陳慧聰，焦燁磊，王偉隆, ，黃旭雄,

(1.水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海海洋大學(xué)，上海 201306；2.上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海海洋大學(xué)，上海 201306；3.上海市水產(chǎn)動物良種創(chuàng)制與綠色養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

類胡蘿卜素是自然界中分布最廣的一類天然色素，主要由植物和微生物合成.動物自身不能合成類胡蘿卜素，但可以從食物中吸收并進(jìn)行有效代謝滿足自身的營養(yǎng)需求[1].近年來，類胡蘿卜素類添加劑在水產(chǎn)動物著色、抗氧化、抗應(yīng)激以及提高繁殖力等生理方面的影響受到了越來越多的關(guān)注[2-5].現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有 600多種類胡蘿卜素，其普遍表現(xiàn)為不易溶于水，易溶于脂溶性溶劑，且容易受到環(huán)境中氧氣、強(qiáng)光、高溫和酸的破壞.目前添加在水產(chǎn)動物飼料中的類胡蘿卜素主要有胡蘿卜素類(以 β-胡蘿卜素為主)和葉黃素類(以葉黃素、玉米黃質(zhì)、角黃素和蝦青素為主)兩大類.

鹵蟲(Artemia sp.)無節(jié)幼體及成蟲自身營養(yǎng)豐富，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物幼體及觀賞魚的生物餌料.同時，還可以利用其非選擇性濾食特性，作為生物包囊定向傳遞營養(yǎng)強(qiáng)化劑給水產(chǎn)苗種[6].雖然鹵蟲自身不能合成類胡蘿卜素，但可以通過食物鏈進(jìn)行傳遞，不僅可以有效滿足養(yǎng)殖對象幼苗類胡蘿卜素的營養(yǎng)需求，而且可以避免類胡蘿卜素在飼料加工過程及直接投喂過程中的分解及異構(gòu)化.

類胡蘿卜素的檢測方法主要有紫外-可見分光光度計(jì)法[8]、高效液相色譜(HPLC)[9]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[10]等.紫外-可見分光光度計(jì)法靈敏度較低，對微量類胡蘿卜素測定結(jié)果重現(xiàn)性差.HPLC法具有分離效果好、靈敏度高等特點(diǎn)，但分析時間較長.HPLC-MS/MS相較于 HPLC應(yīng)用范圍更廣，可分析沸點(diǎn)高、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物，但使用成本較高.超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)與傳統(tǒng)的 HPLC相比，具有柱效更高、分離速度更快、靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn).樣品的理化性質(zhì)會影響類胡蘿卜素的萃取，且游離在細(xì)胞外的類胡蘿卜素不穩(wěn)定，因此對于不同樣品的前處理方式十分重要.提取類胡蘿卜素常選用有機(jī)溶劑.非極性溶劑如正己烷、石油醚、四氫呋喃(THF)是提取非極性的胡蘿卜素或酯化葉黃素的最佳選擇，而弱極性溶劑如丙酮、乙醇、乙酸乙酯更適合提取弱極性的類胡蘿卜素.提取常通過物理化學(xué)方法使細(xì)胞破碎，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)類胡蘿卜素的釋放，主要有索氏提取[11]、微波輔助提取(MAE)[12]、超聲輔助提取(UAE)[13]、加壓液體萃取(ASE)[14]、超臨界 CO2萃取(SFE)[15]等.對于細(xì)胞壁較厚的材料也常使用纖維素酶酶解[16]，對于油脂含量過高的樣品則可用膽固醇酯酶酶解或皂化的方法輔助提取.

鑒于類胡蘿卜素對水產(chǎn)動物的重要生理作用及鹵蟲作為營養(yǎng)載體的便利性，開展鹵蟲類胡蘿卜素強(qiáng)化是提升鹵蟲餌料價值的重要途徑.本研究以鹵蟲初孵無節(jié)幼體為研究對象，探究鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素的最佳提取及檢測方法，為開展鹵蟲類胡蘿卜素的代謝研究和有效營養(yǎng)強(qiáng)化奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

鹵蟲初孵無節(jié)幼體由產(chǎn)自渤海灣的鹵蟲休眠卵孵化所得，冷凍干燥后，于－20℃冰箱避光保存用于實(shí)驗(yàn).采用超高效液相色譜儀 ACQUITY UPLC HClass(美國 Wasters公司)，配用 ACQUITY H-Class BEH C18色譜柱(1.7μm，2.1mm×150mm)以及二極管陣列(PDA)檢測器，用于類胡蘿卜素的分離和測定.

