王 娜, 張中華, 周華坤, 徐文華*

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所， 青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青海 西寧 810008； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

莎草科植物(Cyperaceae)是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要構(gòu)成者，具有水土保持、土壤改良、水源凈化等作用，也是青藏高原東部高寒草甸天然草地資源中飼用價(jià)值高、家畜喜食、耐牧性極強(qiáng)的一類(lèi)優(yōu)良牧草，是高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)中分布最為廣泛、數(shù)量最多的科屬。莎草科植物適應(yīng)性好，生境廣闊，具有很高的潛在價(jià)值，部分植物種是高寒草甸的建群種，其良好生長(zhǎng)對(duì)高寒草甸植被恢復(fù)以及生態(tài)系統(tǒng)維持具有重要的現(xiàn)實(shí)意義及生態(tài)學(xué)價(jià)值。但莎草科植物種子普遍具有休眠、萌發(fā)困難的特性，嚴(yán)重制約了對(duì)其的開(kāi)發(fā)利用。

種子的休眠與發(fā)芽特性因種而異，因此不同種子應(yīng)選擇適宜其本身的方法來(lái)破除休眠，提高發(fā)芽率。目前對(duì)莎草科植物種子休眠與萌發(fā)特性的研究已取得了一定的進(jìn)展，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)變溫和光暗交替有利于苔草屬種子的萌發(fā)[1]，但是也有研究發(fā)現(xiàn)光照不影響莎草科植物種子萌發(fā)，甚至莎草科植物種子在自然光照梯度下幾乎不會(huì)萌發(fā)[2]。關(guān)于光照對(duì)莎草科植物種子萌發(fā)的影響還存在爭(zhēng)議，部分種子之間存在物種特異性[1]。激素和化學(xué)試劑處理已被證實(shí)是對(duì)莎草科植物種子萌發(fā)有利的技術(shù)[3]，除此以外，低溫層積打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)的技術(shù)已經(jīng)在多數(shù)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證[4-5]，而且低溫層積對(duì)嵩草屬和薹草屬種子的發(fā)芽率、初始發(fā)芽天數(shù)和發(fā)芽指數(shù)的影響因種皮的完整性、層積基質(zhì)和草種不同而異[5]。

由于青藏高原高寒草甸地理環(huán)境特殊，探索該區(qū)種子休眠具有重要的生態(tài)學(xué)意義[6-8]。但是迄今為止，對(duì)于青藏高原莎草科植物種子萌發(fā)特性的研究方法較為單一，萌發(fā)技術(shù)研究的廣度、深度還不夠，對(duì)于高寒草甸這一特殊生境的研究更是鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)不同物理和化學(xué)方法處理、化學(xué)處理+冷層積綜合處理，并且結(jié)合掃描電鏡觀測(cè)方法探索化學(xué)試劑處理對(duì)種子表皮的影響，試圖探討不同莎草科種子的適宜萌發(fā)溫度和光照條件，試驗(yàn)處理對(duì)不同莎草科種子萌發(fā)的影響以及不同莎草科種子的休眠影響因素，從而尋求快速有效提高莎草科植物種子發(fā)芽率的方法，降低栽培草地建植成本，為青藏高原地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)和畜牧業(yè)發(fā)展提供理論支持和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試草種青藏薹草(Carexmoorcroftii)(以下簡(jiǎn)稱QZ)、帕米爾薹草(Carexpamirensis)(以下簡(jiǎn)稱PME)、華扁穗草(Blysmussinocompressus)(以下簡(jiǎn)稱HB)的種子采集于海北高寒草地生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站(青海省海北藏族自治州門(mén)源回族自治縣境內(nèi))。采集地生境：海拔多在3 400～3 450 m之間，地處37°29′～ 37°45′ N，101°12′～101°23′ E；年平均氣溫-1.7℃；最熱月7月平均氣溫10.1℃，最冷月1月平均氣溫-15.2℃。年降水量平均為582.1 mm，其中約80%降水量分布于植物生長(zhǎng)季的5 — 9月；11月—次年2月降水量?jī)H占年降水量的4%[9-10]。種子采集裝袋后帶回實(shí)驗(yàn)室陰干(在此期間其果皮和種皮未受到影響)，后置于牛皮紙信封中于室溫通風(fēng)良好的條件下貯藏備用。供試的莎草科植物種子基本信息如表1所示。

