武曉林,尤 敏王 婷，楊 敏，樊雅玲，童勤思,

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院,安徽230000；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷(pressure injury,PI)是一種常見的慢性難愈性傷口。慢性難愈性傷口是指(hard-to-heal wounds)任何在經(jīng)過4周標(biāo)準(zhǔn)化護(hù)理后仍未愈合40%～50%的傷口[1]。調(diào)查顯示伴隨感染的壓力性損傷是65歲以上病人死亡的獨(dú)立預(yù)測因子[2]。炎癥反應(yīng)期是創(chuàng)面愈合過程重要的階段,對創(chuàng)面愈合起著關(guān)鍵的作用。細(xì)胞及細(xì)胞因子分泌紊亂,會導(dǎo)致創(chuàng)面停滯在炎癥反應(yīng)階段,而過多且持續(xù)的炎癥反應(yīng)會加速創(chuàng)面惡化[3-4]。因此,控制炎癥反應(yīng)對Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷的治療具有重要的臨床意義。葉廣祚提倡治瘡瘍宜早,且不論陰證陽證,新證久證,有膿無膿,膿深膿淺,皆宜用灸[5]?；匦目梢詼亟?jīng)通絡(luò)、散寒通滯、促進(jìn)血液循環(huán)[6]。艾灸治療壓力性損傷的有效性已經(jīng)得到很多研究的證實(shí)[7-9],但關(guān)于其機(jī)制的研究仍需進(jìn)一步探索。因此，本研究采用磁鐵壓力法復(fù)制Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型,利用病理學(xué)、免疫學(xué)等手段,觀察Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷大鼠創(chuàng)面愈合率、組織病理形態(tài)、血清白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和白細(xì)胞介素4(IL-4)表達(dá),探討回旋灸治療Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷大鼠的可能機(jī)制,為臨床治療壓力性損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

樣本量計算依據(jù)每組大鼠樣本量一般為6～12只[10]，本研究在保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性前提下，依據(jù)動物實(shí)驗(yàn)的3R原則，確定樣本為32只，每組8只大鼠。選取6～8周無特定病原體(SPF)級健康雌性SD大鼠32只,重量180～200 g,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,生產(chǎn)許可證號:SCXK(皖)2017-001,大鼠合格證編號:SCXK(豫)2019-0002。動物飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室,室溫22～27 ℃,相對濕度40%～60%,12 h/12 h明暗周期,大鼠自由攝食、進(jìn)水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、常規(guī)治療組和艾灸組,每組8只,后3組大鼠采用磁鐵加壓法復(fù)制Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型。各組體重比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器(見表1)

表1 主要儀器

1.2.2 試劑(見表2)

表2 主要試劑

1.3 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷大鼠模型

1.3.1 模型制備

采用磁鐵壓力法[11]復(fù)制大鼠壓力性損傷模型。大鼠禁食、禁水8 h,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(每100 g體重0.2 mL)進(jìn)行麻醉。在大鼠背部正中線左側(cè)臀部備皮,范圍為2 cm×2 cm。手術(shù)區(qū)操作臺鋪一次性無菌手術(shù)巾,僅暴露大鼠手術(shù)區(qū),用5%聚維酮碘消毒后,切一2 cm的切口,用鑷子將筋膜和組織鈍性分離,直至肌肉暴露,將高壓滅菌后的鐵片(直徑2 cm,東莞市昶高磁電制品有限公司)放置于肌肉下,使用手術(shù)縫線以單純間斷縫合的方式縫合切口,再用5%聚維酮碘消毒縫合處以防止感染發(fā)生。造模后第2天開始,利用體內(nèi)外磁鐵相吸向大鼠進(jìn)行施壓,施壓2 h,解除壓力0.5 h,每天進(jìn)行5個循環(huán),連續(xù)造模4 d。第5天評估傷口分期后開始換藥,共換藥9 d。大鼠單籠飼養(yǎng),供給充足食物和水,及時更換墊料。

1.3.2 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型制備成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)[12]

Ⅲ期:受壓處皮膚黑硬,針刺后不出血,皮膚清創(chuàng)后暴露脂肪但不暴露肌肉、肌腱或是骨骼;Ⅳ期:邊緣皮膚紅腫糜爛,有滲液或滲血,伴有骨骼、肌腱或肌肉暴露。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 傷口床準(zhǔn)備