5種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：選用購自美國 Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)品蝦青素(純度≥97%)、玉米黃質(zhì)(純度≥95%)、角黃素(純度≥95%)、海膽酮(純度≥95%)和 β-胡蘿卜素(純度≥95%)，分別稱取1mg上述標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷配制成50μg/mL的5種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，低溫避光保存.

膽固醇酯酶溶液的配制：稱取 2.5mg膽固醇酯酶(49U/mg，上海源葉生物科技有限公司)，用0.05mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 7.0)溶解并定容于25mL 容量瓶中，膽固醇酯酶溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用.

無水乙醇、丙酮、石油醚、正己烷，分析純，美國Collins公司；甲醇、乙腈，色譜純，德國 Merck公司；甲基叔丁基醚(色譜純)、超純水(色譜純)、BHT(純度≥97.0%)，德國 CNW 公司；無水硫酸鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氮?dú)猓虾＠┕I(yè)氣體有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

5種類胡蘿卜素單一標(biāo)準(zhǔn)溶液(單標(biāo))：分別移取5種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0mL置于5個10mL容量瓶中，用氮?dú)獯得撝粮?，用?0.1% BHT的甲醇-乙腈(體積比為 3：7)溶液配制成 5μg/mL 的類胡蘿卜素單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22μm 親水濾膜過濾后進(jìn)行檢測.

5種類胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(混標(biāo))：分別移取類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液 0.04、0.20、0.40、1.00、4.00mL置于 5個10.0mL容量瓶中混合均勻，用氮?dú)獯蹈?，加入?0.1% BHT的甲醇-乙腈(體積比為3：7)溶液，分別將其配制成 0.2、1.0、2.0、5.0、20.0μg/mL的 5個質(zhì)量濃度的類胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22μm親水濾膜過濾后進(jìn)行檢測.

1.2.2 儀器條件的優(yōu)化

選用超純水、甲基叔丁基醚和甲醇-乙腈(體積比為 3：7)溶液分別作為流動相 A、B和 C.在柱溫25℃、進(jìn)樣量 10μL、檢測波長 475nm 條件下，通過調(diào)節(jié)洗脫階段3種流動相的梯度洗脫程序，設(shè)定移動相流量為 0.2～0.3mL/min.通過比較 5種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰效果，優(yōu)化調(diào)節(jié)色譜條件，用于后續(xù)樣品檢測.

1.2.3 鹵蟲樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

稱取鹵蟲初孵無節(jié)幼體凍干樣品 0.1g置于10mL離心管中，加入3mL 提取劑，充分渦旋振蕩，冰浴超聲波處理，在適宜溫度、黑暗條件下浸提后，4000r/min離心 10min，取上層清液，提取過程重復(fù)3次，合并上清液后用氮?dú)獯蹈?加入 3.0mL甲醇-乙腈(體積比為3：7)溶液復(fù)溶后，經(jīng)0.22μm親水濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中備檢.實(shí)驗(yàn)過程中，通過分別比較6種不同混合提取劑，即丙酮-甲醇(體積比為2：1)[17]、無水乙醇-石油醚(體積比為 1：1)[18]、丙酮-石油醚(體積比為 3：7)[19]、丙酮-乙腈(體積比為3：2)[20]、正己烷-丙酮-乙醇(體積比為 2：1：1)[21]和丙酮-乙醇(體積比為 1：1)[22]，以及超聲波處理時間(0、15、30、60、90、120min)、浸提溫度(25、35、45、55、65℃)和浸提時間(10、20、40min)，優(yōu)化鹵蟲樣品類胡蘿卜素的提取條件.

在此基礎(chǔ)上，比較直接提取、膽固醇酯酶酶解和堿性皂化對鹵蟲初孵無節(jié)幼體中類胡蘿卜素提取效果的影響.

膽固醇酯酶酶解方法：參照孔凡華等[23]的方法，將鹵蟲類胡蘿卜素提取液，經(jīng)過氮?dú)獯蹈珊笠来渭尤?mL 丙酮、2mL Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH＝7)和 1.0mL膽固醇酯酶(5U/mL)溶液，振蕩混合后在 37℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)振蕩酶解 60min，取出冷卻至室溫，依次加入1g無水硫酸鈉和5mL石油醚，在渦旋振蕩器上振蕩 1min，靜置分層后，將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一個50mL離心管中，再加入5mL石油醚.重復(fù)2次后，合并上清液.

