曾偉蘭 李璟 汪艷

細(xì)胞游離DNA通常指外周循環(huán)血中所有未被包裹的無(wú)細(xì)胞DNA (cfDNA)，其來(lái)源被認(rèn)為是主要自凋亡或壞死細(xì)胞釋出，還有一些自正常細(xì)胞生理性釋出，而進(jìn)入循環(huán)血的DNA片段[1]。 典型cfDNA為長(zhǎng)度小于200堿基對(duì)(bp)、平均長(zhǎng)度約169 bp的DNA雙鏈片段。cfDNA不僅可以從外周血中檢測(cè)，一些研究還從尿液、糞便、腦脊液、唾液、胸水和腹水中分離和分析cfDNA。近期發(fā)現(xiàn)DNA核酸酶和DNA片段化因子等參與了胞內(nèi)cfDNA形成，但其中詳細(xì)的生成和釋出機(jī)制還未全面揭示[2]。通常吞噬細(xì)胞會(huì)迅速清理這些釋出片段，使得健康人體生理狀態(tài)下血漿中cfDNA平均濃度約在10～15 ng/mL，這些cfDNA大部分來(lái)自造血細(xì)胞，微量來(lái)自肝臟[3]。 當(dāng)某組織細(xì)胞來(lái)源cfDNA異常大量出現(xiàn)超出吞噬能力時(shí)，會(huì)以不同堿基片段長(zhǎng)度及其不同濃度顯著出現(xiàn)在循環(huán)血中，并且這些指標(biāo)的變化范圍比較大。cfDNA是液體活檢研究領(lǐng)域的重要組成部分，其臨床應(yīng)用實(shí)踐目前主要在產(chǎn)前診斷和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域。

由于無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)本身在篩查、早診、隨訪、預(yù)后判斷等方面具有比較明確的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，cfDNA作為一種理論上可以反映組織學(xué)損傷及其原位機(jī)制信息的無(wú)創(chuàng)指標(biāo)，已有大量研究工作對(duì)其生物學(xué)功能相關(guān)特征進(jìn)行探索。其中，關(guān)于cfDNA片段分布特征的分析研究，如片段長(zhǎng)度及其頻率譜，被稱為cfDNA片段組學(xué)。隨著序列分析能力尤其是測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)的飛速進(jìn)步和完善豐富， cfDNA片段組學(xué)的指標(biāo)和解讀內(nèi)容相應(yīng)增加，如末端基序、首選末端、核小體印跡、鋸齒末端、DNA 拓?fù)鋵W(xué)、遺傳和表觀遺傳學(xué)信息等，顯示出可以為相關(guān)領(lǐng)域疾病診斷甚至治療決策提供新標(biāo)志物的應(yīng)用潛力[4-5]。這些研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)cfDNA片段組學(xué)特征并非是隨機(jī)性的，組織細(xì)胞來(lái)源、疾病進(jìn)展階段、年齡、DNA核酸酶活性，以及序列分析技術(shù)等都是影響cfDNA片段組學(xué)特征的重要因素[6- 7]。還有一些共性發(fā)現(xiàn)如，腫瘤細(xì)胞來(lái)源cfDNA較非腫瘤來(lái)源cfDNA的堿基數(shù)量小，胎兒來(lái)源cfDNA較母體來(lái)源cfDNA也存在此特點(diǎn)。