依據(jù)TIME原則實(shí)施干預(yù)措施。即tissue(組織評估和管理)、inflammation and infection(感染/炎癥管理)、moisture balance(濕度平衡/管理)、edge(傷口邊緣觀察和管理)[1]。

1.4.1.1 評估傷口(T)

觀察創(chuàng)面顏色,測量傷口大小、深度、潛行、竇道,觀察滲液的量、顏色、性質(zhì)、氣味,以及傷口肉芽的顏色、周圍皮膚顏色、有無腫脹、內(nèi)卷等方面。

1.4.1.2 清除壞死組織,控制感染(I)

非感染性傷口:使用0.5%碘伏消毒創(chuàng)面周圍皮膚后用生理鹽水清洗創(chuàng)面,將創(chuàng)面壞死組織、分泌物及原來的殘留藥物清洗干凈,再用生理鹽水反復(fù)多次沖洗創(chuàng)面,無菌干紗布吸干創(chuàng)面水分;感染性傷口:感染傷口局部表現(xiàn)為組織塌陷、紅腫加重、分泌物增多,滲出液渾濁黏稠,氣味改變,肉芽脆弱[13]。使用0.5%碘伏消毒創(chuàng)面周圍皮膚及由外向內(nèi)消毒創(chuàng)面,將創(chuàng)面壞死組織、分泌物及原來的殘留藥物清洗干凈,再用生理鹽水反復(fù)多次沖洗創(chuàng)面,無菌干紗布吸干創(chuàng)面水分。消毒過程嚴(yán)格遵循無菌技術(shù)操作原則。

1.4.1.3 濕度平衡(M)

維持室內(nèi)相對濕度40%～60%,維持創(chuàng)面濕度平衡。傷口滲出液過多時,采用凡士林紗布條引流滲出液;傷口過干時,使用經(jīng)高溫消毒的生理鹽水紗布覆蓋傷口。

1.4.1.4 觀察傷口邊緣情況(E)

傷口邊緣游離:填塞敷料;傷口邊卷:外科切除;使用生理鹽水清洗并用無菌干紗布擦干周邊皮膚受損部位,保護(hù)傷口邊緣皮膚。

1.4.2 分組護(hù)理

空白組進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。模型組:傷口床準(zhǔn)備好后使用經(jīng)高壓滅菌的生理鹽水紗布進(jìn)行換藥,每天1次,9 d為1個療程。常規(guī)治療組:傷口床準(zhǔn)備好后使用藻酸鹽銀離子敷料(嘉興騰昇醫(yī)療器械有限公司)[14]進(jìn)行換藥,每天1次,9 d為1個療程。艾灸組:傷口床準(zhǔn)備好后將艾條(南陽艾之靈艾業(yè)有限公司)燃燒端距傷口表面3 cm進(jìn)行施灸,傷口表面反復(fù)旋轉(zhuǎn)移動,每天15 min。使用醫(yī)用紅外線電子體溫溫度計記錄大鼠創(chuàng)面表皮溫度,使溫度維持在41～43 ℃。施灸過程中及時處理艾灰,避免艾灰接觸大鼠創(chuàng)面后燙傷或者感染創(chuàng)面等導(dǎo)致傷口惡化?；匦闹委熀笫褂蒙睇}水敷料覆蓋傷口。每天1次,9 d為個療程。

1.4.3 標(biāo)本采集

于實(shí)驗(yàn)干預(yù)第10天留取標(biāo)本,大鼠稱重,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(每100 g體重0.2 mL)麻醉大鼠后,取大鼠腹主動脈血和創(chuàng)面組織,最后采用斷頸法處死大鼠。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 創(chuàng)面愈合率

使用創(chuàng)面愈合率評估大鼠創(chuàng)面愈合情況。于第1天、第3天、第5天、第7天、第9天測量模型組、常規(guī)治療組和艾灸組大鼠的創(chuàng)面面積。使用經(jīng)消毒的硫酸紙(105 mm×148 mm)描出創(chuàng)面邊緣后,在硫酸紙底部放一量尺后拍照。將照片導(dǎo)入Image-Pro Plus,測量創(chuàng)面面積。第n天創(chuàng)面愈合率=(第1天創(chuàng)面面積-第n天創(chuàng)面面積)/第1天創(chuàng)面面積×100%。