堿性皂化方法：參照文獻(xiàn)方法[24-25]，將鹵蟲類胡蘿卜素提取液置于 50mL離心管中，加入 5mL 0.02mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，靜置于 5℃冰箱中避光皂化60min；加入5mL超純水和5mL石油醚，在渦旋振蕩器上振蕩 1min；靜置分層后，將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一個50mL離心管中，再加入5mL石油醚.重復(fù) 2次，合并的上清液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，?.0mL甲醇-乙腈(體積比為 2：1)溶液將其完全溶解，經(jīng)0.22μm親水濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中備檢.

1.2.4 回收率及精密度

分別向加入不同已知量的類胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(3、6、12μg)的離心管中加入0.1g鹵蟲樣品，按照優(yōu)化后的提取方法獲得提取液，氮?dú)獯蹈珊?，?.0mL甲醇-乙腈(體積比為 2：1)溶液將其完全溶解，經(jīng) 0.22μm親水濾膜過濾后測定樣品類胡蘿卜素含量，每個添加濃度平行測定6次，計(jì)算回收率.

式中：P為加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率，%；m為加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量，μg；x1為加標(biāo)試樣的測定值，μg；x0為未加標(biāo)試樣的測定值，μg.

以回收率評價方法的準(zhǔn)確度，根據(jù)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差考察方法的重現(xiàn)性.

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

用與儀器配套的 Empower 3.0工作軟件完成數(shù)據(jù)采集.用 IBM SPSS Statistics 26.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0.05).用 OriginLab 2018進(jìn)行科學(xué)繪圖及圖片處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 超高效液相色譜法色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相比例的選擇

以單個類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液和 5種類胡蘿卜素混標(biāo)作為測試液，通過調(diào)節(jié)流動相中 A、B、C的比例，當(dāng)流動相為 100% C時，蝦青素(Ax)、玉米黃質(zhì)(Zea)、角黃素(Can)、海膽酮(Ech)和 β-胡蘿卜素(β-Car)標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間分別為 2.75、3.44、4.53、11.32、28.49min(圖1).考慮到蝦青素、玉米黃質(zhì)、角黃素的出峰間距小，實(shí)際樣品分析中多個色素及其他物質(zhì)的干擾可能影響分離度，將流動相調(diào)整為5%A＋95%C.此時蝦青素、玉米黃質(zhì)、角黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間分別為 4.43、8.00、15.25min，海膽酮、β-胡蘿卜素1h內(nèi)未被檢出(圖2).

圖1 流動相比例為0%A＋0%B＋100%C時5種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰效果圖Fig.1 Peak curves of five carotenoid standards with mobile phase of 0%A＋0%B＋100%C

圖2 流動相比例為5%A＋0%B＋95%C時5種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰效果圖Fig.2 Peak curves of five carotenoid standards with mobile phase of 5%A＋0%B＋95%C

當(dāng)流動相為 10%A＋90%C時，蝦青素、玉米黃質(zhì)、角黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間分別為 7.94、12.13、25.61min，海膽酮、β-胡蘿卜素 1h內(nèi)未被檢出(圖3).可見增大流動相極性(A 的比例增加，C的比例降低)，有利于提升蝦青素、玉米黃質(zhì)、角黃素的分離效果，但不利于海膽酮、β-胡蘿卜素的分離和檢測.考慮到實(shí)測樣品中可能的溶劑效應(yīng)及類胡蘿卜素之間的極性差異，故選擇初始流動相為 10%A＋90%C，并在角黃素被檢出后(30min后)嘗試進(jìn)行梯度洗脫.在降低極性最強(qiáng)的水相A占比，適量提高甲基叔丁醚的比例，發(fā)現(xiàn)4種不同洗脫條件均對海膽酮和 β-胡蘿卜素具有良好的分離效果，隨著流動相中甲基叔丁基醚比例的增加，海膽酮和 β-胡蘿卜素的出峰時間也隨之提早(圖4).考慮檢測時間以及甲基叔丁基醚非極性強(qiáng)，比例過高會導(dǎo)致色譜柱的柱壓增高，降低色譜柱的使用壽命等因素，初步選擇洗脫條件為：初始流動相 10%A＋90%C 30min，20%B＋80%C 30min進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn).