表1 供試莎草科植物種子信息Table 1 Information of tested cyperaceae species seeds

試驗(yàn)所用試劑：NaOH (AR,96%)、H2SO4(AR,98%)、NaHClO (60%)、戊二醛固定液(4%)、磷酸緩沖液(0.2 M,pH 3.5)、丙酮(AR,99.5%)、乙酸異戊酯(AR,99%,2.5 L)。

1.2 方法

1.2.1種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn) 萌發(fā)試驗(yàn)開(kāi)始于2022年1月底，采用培養(yǎng)皿內(nèi)紙上萌發(fā)法，試驗(yàn)開(kāi)始前，所有種子用0.1% KMnO4溶液浸泡消毒10 min，再用蒸餾水沖洗3次，用濾紙吸干種子表面水分后在直徑為9 cm的圓形培養(yǎng)皿中放置2層用無(wú)菌蒸餾水潤(rùn)濕的濾紙作為發(fā)芽床，將種子輕放于發(fā)芽床上，加蓋后放置在培養(yǎng)箱里，每個(gè)培養(yǎng)皿放置50粒顆粒飽滿的種子，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在整個(gè)試驗(yàn)持續(xù)期間保持濾紙濕潤(rùn)，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)。以露白為種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算各種子的發(fā)芽率、萌發(fā)時(shí)滯天數(shù)。

萌發(fā)時(shí)滯：指從發(fā)芽試驗(yàn)開(kāi)始到第1粒種子萌發(fā)所用時(shí)間。

發(fā)芽率=試驗(yàn)結(jié)束時(shí)已萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。

1.2.2溫度與光照處理 根據(jù)種子采集地的氣溫設(shè)置了8個(gè)不同的溫度處理(包括5個(gè)恒溫和3個(gè)變溫)和2種光照條件，共計(jì)16類(lèi)處理，具體設(shè)置見(jiàn)表2。

以上每種處理組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)個(gè)數(shù)，試驗(yàn)持續(xù)30天。

1.2.3冷層積處理 根據(jù)種子采集地的氣溫本研究確定了4℃的層積溫度。每種種子設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子，分別置于培養(yǎng)皿中，加入無(wú)菌蒸餾水至剛好淹沒(méi)種子，用封口膜密封，于4℃冰箱中分別層積放置30天、60天、90天。每隔5天翻動(dòng)檢查并沖洗換水1次，保持種子濕潤(rùn)。以室溫條件下干燥貯藏未經(jīng)層積處理的種子作為對(duì)照，以溫度試驗(yàn)的結(jié)果選取萌發(fā)率適中的溫度條件作為層積處理后的培養(yǎng)條件，所以將層積處理完成的培養(yǎng)皿隨機(jī)置于設(shè)置為B25(15℃/25℃)溫度條件的培養(yǎng)箱內(nèi)，光照條件設(shè)置為光照條件1(表2)下進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，以上處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)個(gè)數(shù)并補(bǔ)充水分，持續(xù)30 d。以露白為種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4化學(xué)試劑處理及化學(xué)試劑+冷層積處理 根據(jù)查詢到的關(guān)于莎草科植物種子萌發(fā)文獻(xiàn)資料中所用的萌發(fā)率較好的3種化學(xué)試劑和濃度處理方式對(duì)3種莎草科植物種子進(jìn)行分別處理。

(1)用40%的氫氧化鈉(NaOH)溶液浸種30 min[11-13]；

(2)用49%的硫酸(H2SO4)溶液浸種10 min[13-14]；

(3)用10%的次氯酸鈉(NaHClO)溶液浸種1 h[15]。

試劑處理后的種子都用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗后，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同樣的將B25溫度條件設(shè)置為試劑處理后的萌發(fā)溫度，置于光照條件1中(表2)進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，定期更換濾紙，及時(shí)處理發(fā)霉的種子，對(duì)照選取為同溫度下未經(jīng)任何處理的種子。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)個(gè)數(shù)，持續(xù)30天。以露白為種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)。