1.5.2 創(chuàng)面病理學(xué)組織形態(tài)

采用蘇木素-伊紅(HE)染色，于換藥第10天。取大鼠創(chuàng)面組織?？酒?0～30 min，二甲苯5 min,乙醇(100%、95%、80%)脫水3次,每次3 min,流水緩慢沖洗,蘇木素浸染2～5 min,1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,飽和碳酸鋰溶液藍(lán)化數(shù)秒,95%乙醇脫水2 min,伊紅染液(醇溶性)浸染數(shù)秒,95%乙醇,每次5～10 s,100%乙醇脫水2次,每次1 min,苯酚-二甲苯、二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明2次,每次2 min。封片后置光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察。

1.5.3 血清炎性因子水平表達(dá)(IL-4、IL-6、IL-1β)

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，在大鼠換藥第10天,抽取大鼠腹主動脈血,稀釋、加樣，加酶標(biāo)試劑50 μL,37 ℃溫育30 min,配液、洗滌，依次加入顯色劑A和B各50 μL,37 ℃避光顯色10 min,加終止液50 μL,終止反應(yīng),測量各孔的吸光度(OD值)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模前體重及造模情況

造模前4組體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。飲食、飲水及大小便均正常。各組壓力性損傷情況：模型組2只大鼠Ⅲ期，6只大鼠處于Ⅳ期；常規(guī)治療組1只大鼠處于Ⅲ期，7只大鼠處于Ⅳ期；艾灸組2只大鼠處于Ⅲ期，6只大鼠處于Ⅳ期。模型組于換藥第1天和第2天各死亡1只大鼠,予以剔除。換藥前各組大鼠創(chuàng)面面積比較見表3。

表3 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠一般資料比較

2.2 創(chuàng)面愈合率

第3天,3組大鼠創(chuàng)面愈合率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);第5天、第7天、第9天,艾灸組創(chuàng)面愈合率均優(yōu)于同組第3天創(chuàng)面愈合率,也優(yōu)于同期模型組和常規(guī)治療組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而模型組與常規(guī)治療組創(chuàng)面愈合率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠創(chuàng)面愈合率比較 單位:%

2.3 創(chuàng)面病理學(xué)組織形態(tài)變化

創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察詳見圖1,模型組真皮層大面積壞死溶解,肌纖維壞死,大量炎性細(xì)胞浸潤,未見毛囊等附屬器官;常規(guī)治療組可見較多炎性細(xì)胞浸潤,有新生血管形成;艾灸組較少炎性細(xì)胞浸潤,可見肌纖維和新生血管形成。

圖1 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察

2.4 血清IL-4、IL-6、IL-1β表達(dá)水平(見表5)

表5 各組壓力性損傷模型大鼠血清IL-4、IL-6、IL-1β表達(dá)水平比較 單位:pg/mL

3 討論

3.1 大鼠創(chuàng)面愈合和病理情況比較

傷口表面面積的減少是傷口恢復(fù)進(jìn)展的標(biāo)志[1]。本研究結(jié)果顯示回旋灸干預(yù)可以顯著提高創(chuàng)面的愈合。這與成育玲等[15]研究結(jié)果相似。