圖3 流動相比例為10%A＋0%B＋90%C時5種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰效果圖Fig.3 Peak curves of five carotenoid standards with mobile phase of 10%A＋0%B＋90%C

圖4 30min后流動相中甲基叔丁基醚的比例改變對海膽酮和β-胡蘿卜素出峰效果的影響Fig.4 Effects of the change of proportion of methyl tert-butyl ether in mobile phase after 30min on the peaks of echinenone and β-carotene

2.1.2 流量對出峰效果的影響

由于流量與色譜柱的柱壓成正比，流量越大，柱壓越高.流動相流量為 0.30mL/min時，在上述優(yōu)化的洗脫條件下色譜柱的柱壓較為安全；當(dāng)流量設(shè)置超過 0.30mL/min時，柱壓過大，將影響色譜柱的使用壽命，因此在上述實(shí)驗(yàn)選擇的流動相梯度洗脫條件下分別選用了 0.20、0.25、0.30mL/min的流量，測試 5種類胡蘿卜素混標(biāo)的出峰效果.如圖5所示，流量越大，5種類胡蘿卜素保留時間越早，且峰間距明顯.在優(yōu)化后的梯度洗脫條件(10%A＋90%C，16min；20%B＋80%C，14min)下，選擇流動相的流量為0.30mL/min時，可以將原定 30min改變洗脫條件時間點(diǎn)提前到 16min，縮短了檢測時間，提高了測定效率(圖6).

圖5 不同流量對5種類胡蘿卜素出峰效果的影響Fig.5 Effects of different flow rates on the peaks of five carotenoids

圖6 優(yōu)化后的梯度洗脫條件下 5種類胡蘿卜素的出峰效果Fig. 6 Peak curves of five carotenoids under optimized gradient elution conditions

2.1.3 線性關(guān)系考察

將 0.2、1.0、2.0、5.0、20.0μg/mL 的 5個不同濃度梯度的類胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)品，在優(yōu)化后的梯度洗脫條件下，以峰面積(x)為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(y)為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.當(dāng)各化合物信噪比(S/N)為3時的質(zhì)量濃度定義為方法的檢測限(LOD)，各化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢測限見表1.

表1 5種類胡蘿卜素 UPLC法檢測的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Tab.1 Linear equation，correlation coefficient and detection limit of five carotenoids with UPLC detection method

2.2 鹵蟲樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

由于樣品的基質(zhì)、含水率以及類胡蘿卜素的組成不同，不同的提取溶劑對于不同樣本的提取效率有所不同，因此提取溶劑的選擇是十分必要的[26].選取 6種不同的提取溶劑，比較不同提取溶劑對同一批鹵蟲初孵無節(jié)幼體樣本中類胡蘿卜素的提取效果(表2).

丙酮-甲醇(體積比為 2：1)對鹵蟲樣品中類胡蘿卜素的提取能力最好，對角黃素和海膽酮的提取量(以干質(zhì)量計(jì))分別為(526.50±6.78)μg/g 和(17.22±0.05)μg/g，顯著高于其他混合提取溶劑(P＜0.05).

6種提取溶劑均未能從鹵蟲初孵無節(jié)幼體中提取并檢測到蝦青素、玉米黃質(zhì)和 β-胡蘿卜素，表明渤海灣產(chǎn)鹵蟲休眠卵的初孵無節(jié)幼體中不含有蝦青素、玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素.

2.2.2 超聲波處理時間對提取效率的影響

超聲波具有機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過破壞細(xì)胞，增加提取溶劑分子的運(yùn)動速率以增強(qiáng)溶劑穿透力，達(dá)到快速提取目標(biāo)成分的目的[20].但超聲時間過長、強(qiáng)度過大會導(dǎo)致空化過程中羥自由基和氫自由基的形成和積累，從而導(dǎo)致類胡蘿卜素的降解[27].如表3所示：超聲波處理 30min對鹵蟲初孵無節(jié)幼體內(nèi)角黃素和海膽酮的提取量均顯著高于其他組別(P＜0.05)，角黃素和海膽酮最高提取量(以干質(zhì)量計(jì))為(526.50±6.78)μg/g和(17.22±0.05)μg/g.