cfDNA應(yīng)用研究在肝病領(lǐng)域已涉及多種肝病。目前報(bào)道最多的是關(guān)于在肝腫瘤診療預(yù)后等方面的判斷能力以及對(duì)肝轉(zhuǎn)移癌的診斷分析等，常見(jiàn)的判斷指標(biāo)包括各類突變類型和分布、拷貝數(shù)、甲基化特征、首選末端基序、線粒體DNA突變等，以體現(xiàn)腫瘤組織DNA變異特點(diǎn)為其理想表現(xiàn)[8]。 但是，基于序列突變和修飾現(xiàn)象本身的變異性大、含量甚微，意味著準(zhǔn)確測(cè)量的技術(shù)挑戰(zhàn)比較大，因此研究者又嘗試應(yīng)用cfDNA片段組學(xué)信息，如鋸齒末端[6- 9]， 進(jìn)行分析評(píng)估。最近一項(xiàng)前瞻性單中心研究采用全基因組測(cè)序技術(shù)，對(duì)來(lái)自192例原發(fā)性肝癌和170例無(wú)腫瘤對(duì)照組患者血漿的cfDNA片段長(zhǎng)度及其數(shù)量進(jìn)行測(cè)量，然后將這些數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為片段長(zhǎng)度比率和片段分布率兩類指標(biāo)，以這兩類指標(biāo)數(shù)據(jù)作為輸入變量、以該隊(duì)列診斷結(jié)果為輸出變量，用機(jī)器學(xué)習(xí)工具進(jìn)行建模，再將此模型用于另一個(gè)分布情況類似的、含189例原發(fā)性肝癌和165例無(wú)腫瘤對(duì)照組的獨(dú)立隊(duì)列進(jìn)行診斷能力測(cè)試，發(fā)現(xiàn)該模型在肝癌檢出方面的總體判斷表現(xiàn)很好(觀察者曲線下面積 0.995，敏感性 96.8%，特異性98.8%)，尤其對(duì)早期原發(fā)性肝癌(在該研究隊(duì)列總?cè)藬?shù)比率占70.3%～74.1%)、不大于3 cm的小腫瘤，肝細(xì)胞癌或膽管癌的敏感性很高(95.9%～100%)[10]。 總之，盡管采用各種cfDNA指標(biāo)的肝腫瘤診斷方法紛紛呈現(xiàn)，不少甚至有突出結(jié)果，但至今就cfDNA輔助診斷對(duì)這類患者長(zhǎng)期預(yù)后的影響仍未有確切報(bào)告。cfDNA在早期診斷肝移植相關(guān)肝損傷的應(yīng)用研究也有不少研究探索。近期一些研究提出，供體來(lái)源 cfDNA 濃度持續(xù)增加可能有助于更加早期地判斷急性排斥反應(yīng)發(fā)生，并用于分辨移植肝急性失功是否主要源于排斥反應(yīng)[11-12]； 但同期也另有研究顯示，這些指標(biāo)預(yù)測(cè)能力的可靠性也許比較有限[13]。

與肝腫瘤和肝移植方面的應(yīng)用研究相比，cfDNA在慢性肝炎性肝病中的指標(biāo)意義還存在較多未知。非酒精性脂肪性肝病/肝炎(NAFLD/NASH)已成為全球主要常見(jiàn)肝病。有研究回顧性分析了58例NAFLD患者和13例健康者的血樣，采用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量發(fā)現(xiàn)NAFLD組的90 bp cfDNA水平顯著高于健康組，NAFLD組中的90 bp和222 bp兩種cfDNA濃度變化都與該組患者的疾病活動(dòng)度和疾病程度顯著相關(guān)[14]。另一項(xiàng)研究對(duì)49例疾病進(jìn)展情況包括了從NAFL到肝硬化的NAFLD患者進(jìn)行了血漿cfDNA分析，指標(biāo)包括總cfDNA、編碼cfDNA、Alu重復(fù)序列、線粒體DNA拷貝和5甲基2‘脫氧胞苷的濃度水平；發(fā)現(xiàn)肝硬化較非肝硬化患者的總cfDNA水平和編碼cfDNA水平顯著降低，而5甲基2‘脫氧胞苷水平顯著增高；且肝硬化與低水平總cfDNA和編碼cfDNA之間存在獨(dú)立相關(guān)性[15]。有研究對(duì)52例肝硬化急性失代償、57例入院診斷為慢加急性肝衰竭，以及40例健康對(duì)照進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)血漿中總cfDNA水平在慢加急性肝衰竭患者高于肝硬化急性失代償患者，器官衰竭病情嚴(yán)重或入院后30 d內(nèi)死亡的患者中的總cfDNA水平也較高[16]。 還有研究在對(duì)乙酰氨基酚過(guò)量引起急性肝損傷的小鼠模型和患者的血漿中，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞來(lái)源cfDNA濃度會(huì)大幅增加，該指標(biāo)會(huì)隨著治療情況變化，較常規(guī)生化指標(biāo)變化似乎更敏感[17]。 近期一項(xiàng)基于cf核小體測(cè)序策略的探索性技術(shù)研究初步顯示，通過(guò)進(jìn)一步獲取其中轉(zhuǎn)錄組信息，可以辨識(shí)不同病因?qū)W的慢性肝病包括NAFLD、NASH、自身免疫性肝炎、肝移植、心源性肝損傷、部分肝切除等，甚至可以分辨出肝損傷分布的主要組織區(qū)帶[18]。這類新技術(shù)也許可以進(jìn)一步提高cfDNA在慢性肝炎性肝病中的應(yīng)用潛力。

