李越, 程潮江, 王洪生, 吳信峰

中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所北京協(xié)和醫(yī)學院, 江蘇 南京 210042

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種多能干細胞，符合干細胞定義最基本的條件：自我更新和分化潛能[1]。2006年，在國際細胞治療協(xié)會的倡導下，MSCs首次被定義了最低分類標準，即：①貼壁生長；②表達相應抗原：CD105、CD90、CD73(+)、CD45、CD34、CD14(-)；③成脂、成骨、成軟骨分化潛能[2]。近年來MSCs主要因其成骨能力而應用于組織缺損的重建，而后隨著MSCs免疫調(diào)節(jié)能力的發(fā)現(xiàn)，更多的研究開始向炎癥性腸病、自身免疫性腦炎等非感染性炎癥傾斜[3-4]，即不再過度強調(diào)其多向分化能力的“干性”(stem)，轉而著眼于其免疫調(diào)節(jié)方面的“基質(zhì)性”(stromal)[5]；而隨著研究進一步深入，目前已有諸多證據(jù)表明MSCs在治療感染性疾病方面也有其應用價值，表現(xiàn)為對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、分枝桿菌、寄生蟲及病毒的廣譜抗菌作用。MSCs既可通過促進以巨噬細胞為代表的免疫細胞分泌抗菌肽與關鍵酶[6-7]，也可通過細胞表面受體的表達使機體免疫狀態(tài)由抑制向激活轉化，并限制過度的炎癥損傷[8]；其自身也能進行表型的轉化，在感染的不同階段，分化為促炎的MSC1和抑炎的MSC2，并表達清道夫受體、分泌促炎或抑炎因子、招募遠處的MSCs，誘導宿主的免疫狀態(tài)增強，使其既能在規(guī)范、足量的抗菌藥的基礎上輔助殺菌，又能減輕炎癥因子風暴，最大限度地誘導宿主免疫狀態(tài)的“升級”[9]。鑒于此，更有學者賦予MSCs以新的定義，即“藥物信號細胞”[10]。本文試將MSCs在上述細胞、分子等方面對結核分枝桿菌抑制作用的基礎研究及少量臨床研究進行簡要綜述，以期為臨床抗癆治療提供一定思路。

1 結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)特性

目前MSCs的治療證據(jù)主要來源于結核分枝桿菌。Mtb可分泌休眠生存調(diào)節(jié)子(DosR)和熱休克蛋白 X(HSPX)維持休眠；分泌阿拉伯甘露聚糖(LAM)、過氧化氫-過氧化物酶抑制氧化應激的殺傷；合成分枝菌酸形成厚而富含脂質(zhì)的細胞壁對抗巨噬細胞吞噬；分泌抗凋亡蛋白及酪氨酸磷酸酯酶活化因子(PtpA)抑制吞噬溶酶體的形成等。正是以上原因，使得Mtb得以躲避以巨噬細胞為代表的細胞吞噬，并抑制其殺傷，阻止細菌抗原向T細胞呈遞，使感染趨于慢性化，并介導耐藥結核菌株的產(chǎn)生[11-12]。

2 MSCs治療Mtb現(xiàn)有的基礎研究

2.1 MSC可分泌促炎因子，誘導巨噬細胞表型轉化

PGE2(前列腺素E2)與一氧化氮(NO)：MSC 上的TLR3和TLR4受到PAMP的激活后，可通過p38-MAPK-COX2通路，酶解巨噬細胞膜上的花生四烯酸生成PGE2，后者可促進呼吸爆發(fā)，增強NO分泌，抑制Mtb在Mc中的生長，該結果亦可于膿腫分枝桿菌的體內(nèi)、體外實驗中復現(xiàn)[13]；PGE2還可維持與放大巨噬細胞吞噬與殺傷，通過表達抗凋亡因子bcl-2抑制其凋亡，并促進中性粒細胞形成細胞外網(wǎng)狀陷阱，增強其捕捉與殺傷病原菌的能力[6,14]。

TNF-α、IL-6與IL-1β：受到抗原相關分子模式(PAMPs)刺激后，MSC1可自分泌TNF-α，激活自身TNFR-TRAF-NF-κb-IL-1β通路，促進炎癥進展；當機體與病原體之間的免疫狀態(tài)趨于平衡，MSC2再通過TNFR和B7-H1兩種受體的高表達，與炎癥微環(huán)境中已有的TNF-α和IFN-γ相結合，抑制上述NF-κb通路釋放下游產(chǎn)物Jagged-1、IL-6、IL-8，既抑制NK細胞的成熟，又能進一步激活Notch信號，促進DC細胞向DC-reg表型轉化，后者通過共刺激分子與已經(jīng)活化的M1型巨噬細胞直接接觸，促進巨噬細胞由M1向M2型轉化，分泌IL-4、IL-10、TGF-β等細胞因子，促進T-reg增值，抑制過度的免疫炎癥，促進受損組織的修復[1,15]。一項關于牛分枝桿菌(M.bovis)的研究發(fā)現(xiàn)MSCs抗菌作用的實現(xiàn)需要提前“誘導”：研究者將1×107CFU(菌落形成單位)的M.bovis注射入小鼠腹腔，并將實驗組提前以Poly(A:U)(TLR-3的配體)1.0 μg/mL與待注射的MSCs(7.5×105)孵育誘導成促炎的MSC1表型；發(fā)現(xiàn)實驗組肉芽腫形成數(shù)量雖為對照組1.5倍，但包含分枝桿菌的肉芽腫數(shù)量卻減少了3倍，且每個肉芽腫內(nèi)的分枝桿菌數(shù)量也減少了3.5倍；CFU計數(shù)較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義；TNF-α較對照組升高20倍，IL-6升高11倍，IL-1β少許升高[15]。