表3 超聲波處理時間對鹵蟲初孵無節(jié)幼體內(nèi)類胡蘿卜素提取效率的影響(n＝3)Tab.3 Effects of ultrasound time on the extraction efficiency of carotenoids in newly hatched Artemia nauplii(n＝3)

2.2.3 浸提溫度及時間對提取效率的影響

提高浸提溫度可以增加分子運(yùn)動速率，并且可以使有機(jī)試劑揮發(fā)速度加快，使封閉的提取環(huán)境內(nèi)的壓強(qiáng)增大，加快提取效率，但是溫度過高會使類胡蘿卜素發(fā)生降解，因此選擇合適的浸提溫度和浸提時間對提高回收率十分重要.浸提溫度和時間對色素提取效率均有極顯著影響(表4)，且兩個因素之間存在交互作用(表5)，在 65℃提取20min，角黃素和海膽酮的提取量(以干質(zhì)量計(jì))最高，分別為(575.89±2.30)μg/g 和(17.96±0.16)μg/g.

表4 浸提時間和溫度對鹵蟲初孵無節(jié)幼體角黃素和海膽酮提取效率的影響(n＝3)Tab.4 Effects of extraction time and temperature on the extraction efficiency of canthaxanthin and echinenone in newly hatched Artemia nauplii(n＝3)

表5 方差分析Tab.5 Variance analysis

2.2.4 不同脫脂方法對提取效率的影響

由于有些樣品細(xì)胞壁較厚，在勻漿或研磨過程中不易被完全破壞，使胡蘿卜素?zé)o法完全釋放，并且有些樣品中脂肪含量較高，如果不進(jìn)行皂化，會出現(xiàn)提取不完全和提取時出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，濃縮時殘留脂質(zhì)，因此對于不同樣本中類胡蘿卜素的提取，應(yīng)選擇適宜的脫脂方法.如表6所示：直接提取對于角黃素的提取量顯著高于酶解組和皂化組(P＜0.05)，為(572.60±11.60)μg/g.由于酶解和皂化過程延長了樣品在堿性和高溫條件下的處理時間，加速了樣品中角黃素的降解，導(dǎo)致角黃素的提取效率降低，而不同脫脂方法對于海膽酮的提取效率均無顯著性影響(P＞0.05)，因此對于鹵蟲樣品選擇直接提取即可.

表6 不同脫脂方法對鹵蟲初孵無節(jié)幼體內(nèi)類胡蘿卜素提取效率的影響(n＝3)Tab.6 Effects of different degreasing methods on the extraction efficiency of carotenoids in newly hatched Artemia nauplii(n＝3)

2.2.5 加標(biāo)回收率和精密度

按照1.2.4節(jié)的方法測定方法的回收率和精密度(以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7.3種不同濃度水平的蝦青素的加標(biāo)回收率 99.36%～100.32%，精密度 0.75%～1.72%；玉米黃質(zhì)的加標(biāo)回收率98.33%～100.46%，精密度 0.85%～1.43%；角黃素的加標(biāo)回收率 99.40%～100.40%，精密度 0.97%～1.83%；海膽酮的加標(biāo)回收率 99.11%～100.95%，精密度 0.84%～1.49%；β-胡蘿卜素的加標(biāo)回收率99.58%～100.36%，精密度 0.37%～0.88%.這表明方法的回收率好，精密度高.

表7 方法的回收率和精密度(n＝6)Tab.7 Method recoveries and relative standard deviations(n＝6)

3 結(jié) 論

建立了超高效液相色譜(UPLC)測定鹵蟲體內(nèi)類胡蘿卜素的方法.采用丙酮-甲醇(體積比為 2：1)溶劑直接提取，超聲 30min，65℃浸提 20min，可最大程度提取鹵蟲無節(jié)幼體中的角黃素和海膽酮.梯度洗脫條件優(yōu)化為：初始流動相為 10%A(超純水)＋90%C(甲醇與乙腈體積比為 3：7)16min，20%B(甲基叔丁基醚)＋80%C(甲醇與乙腈體積比為 3：7)14min，流量為 0.30mL/min，柱溫為 25℃，檢測波長 475nm，進(jìn)樣量 10μL，能在 30min內(nèi)有效分離檢測到5種類胡蘿卜素，蝦青素、玉米黃質(zhì)、角黃素、海膽酮、β-胡蘿卜素的保留時間分別為 4.20、5.98、11.84、20.42、22.43min，且峰形良好，間距清晰.在0～20μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)5種類胡蘿卜素峰面積和質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于 0.9967.對5種類胡蘿卜素的加標(biāo)回收率為 98.33%～100.98%，精密度為 0.37%～1.83%.提取條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，產(chǎn)自渤海灣的鹵蟲初孵無節(jié)幼體角黃素和海膽酮的提取量(以干質(zhì)量計(jì))分別為(572.60±11.60)μg/g和(18.02±0.41)μg/g，且未檢測到蝦青素、玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素.