同時(shí)，對(duì)經(jīng)化學(xué)試劑處理后的種子用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗后，再置于4℃冰箱中冷層積處理1個(gè)月，期間每隔5 d翻動(dòng)檢查并沖洗1次，保持種子濕潤(rùn)，然后放置在B25、光照條件1(表2)的培養(yǎng)箱條件下進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)個(gè)數(shù)，持續(xù)30天。

1.2.5掃描電子顯微鏡觀察 選取上述供試種子及不同化學(xué)試劑處理后種子各20枚，置于解剖鏡下橫切或縱切，裝入青霉素小瓶，貼好標(biāo)簽，然后將種子置于濃度4%的戊二醛中固定12 h，再用pH值為6.8的磷酸緩沖液沖洗5次，每次15 min，之后分別用30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%丙酮梯度脫水，其中30%～95%濃度的丙酮只脫水一次，時(shí)間為20 min，而100 %濃度的丙酮進(jìn)行脫水3次，每次30 min，脫水后用乙酸異戊酯置換2次，每次20 min，然后用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀(IXRF VFD-21 s)干燥，最后粘臺(tái)，放置在掃描電鏡(SU8010)下觀察種皮、胚、胚乳及種子橫、縱切面結(jié)構(gòu)并拍照。

用掃描電鏡觀察不同化學(xué)試劑處理對(duì)種皮的影響，結(jié)合發(fā)芽率試驗(yàn)探究不同化學(xué)試劑處理對(duì)莎草科植物種子發(fā)芽的影響。

1.2.6數(shù)據(jù)處理 本文的所有數(shù)據(jù)在R語(yǔ)言(Version 4.1.1，R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria)統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行分析。首先對(duì)所有數(shù)據(jù)在分析前均進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)分布和levene’s方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換；若轉(zhuǎn)換后不符合正態(tài)檢驗(yàn)，則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行kruskal非參數(shù)檢驗(yàn)和Behrens-Fisher事后多重比較，對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。然后Tukey’s HSD用于檢驗(yàn)處理間多重比較的差異顯著性。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示。采用Origin (Version 2018C SR,OriginLab Corporation,Northampton,MA,USA)軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度和光照對(duì)種子萌發(fā)的影響

不同種子的萌發(fā)率受溫度和光照影響不同，其中華扁穗草(HB)種子萌發(fā)率受到溫度和光照的顯著影響(P<0.05)，萌發(fā)時(shí)滯僅受到溫度的顯著影響(P<0.05)。帕米爾薹草(PME)種子的萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)滯僅受到溫度的顯著影響(P<0.05)，而青藏薹草(QZ)在不同溫度和光照處理中沒(méi)有萌發(fā)(表3)。

表3 不同溫度和光照對(duì)3種莎草科植物種子萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)滯的影響Table 3 Effects of different temperatures and light intensities on seed germination rate and germination delay of three cyperaceae plants

具體在每個(gè)溫度梯度上，有晝夜交替的光照條件下(表4)，華扁穗草(HB)種子的最高萌發(fā)率為52.67%，出現(xiàn)在B25 (15℃/25℃)處理中，而隨著變溫溫度的升高，種子的萌發(fā)率逐漸降低，最低達(dá)到B35 (15℃/35℃)處理下的3.33%，顯著低于B25溫度處理的種子萌發(fā)率(P<0.05)；帕米爾薹草(PME)種子萌發(fā)率隨著變溫溫度的升高，呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，萌發(fā)率在B30(15℃/30℃)處理中最高，為56.67%。而且這兩種種子在變溫處理中的萌發(fā)率均好于在恒溫處理中的萌發(fā)率。在24 h全黑暗的溫度處理中，HB種子僅在B35處理下有少量萌發(fā)，萌發(fā)率僅為1.33%，與晝夜交替光照條件下的萌發(fā)率差距明顯(P<0.05)；PME種子的萌發(fā)率在全黑暗下與晝夜交替光照下沒(méi)有明顯差距，甚至略有上升，同樣表現(xiàn)為變溫條件下比恒溫條件下的萌發(fā)率高、隨著變溫梯度萌發(fā)率先上升后下降的變化趨勢(shì)。

表4 溫度和光照對(duì)種子萌發(fā)率的影響Table 4 Effects of temperature and light on seed germination rate