單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)：也稱作CCL2，主要由銀屑病患者的角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生和釋放，近年來也被證明可由MSCs所分泌；MCP-1可與單核細胞上的CCR2結合，將其募集至感染部位，并激活其胞內(nèi)鈣離子通道，促使上述免疫細胞鈣離子內(nèi)流、促進氮氧化物產(chǎn)生和溶菌酶的釋放[16]。

2.2 MSC可分泌抗菌肽促進呼吸爆發(fā)

LL-37：由中性粒細胞及上皮細胞產(chǎn)生，為帶正電的雙親性α螺旋肽，可通過電荷吸引破壞細菌外膜、與細菌DNA結合、抑制蛋白質(zhì)合成、中和LPS、招募巨噬細胞等作用發(fā)揮廣譜抗感染效應[17]。LL-37不僅直接破壞細菌結構，還能與甲酰肽樣受體結合，促進中性粒細胞、單核細胞及T細胞的趨化；通過P2X7受體被巨噬細胞內(nèi)化，促進胞內(nèi)細菌的清除，并且這一行為常伴隨活性氧的增加和溶酶體的形成[18]。在急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥等諸多疾病模型中，MSCs已被反復證實可通過LL-37的分泌減少細菌負荷，改善預后[19]。有研究向受Mtb感染的巨噬細胞中加入LL-37后發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路的關鍵下游產(chǎn)物IL-1β在mRNA水平上表達上調(diào)，同時巨噬細胞自噬相關標記物的水平也有所增加[20]。在一項對Mtb感染小鼠的動態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)，LL-37的表達水平在感染后第21天出現(xiàn)峰值，而此時間段正值Th1細胞所介導的保護性免疫達到最強，因此推測該時段高表達的抗菌肽主要介導了其抗菌作用[16]。LL-37不僅可由MSCs所分泌，還可反向調(diào)節(jié)MSCs的增值與遷移[21]。

β-防御素：β-防御素主要由黏膜上皮細胞和白細胞產(chǎn)生，分4型，除β-防御素1外均為誘導性分泌。低氧作為一種對炎性因子的非特異性反應，也可引起β-防御素-2的mRNA 轉錄增加，破壞細菌細胞壁，減輕LPS介導的炎癥反應，刺激MSC遷移、增強巨噬細胞吞噬活性[21]。在M.bovis感染模型中，β-防御素-2與分枝桿菌抗原的融合尚可提高卡介苗的接種效果[22]。有研究顯示，轉入β-防御素3基因的牛與對照組相比，氣道上皮細胞和巨噬細胞內(nèi)β-防御素3的表達顯著增加，其感染M.bovis的風險降低[20]。

鐵調(diào)素：主要由肝細胞產(chǎn)生，但在炎性病灶處的MSCs、淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞中也有較高表達；鐵調(diào)素可通過與運鐵素結合，促進該蛋白的內(nèi)化與降解，從而減少細胞內(nèi)鐵的輸出，將鐵儲存在巨噬細胞等免疫細胞內(nèi)，抑制細菌對鐵元素的吸收與利用[23]。

2.3 MSC可表達細胞表面受體促進巨噬細胞吞噬

清道夫受體(SRs)：已知巨噬細胞中的SRs，如MARCO和CD36，可通過識別Mtb細胞壁上的脂蛋白，介導Mtb的內(nèi)化[24]；而MSCs表面同樣存在上述兩種受體，但是否參與Mtb的吞噬，卻尚未可知。Arshad團隊先后使用兩種不用顏色的熒光，分別標記低密度脂蛋白與結核分枝桿菌，動態(tài)孵育24 h后，熒光融合率達70%；為進一步驗證MSCs可通過SRs內(nèi)化Mtb的假設，作者加入SRs特異性抗體阻斷，導入siRNA行SRs基因敲低，反向證明了其結論成立[25]。

Toll樣受體和NOD樣受體：有研究者以TLR-4和NOD-2刺激MSCs，發(fā)現(xiàn)MSCs可通過p38-MAPK信號通路增強NF-κB活性，促進IL-1β等促炎因子的分泌，并通過分泌細胞外囊泡的形式，傳遞結核分枝桿菌至吞噬細胞內(nèi)體，參與內(nèi)體與溶酶體的融合，誘導細菌的溶解[26]。為增強巨噬細胞吞噬，MSCs還可形成納米管道，向巨噬細胞輸送線粒體等細胞器，增強其代謝活性，促進以Mtb、金葡菌為代表的病原菌的吞噬[27]。