盡管近十年來(lái)不少概念驗(yàn)證性研究提示，與臨床上傳統(tǒng)使用的有創(chuàng)指標(biāo)和基于血液分析的無(wú)創(chuàng)診斷指標(biāo)相比，cfDNA檢測(cè)在特定疾病診療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但cfDNA在研究廣泛性和應(yīng)用普及性方面仍未見(jiàn)顯著突破，對(duì)于大多數(shù)臨床條件，技術(shù)實(shí)施和分析能力仍是阻礙cfDNA應(yīng)用推廣與普及的主要原因[19]。血樣中目標(biāo)cfDNA的濃度極低且易降解是技術(shù)實(shí)踐困難的主要根源之一[20]。因此在每個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)需要詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)并嚴(yán)格實(shí)行[7, 20]：為盡可能減少血液細(xì)胞釋放非目標(biāo)cfDNA對(duì)目標(biāo)cfDNA造成污染，需避免樣本發(fā)生溶血，發(fā)生溶血的樣本不適于用于cfDNA分析。通常條件下靜脈采血后應(yīng)在1～4 h內(nèi)分離出血漿。如果使用含有對(duì)血細(xì)胞有穩(wěn)定作用添加劑的特殊采血管，樣本放存期限可以增加至7 d以上。通常應(yīng)至少依次進(jìn)行低速(如3000× g)和高速(如30 000 ×g)兩次離心除血細(xì)胞和游離長(zhǎng)鏈DNA片段。分裝后-80 ℃凍存兩周內(nèi)使用對(duì)cfDNA的影響最小。如使用專門提取cfDNA的商業(yè)化試劑盒可以在保留短片段DNA方面有所改進(jìn)。血樣處理具體流程(如待處理時(shí)間、離心、溫度等因素條件)不同可能會(huì)引起不同分析結(jié)果的產(chǎn)生。就此值得一提的是，盡管不少cfDNA應(yīng)用研發(fā)報(bào)道展示了突出的診斷能力，但其中技術(shù)流程的精確性、重復(fù)性等質(zhì)控基礎(chǔ)是否充分以及是否具有可普及性，相較其數(shù)據(jù)結(jié)果，在報(bào)告中常常沒(méi)有受到應(yīng)有的突顯。另外，在獲取cfDNA之后應(yīng)采取何種分析或測(cè)序技術(shù)、何種測(cè)量指標(biāo)，如何解讀指標(biāo)結(jié)果，如何獲得臨床最優(yōu)模型，這些也超出了臨床醫(yī)學(xué)目前專業(yè)教育的常規(guī)范圍，跨學(xué)科交叉技能是日常實(shí)現(xiàn)cfDNA檢測(cè)分析的必備基礎(chǔ)條件。此外，除了實(shí)驗(yàn)室技術(shù)環(huán)節(jié)，研究設(shè)計(jì)也往往影響有關(guān)發(fā)現(xiàn)的實(shí)際臨床價(jià)值，如肝癌通常發(fā)生于當(dāng)?shù)囟喟l(fā)慢性肝病肝硬化或嚴(yán)重肝纖維化階段，因此在評(píng)估肝癌識(shí)別指標(biāo)時(shí)，應(yīng)將這些臨床情況對(duì)應(yīng)設(shè)計(jì)在對(duì)照隊(duì)列中，而非僅考慮將健康者作為研究對(duì)照，或?qū)φ贞?duì)列中大部分為健康者。從目前來(lái)看，本領(lǐng)域還需要更多在技術(shù)嚴(yán)謹(jǐn)性和臨床設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)性雙方面高質(zhì)量的研究報(bào)道。