萌發(fā)時(shí)滯的變化與萌發(fā)率的變化情況類(lèi)似(表5)。HB種子萌發(fā)時(shí)滯隨著變溫幅度增加顯著增加(P<0.05)，恒溫條件下萌發(fā)時(shí)滯高于變溫條件。而PME種子無(wú)論在晝夜交替光照條件還是全黑暗條件下，隨著變溫溫度升高，均有萌發(fā)時(shí)滯天數(shù)先減少后增加的趨勢(shì)，盡管恒溫條件中出現(xiàn)了最短的萌發(fā)時(shí)滯，但萌發(fā)率并不高。

表5 溫度和光照對(duì)種子萌發(fā)時(shí)滯的影響Table 5 Effects of temperature and light on the time delay of seed germination 單位：d

通過(guò)數(shù)據(jù)分析，我們認(rèn)為光照對(duì)HB種子的萌發(fā)是必需的，說(shuō)明HB為喜光性種子；光照對(duì)PME種子的萌發(fā)幾乎沒(méi)有影響，說(shuō)明PME種子為光不敏感性種子。對(duì)于HB和PME，變溫下的物種萌發(fā)率顯著高于恒溫下的萌發(fā)率(P<0.05)，變溫下HB種子的萌發(fā)率最高達(dá)到52.67% (B25、光照)，PME種子的萌發(fā)率最高達(dá)到56.67%(B30、光照)，恒溫處理下普遍較低甚至為0，說(shuō)明變溫處理更適合HB和PME種子的萌發(fā)。

2.2 冷層積處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

本研究對(duì)3種莎草科植物種子施加了3種冷層積梯度(冷層積30天、60天、90天)處理，結(jié)果表明(表6、圖1)，HB種子和PME種子萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)滯均顯著受冷層積時(shí)間的影響(P<0.05)；青藏薹草(QZ)種子僅在層積時(shí)間90天有所萌發(fā)。

表6 冷層積時(shí)間對(duì)3種莎草科植物種子萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)滯的影響Table 6 Effects of stratification on seed germination rate and germination delay days of three cyperaceae species

圖1 層積對(duì)種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of stratification on seed germination注:不同小寫(xiě)字母表示同一物種層積不同時(shí)間萌發(fā)率之間存在顯著差異(P<0.05)。CJ30代表冷層積30天；CJ60代表冷層積60天；CJ90代表冷層積90天Note:Different lowercase letters indicate significant differences in germination rates at different stratification times for the same species (P<0.05). CJ30 represents cold stratification 30 days;CJ60 represents cold stratification 60 days;CJ90 represents cold stratification 90 days

所有種子在冷層積處理之后置于15℃/25℃的溫度培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，如圖1所示，與對(duì)照組相比，華扁穗草(HB)種子經(jīng)冷層積處理30天后萌發(fā)率顯著提高到81.33%(P<0.05)；冷層積處理60天、90天的萌發(fā)率相同，而且顯著高于對(duì)照組的萌發(fā)率(P<0.05)，但是并沒(méi)有與冷層積處理30天的萌發(fā)率有顯著差異。與對(duì)照組相比，帕米爾薹草(PME)種子經(jīng)冷層積處理30天后萌發(fā)率反而顯著降低了(P<0.05)，而冷層積處理60天、90天的萌發(fā)率比對(duì)照組萌發(fā)率有所提高但差異并未達(dá)到顯著性。另外，隨著冷層積時(shí)間延長(zhǎng)，PME種子萌發(fā)率顯著提高(P<0.05)，冷層積處理30天、60天、90天后的萌發(fā)率分別達(dá)到17.33%，48.00%和58.67%。

HB種子經(jīng)冷層積處理60天時(shí)萌發(fā)時(shí)滯最小，為5天，與冷層積處理90天的萌發(fā)時(shí)滯沒(méi)有顯著性差異，但是與對(duì)照組及冷層積處理30天的萌發(fā)時(shí)滯均存在顯著性差異(P<0.05)。PME種子經(jīng)冷層積處理90天的萌發(fā)時(shí)滯最小，為7天，與對(duì)照組的萌發(fā)時(shí)滯有顯著性差異(P<0.05)。青藏薹草(QZ)只有在冷層積90天處理下有少量種子萌發(fā)，萌發(fā)率為1.33%，萌發(fā)時(shí)滯為9天。