2.4 MSC可通過自噬殺傷結核分枝桿菌

自噬：通過熒光追蹤結核分枝桿菌與自噬體特異性標志物Cyto-ID與LC3，檢測感染Mtb 7 d內(nèi)的MSCs細胞裂解物中CFU計數(shù)及干細胞活力。Khan等[25]證實，Mtb在MSCs內(nèi)可以復刻巨噬細胞中Mtb的自噬殺滅過程；而沉默自噬啟動子Beclin-1的陰性對照組的CFU上升，則反向證明了MSC的內(nèi)在自噬介導了其殺菌過程。反之，1～5 μmol范圍內(nèi)的雷帕霉素所誘導的MSC呈劑量依賴性自噬增強，伴隨CFU的下降及間充質(zhì)干細胞90%活力的保持。

2.5 MSC可雙向調(diào)節(jié)免疫反應

在一項體外實驗中，LPS刺激1 h可將MSC0誘導成促炎的MSC1，于感染的早期表達TLR3/4、MHCII，提呈抗原，分泌趨化因子，促進巨噬細胞與T細胞的活化，提前使機體“戒備”[28]。而LPS刺激48 h或Poly：IC刺激1 h可將MSC0誘導成抑炎的MSC2，于感染的中晚期抑制過度的炎癥，使免疫損傷局限于病灶，避免炎癥因子風暴級聯(lián)擴大，并分泌一定水平的TGF-β和VEGF，提前修復組織損傷[29]，最終縮短病程，整體提高以宿主為導向的免疫狀態(tài)，從而在Mtb的早期吞噬、殺傷促進，晚期纖維化形成上起到宏觀調(diào)控作用[8]。

2.6 MSC可分泌關鍵酶抑制結核生長

IDO-1(吲哚胺-2，3-雙加氧酶-1)：MSC1在病原相關分子模式(PAMPs)的刺激下，可通過TLR4-STAT2-IDO1通路，促進IDO-1分泌，該作用又在IFN-γ和IL-1β的作用下得到加強，從而在感染早期發(fā)揮自主的、廣譜的抗菌作用，但該過程于小鼠實驗中不能復現(xiàn)，或為人類MSCs所獨有[30]。而在感染中后期，IDO-1持續(xù)裂解色氨酸，后者作為分枝桿菌生物合成的關鍵底物，因而持續(xù)性消耗，抑制其增殖；另外，控制細菌生長所消耗的色氨酸水平明顯低于抑制T細胞免疫反應之所需，這表明在細菌感染的早期階段，IDO的分泌是針對對抗微生物而非激起炎癥因子瀑布[31]。而其酶解產(chǎn)物犬尿氨酸作為經(jīng)典的抑炎分子，可抑制NK細胞、DC細胞的活化與增值，并促進Treg的增值，從而平衡過度的Th1型免疫反應，限制炎癥的爆發(fā)[15]。

3 MSC治療結核分枝桿菌現(xiàn)有的臨床研究

為尋求治療多重耐藥與泛耐藥結核的新方法，有研究在標準抗癆藥治療4周的基礎上，輔以骨髓間充質(zhì)干細胞單次(1×106/kg)靜脈輸注，觀察6個月后發(fā)現(xiàn)：①感染者自體骨髓間充質(zhì)干細胞表面標記符合上述MSCs分類標準；②21例患者胸部X線征象于總體上較前改觀，其中16例治愈，5例好轉；③治療組患者外周血γ-IFN水平較基線升高，與生理鹽水對照組有統(tǒng)計學差異[32]。該研究對36例已有抗癆藥物覆蓋的多重耐藥結核患者行單次MSCs靜脈輸注后行臨床觀察，治療組中有29例(81%)患者獲得了臨床表現(xiàn)、細菌學及影像學上的改善，75%的患者獲得治愈，且均未觀察到明確的不良反應；而對照組中，僅14例(39%)改善，卻有16例(44%)治療失敗(臨床癥狀無改善、痰涂片仍陽性或胸片病灶無縮小)。有趣的是，在連續(xù)5次痰涂片轉陰的觀察過程中，治療組與對照組的差異隨時間延長而逐漸縮?。篗SCs輸注后4個月，60.6%的治療組痰涂片轉陰，而對照組為43.8%；輸注后6個月，二者的轉陰率為71.9%和71.4%，差異已不再有統(tǒng)計學意義(P>0.05)[33]?？赡艿K于痰涂片本身陰性率高，且該結果與臨床表現(xiàn)、胸片結果不平行，研究者并未進行深入探討。

4 結語

MSCs作為細胞治療的一種手段，在機制上可通過直接、間接的方式，在感染的不同時期，分別發(fā)揮促炎和抑炎的作用，綜合調(diào)控機體對結核分枝桿菌的免疫反應，使整體的免疫狀態(tài)由抑制向活躍轉化。但是，目前關于MSCs治療結核感染的臨床實驗僅有兩項，且治療效果的評估均建立在足量、規(guī)范的抗癆藥物基礎之上，在MSCs大規(guī)模應用于臨床實踐之前，仍然需更多高級別的證據(jù)對其安全性及有效性加以佐證。