3.2 大鼠炎性因子表達(dá)的比較

3.2.1 IL-1β在Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠的表達(dá)

M1型促炎性巨噬細(xì)胞和M2型抗炎性巨噬細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的兩種表型[16-17],在不同階段動態(tài)轉(zhuǎn)化[18],可以分泌大量的炎癥因子,是創(chuàng)面組織修復(fù)中的關(guān)鍵細(xì)胞。IL-1β是M1型抗炎性巨噬細(xì)胞分泌的一種促炎細(xì)胞因子[19],參與炎性反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的降解,有助于清除傷口殘留及感染物質(zhì)[20],但其過度表達(dá)會使炎癥反應(yīng)失控而導(dǎo)致組織損傷。本研究結(jié)果顯示在艾灸組大鼠血清IL-1β的表達(dá)水平為(55.51±3.29)pg/mL,明顯低于模型組(118.41±2.96)pg/mL和常規(guī)治療組(82.26±3.31)pg/mL,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明回旋灸抑制大鼠IL-1β的表達(dá),減輕IL-1β過度表達(dá)引起的炎癥反應(yīng),減輕組織損傷。與闞宇[21]的研究結(jié)果不同,可能是由于其研究的為炎癥期炎癥因子的表達(dá)水平,提示艾灸可以促進(jìn)炎癥期促炎因子的表達(dá);而本實(shí)驗(yàn)第10天模型組IL-1β的高表達(dá)提示炎癥因子的失調(diào)導(dǎo)致創(chuàng)面停滯在炎癥期導(dǎo)致愈合延遲,結(jié)果提示回旋灸干預(yù)可以抑制過度的炎癥反應(yīng),促進(jìn)傷口愈合過程由炎癥期向增殖期的過度。

3.2.2 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠IL-6的表達(dá)

IL-6在慢性傷口的表達(dá)水平高于急性傷口[22],IL-6高表達(dá)會加重炎癥反應(yīng)程度。蘭園淞等[23]發(fā)現(xiàn)壓力性損傷模型大鼠血清IL-6的表達(dá)水平明顯升高。本研究結(jié)果顯示常規(guī)治療組和艾灸組大鼠血清IL-6的表達(dá)水平分別為(92.47±4.14)pg/mL、(110.07±4.31)pg/mL,明顯低于模型組(175.00±3.72)pg/mL(P<0.05)。提示回旋灸可以抑制IL-6的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)過度對組織造成的損害。這與李杰輝等[24]的研究結(jié)果一致。銀離子(Ag+)除具有抗菌活性外,還具有抗炎作用,可以有效控制壓力性損傷傷口感染時間,促進(jìn)傷口愈合[25]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藻酸鹽銀離子敷料可以通過促進(jìn)IL-4、抑制IL-6和IL-1β的表達(dá)來發(fā)揮其抗炎作用，且抑制IL-6表達(dá)的效果優(yōu)于艾灸組。

3.2.3 Ⅲ期、Ⅳ期壓力性損傷模型大鼠IL-4的表達(dá)

IL-4是最有效的抗炎細(xì)胞因子之一[26]。創(chuàng)面正常愈合后期,M2型巨噬細(xì)胞在IL-4和IL-13的刺激下,分泌IL-4、IL-10、IL-12 等抗炎因子和生長因子IGF-1、VEGF、TGF等[27],可以抑制炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)血管再生，重塑組織。而存在慢性難愈性創(chuàng)面的機(jī)體,M1巨噬細(xì)胞持續(xù)存在,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞無法轉(zhuǎn)換為M2表型,創(chuàng)面促炎細(xì)胞因子水平持續(xù)升高,而M2巨噬細(xì)胞的抗炎及組織修復(fù)功能難以發(fā)揮,兩種表型巨噬細(xì)胞的失調(diào)導(dǎo)致其分泌的抗炎因子和促炎因子的平衡失調(diào),因此傷口進(jìn)程往往會停滯[28]。本研究結(jié)果顯示艾灸組大鼠血清IL-4的表達(dá)水平為(181.29±6.97)pg/mL,明顯高于模型組(68.80±7.28)pg/mL和常規(guī)治療組(152.12±7.48)pg/mL(P<0.05)，提示回旋灸可以促進(jìn)IL-4的表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)。

4 小結(jié)

機(jī)體處于微炎癥狀態(tài)下,促炎因子大量分泌而抗炎因子分泌不足,使得炎癥因子之間的平衡失調(diào),導(dǎo)致傷口愈合延遲[29]。回旋灸干預(yù)可以減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng),促進(jìn)創(chuàng)面愈合[30]。從上述結(jié)果中得出,回旋灸通過促進(jìn)抗炎因子IL-4的表達(dá),抑制促炎因子IL-1β、IL-6的表達(dá),從而達(dá)到促炎因子和抗炎因子之間的平衡,以抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。故臨床可以考慮在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上使用回旋灸輔助治療慢性難愈性創(chuàng)面。本研究探討關(guān)于回旋灸對創(chuàng)面炎癥的觀察,今后需進(jìn)一步探討回旋灸在分子生物學(xué)方面的機(jī)制研究。