通過(guò)數(shù)據(jù)分析表明：與對(duì)照組相比，冷層積處理能顯著提高HB種子的萌發(fā)率(P<0.05)，使萌發(fā)率最高達(dá)到90%(冷層積60天、90天處理)，并降低其萌發(fā)時(shí)滯，使發(fā)芽時(shí)間提前到了5天(冷層積60天處理)；冷層積處理使PME種子的萌發(fā)率最高達(dá)到58.67%(冷層積90天處理)，同時(shí)使發(fā)芽時(shí)間提前到了7天。

2.3 化學(xué)試劑處理及化學(xué)試劑+冷層積處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

本研究對(duì)3種莎草科植物種子進(jìn)行了三種化學(xué)試劑處理及化學(xué)試劑處理后冷層積30天的處理。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)(表7、表8)，化學(xué)試劑僅對(duì)HB種子萌發(fā)率有顯著影響(P<0.05)，對(duì)PME和QZ種子萌發(fā)率的影響未達(dá)到顯著水平，對(duì)三種種子的萌發(fā)時(shí)滯均沒(méi)有顯著影響。化學(xué)試劑+冷層積處理對(duì)HB種子的萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)滯影響顯著(P<0.05)，僅對(duì)PME種子的萌發(fā)率有顯著影響(P<0.05)，對(duì)QZ種子萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)滯沒(méi)有顯著影響。

表8 化學(xué)試劑+冷層積處理對(duì)3種莎草科植物種子萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)滯的影響Table 8 Effects of chemicals + cold stratification on seed germination rate and germination delay days of three cyperaceae species

如圖2A所示，華扁穗草(HB)種子在H2SO4+冷層積綜合處理后的萌發(fā)率由僅用H2SO4處理后 21.33%提高到了92.67%(P<0.05)，與對(duì)照組52.67%的萌發(fā)率相比也有顯著性差異(P<0.05)，但是與僅通過(guò)冷層積處理30天后81.33%的萌發(fā)率沒(méi)有顯著差異；NaOH +冷層積綜合處理后的萌發(fā)率達(dá)到96.00%，比僅用NaOH處理后12.00%的萌發(fā)率提高了近7.00倍(P<0.05)，與對(duì)照組52.67%的萌發(fā)率相比也有顯著性差異(P<0.05)，但是與僅冷層積處理30天后81.33%的萌發(fā)率沒(méi)有顯著差異；NaHClO +冷層積綜合處理后的萌發(fā)率為83.33%，比僅用NaHClO處理后20.00%的萌發(fā)率提高了3.16倍(P<0.05)，與對(duì)照組的萌發(fā)率相比顯著提高(P<0.05)，但與僅冷層積處理30天后的萌發(fā)率沒(méi)有顯著性差異；如圖2B所示，H2SO4+冷層積綜合處理和NaOH +冷層積綜合處理后的萌發(fā)時(shí)滯最低，均為3天，與對(duì)照組的萌發(fā)時(shí)滯(10天)和僅冷層積30天處理后的萌發(fā)時(shí)滯(9天)相比均有顯著性差異。

圖2 化學(xué)試劑處理及化學(xué)試劑+冷層積處理對(duì)種子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of different chemicals and chemicals + stratification on seed germination注：不同小寫(xiě)字母表示同一物種不同處理之間萌發(fā)率或萌發(fā)時(shí)滯存在顯著差異(P<0.05)。CK代表對(duì)照組；CJ30代表冷層積30天；H2SO4 + CJ代表H2SO4處理后又冷層積處理30天；NaOH + CJ代表NaOH處理后又冷層積處理30天；NaHClO + CJ代表NaHClO處理后又冷層積處理30天Note:Different lowercase letters indicate significant differences in germination rates or germination delay days between treatments for the same species (P<0.05). CJ30 represents cold stratification for 30 days;H2SO4 + CJ represents cold stratification for 30 days after H2SO4 treatment. NaOH + CJ represents cold stratification for 30 days after NaOH treatment;NaHClO + CJ represents cold stratification for 30 days after NaHClO treatment

