唯一受體。目前的研究證據顯示，在各組織器官中可能存在不同的GPR75亞型，或者表達其他可以與20-HETE結合的受體。如以往的研究證實20-HETE在腎臟近曲小管及髓袢升支粗段具有抑制Na+轉運作用，通過促進鈉尿排泄從而在血壓調節(jié)中發(fā)揮作用［47］。但是Garcia等［9］在腎臟組織中，并未發(fā)現GPR75表達，提示GPR75可能在不同組織中存在多種亞型或剪接變異體，或者GPR75可能并不是20-HETE的唯一受體。實際上，Trauelsen等［48］最近研究報道，20-HETE可通過激活另一種受體——游離脂肪酸受體1而發(fā)揮促胰島素分泌作用。

雖然GPR75配體及生物學功能尚存諸多值得深入探究的科學問題，但GPR75已展現出在高血壓、心腦血管疾病、神經系統(tǒng)疾病，尤其在肥胖相關代謝綜合征中發(fā)揮重要作用。因此，作為典型的GPCRs，GPR75有望成為新的可高度藥物化的靶點，研發(fā)靶向GPR75的激動劑或拮抗劑藥物是未來可能取得突破的領域。事實上，近期阿斯利康（AstraZeneca）和再生元（Regeneron）公司已經開始合作研發(fā)靶向Gpr75基因沉默藥物、抗體或小分子調節(jié)劑，以期預防肥胖及治療與其相關的共病。不僅如此，GPR75有望成為新的治療血脂異常、糖尿病、心腦血管疾病、神經系統(tǒng)疾病的藥物作用靶點。