帕米爾薹草(PME)種子在H2SO4+冷層積綜合處理后的萌發(fā)率(92.67%)比僅用H2SO4處理后的萌發(fā)率(28.67%)提高了2.23倍(P<0.05)，比對(duì)照組的萌發(fā)率(41.33%)提高了1.24倍(P<0.05)，而且比僅冷層積處理30天后的萌發(fā)率(17.33%)提高了4.34倍(P<0.05)；NaOH +冷層積綜合處理后的萌發(fā)率(84.67%)比僅用NaOH處理后的萌發(fā)率(16.11%)提高了5.00倍(P<0.05)，比對(duì)照組的萌發(fā)率(41.33%)提高了1.04倍(P<0.05)，比僅冷層積處理30天后的萌發(fā)率(17.33%)提高了3.89倍(P<0.05)；NaHClO +冷層積綜合處理后的萌發(fā)率(73.33%)比僅用NaHClO處理后的萌發(fā)率(15.33%)提高了3.78倍(P<0.05)，比對(duì)照組的萌發(fā)率(41.33%)提高了0.72倍(P<0.05)，比僅冷層積處理30天后的萌發(fā)率(17.33%)提高了3.23倍(P<0.05)；在萌發(fā)時(shí)滯中，H2SO4+冷層積綜合處理后的萌發(fā)時(shí)滯最低，為7天，與對(duì)照組的萌發(fā)時(shí)滯(14天)和僅冷層積30天處理后的萌發(fā)時(shí)滯(13天)相比均有顯著性差異。

青藏薹草(QZ)種子經(jīng)過(guò)NaOH處理、NaOH +冷層積處理、H2SO4+冷層積處理和NaHClO +冷層積處理后均有種子萌發(fā)，但是平均萌發(fā)率最高只達(dá)到10%，萌發(fā)時(shí)滯最短為10天。

通過(guò)數(shù)據(jù)分析表明：不管是HB種子還是PME種子，NaOH +冷層積、H2SO4+冷層積和NaHClO +冷層積綜合處理后萌發(fā)率均顯著高于對(duì)照組的萌發(fā)率。對(duì)于PME種子，3種化學(xué)試劑+冷層積綜合處理后的萌發(fā)率不僅顯著高于對(duì)照組的萌發(fā)率，同時(shí)也顯著高于僅冷層積處理30天后的萌發(fā)率。HB種子萌發(fā)率最高達(dá)到96.00%(NaOH +冷層積處理)，萌發(fā)時(shí)滯最低達(dá)到3天(NaOH +冷層積處理，H2SO4+冷層積處理)；PME種子萌發(fā)率最高達(dá)到92.67%(H2SO4+冷層積處理)，萌發(fā)時(shí)滯最低達(dá)到7天(H2SO4+冷層積處理)。

2.4 化學(xué)試劑處理對(duì)種子表皮的作用

研究中選取的化學(xué)試劑主要對(duì)種皮結(jié)構(gòu)有影響，以青藏薹草為例，電鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn)不同化學(xué)試劑處理對(duì)青藏薹草種皮的影響不同，與沒(méi)有經(jīng)過(guò)化學(xué)試劑處理的青藏薹草表皮，即與圖3A和圖3B對(duì)比分析，H2SO4,NaOH,NaHClO對(duì)果皮均有不同程度的機(jī)械破壞作用，并且使種皮明顯變薄(圖3D、圖3F、圖3H)。

其中49% 的H2SO4處理10 min，種皮表面己出現(xiàn)較明顯的酸蝕洞(圖3C)，對(duì)柵欄層也有一定程度的破壞，并且使青藏薹草種皮最外層細(xì)胞出現(xiàn)大量的裂孔，種皮厚度約67.5 μm(圖3D)。

40% NaOH溶液處理30 min對(duì)種皮的機(jī)械破壞效果較好，不但去掉了薹草種子角質(zhì)層(圖3E)，而且使部分最外層大型厚壁細(xì)胞脫落，種皮厚度約79.4 μm(圖3F)。

10%的NaHClO溶液處理1 h對(duì)青藏薹草種皮的腐蝕較為明顯，去掉了種子角質(zhì)層(圖3G)，甚至去掉了種皮最外層的大型厚壁細(xì)胞，種皮厚度約68.5 μm，并且使中間縱向致密細(xì)胞層變得更加疏松(圖3H)。

3 討論

3.1 溫度與光照對(duì)種子萌發(fā)的影響

種子的萌發(fā)過(guò)程是種子的胚在內(nèi)部多種酶的催化作用下發(fā)生的一系列物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量傳遞過(guò)程[16]，在這個(gè)過(guò)程中與酶的活性息息相關(guān)的就是溫度，酶保持最大活性需要適宜的溫度，溫度過(guò)高和過(guò)低都會(huì)降低酶的活性，進(jìn)而體現(xiàn)在種子的萌發(fā)過(guò)程中[17]。本研究表明，HB種子萌發(fā)率最高的溫度是變溫15℃/25℃，而PME種子萌發(fā)率最高的溫度條件是15℃/30℃，這說(shuō)明同一環(huán)境中的不同種莎草科植物種子具有不同的萌發(fā)適宜溫度，在自然環(huán)境中草種的萌發(fā)具有時(shí)空分異性；而且兩種種子在變溫條件下的萌發(fā)率均遠(yuǎn)高于恒溫條件下，與其他植物種子的萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果相似[18-23]。變溫可加快酶的催化作用，促進(jìn)貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，其次變溫有利于種殼軟化，使種胚利于突破種皮，促進(jìn)萌發(fā)[24]。

光照是影響種子萌發(fā)的諸多環(huán)境因素之一，光照誘導(dǎo)種子萌發(fā)的作用是作為指示萌發(fā)適宜環(huán)境的信號(hào)來(lái)終止種子休眠[25]，光照對(duì)種子萌發(fā)的影響存在差異，有研究顯示光照可能促進(jìn)[19]、抑制[26]或者不影響[27]種子的萌發(fā)過(guò)程。而本研究發(fā)現(xiàn)光照對(duì)HB種子的萌發(fā)是必需的，但是對(duì)PME種子的萌發(fā)幾乎沒(méi)有影響，說(shuō)明HB為萌發(fā)喜光性種子，而PME為萌發(fā)光不敏感性種子，在HB種子的萌發(fā)中要注意光照條件。

3.2 冷層積處理對(duì)種子萌發(fā)的影響

冷層積是一種有效的解除種子休眠的方法，冷層積處理可降低種子中的抑制物質(zhì)含量，使種皮軟化、提高透性、種胚發(fā)育后熟，解除種胚生理抑制作用引起的生理休眠型[28-30]，對(duì)于HB種子來(lái)說(shuō)，冷層積處理能顯著提高HB種子的萌發(fā)率，并顯著降低萌發(fā)時(shí)滯天數(shù)；PME種子在冷層積30天之后萌發(fā)率甚至顯著下降，而更長(zhǎng)時(shí)間的冷層積會(huì)在一定程度上提升萌發(fā)率，冷層積同樣提升了QZ種子的萌發(fā)，冷層積90天之后QZ種子在培養(yǎng)期內(nèi)出現(xiàn)了種子萌發(fā)。這說(shuō)明HB，PME和QZ種子均存在一定程度的生理休眠現(xiàn)象。

種子的萌發(fā)時(shí)滯天數(shù)越低，說(shuō)明其發(fā)芽越迅速。具有較低的萌發(fā)時(shí)滯天數(shù)的物種能在適宜的條件下迅速發(fā)芽，這直接關(guān)系著該物種繁衍、種群維持和發(fā)展[31-34]。本研究表明，冷層積對(duì)供試高寒草甸植物HB，PME，QZ種子萌發(fā)特性的影響因草種不同而異。HB種子和PME種子經(jīng)冷層積處理后，萌發(fā)更迅速，且冷層積時(shí)間越長(zhǎng)，萌發(fā)時(shí)滯天數(shù)越低，發(fā)芽越整齊。這也與魚(yú)小軍等對(duì)高寒草甸植物種子萌發(fā)特性的研究結(jié)果一致[32]。

3.3 化學(xué)試劑對(duì)種子萌發(fā)的影響

硬實(shí)是植物種子中普遍存在的現(xiàn)象，硬實(shí)種子是由于種皮堅(jiān)硬而很難進(jìn)行影響吸脹萌發(fā)的種子[35-36]。在本研究中，化學(xué)試劑處理降低了HB和PME種子的萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)滯，顯著促進(jìn)了QZ種子的萌發(fā)過(guò)程，而且以QZ種子為例，結(jié)合電鏡觀察，可以發(fā)現(xiàn)一定濃度的H2SO4，NaOH，NaHClO均能不同程度的破壞種子木質(zhì)堅(jiān)硬的種皮結(jié)構(gòu)和種皮最外層大型厚壁細(xì)胞，增大種皮細(xì)胞間隙，使中間縱向致密組織變得疏松，減輕其機(jī)械障礙和透性障礙，讓水分和氧氣易于進(jìn)入種子，有利于種子與外部之間的物質(zhì)交流，從而解除種子硬實(shí)外皮的物理休眠，提高其發(fā)芽率[13]。

有研究指出，化學(xué)處理聯(lián)合應(yīng)用冷層積處理，可成功打破部分莎草科植物種子和其它植物種子的休眠，提高其萌發(fā)率[15,37-38]，張國(guó)云等研究也表明在不考慮品種因素的情況下，NaOH溶液處理結(jié)合冷層積處理后平均發(fā)芽率最高[13]。本研究也表現(xiàn)為種子采用化學(xué)試劑浸種+冷層積綜合處理措施后萌發(fā)率比常規(guī)化學(xué)試劑處理和僅低溫層積處理的種子更高，且萌發(fā)也更迅速。

本研究中，QZ種子萌發(fā)最困難，溫度、冷層積和化學(xué)試劑處理對(duì)QZ種子萌發(fā)的影響并不顯著，可能與QZ種子中的內(nèi)源抑制物含量過(guò)高或者基因調(diào)控有關(guān)[39-41]。因此，QZ種子的休眠和萌發(fā)特性以及如何進(jìn)一步提高QZ種子的發(fā)芽率還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，青藏高原莎草科種子在自然條件下的萌發(fā)率低，一方面是其生長(zhǎng)的地區(qū)環(huán)境惡劣，植物的適應(yīng)性生活策略所致[42]；另一方面是莎草科種子小、種皮硬實(shí)、外覆光滑且較厚的角質(zhì)層導(dǎo)致種皮對(duì)水分和氧氣的不透性，限制種子的萌發(fā)。種皮硬實(shí)有利于收獲和儲(chǔ)藏、抵抗逆境，但不利于雜草防治和種子繁殖檢驗(yàn)與加工[43-44]。大量研究表明，牧草種子硬實(shí)可以通過(guò)物理方法和化學(xué)方法有效的破除[45-49]，本研究結(jié)果表明采用化學(xué)試劑浸種+冷層積綜合處理措施比常規(guī)化學(xué)試劑處理和僅低溫層積處理的種子萌發(fā)率更高、萌發(fā)更迅速，并結(jié)合掃描電鏡發(fā)現(xiàn)化學(xué)試劑處理對(duì)種皮均有不同程度的機(jī)械破壞作用，使種皮明顯變薄，說(shuō)明化學(xué)試劑H2SO4，NaOH，NaHClO均能有效破除莎草科種子硬實(shí)。這對(duì)特殊地域植被種子的萌發(fā)具有一定的理論參考價(jià)值。

4 結(jié)論

同一區(qū)域內(nèi)采集的不同莎草科種子適宜萌發(fā)的溫度并不一樣，而且變溫條件下種子的萌發(fā)率顯著高于恒溫條件下的萌發(fā)率；光照對(duì)種子萌發(fā)的影響因物種而異，華扁穗草為萌發(fā)喜光性種子、帕米爾薹草為萌發(fā)光不敏感性種子。一定濃度的硫酸(H2SO4)、氫氧化鈉(NaOH)和次氯酸鈉(NaHClO)溶液通過(guò)破壞種皮最外層大型厚壁細(xì)胞，增大種皮細(xì)胞間隙，促進(jìn)水分和氧氣進(jìn)入種子，從而增加萌發(fā)率。冷層積處理或化學(xué)試劑+冷層積綜合處理能顯著提高華扁穗草、帕米爾薹草和青藏薹草種子的萌發(fā)率。所以在促進(jìn)種子萌發(fā)的技術(shù)中，應(yīng)綜合多種技術(shù)聯(lián)合處理，可以較好地促進(jìn)種子的萌發(fā)。