趙 賀 王詩琦 陳俊山 趙世文

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所，遼寧鳳城 118100)

柞蠶微粒子病俗稱銹病、渣子病、底子病，是有柞蠶微孢子蟲寄生引起的慢性傳染病。此種柞蠶病害歷史悠久，清朝時期就有較多文獻(xiàn)記載過，如今世界各柞蠶產(chǎn)區(qū)該病也均有發(fā)生，材料繭生產(chǎn)一般年份發(fā)病率為30%～70%，嚴(yán)重年份可達(dá)90%以上，造成柞蠶減產(chǎn)30%左右[1]。為減少該病的發(fā)生與危害，柞蠶技術(shù)人員選擇顯微鏡鏡檢的方式，查明母蛾是否帶有微粒子原蟲，這是預(yù)防胚胎傳染微粒子病的最有效方法，也是提高種繭質(zhì)量，確保柞蠶產(chǎn)量的一項必要措施。按目前柞蠶生產(chǎn)制種情況，柞蠶鏡檢分為兩種，一是柞蠶育種制種鏡檢，二是柞蠶生產(chǎn)制種鏡檢。柞蠶生產(chǎn)制種鏡檢是柞蠶生產(chǎn)制種過程中的重要環(huán)節(jié)，柞蠶生產(chǎn)制種是為柞蠶生產(chǎn)材料繭提供種卵，提供的種卵為雜交種，經(jīng)過1代春季放養(yǎng)后即進(jìn)入生產(chǎn)材料繭階段，制種要求標(biāo)準(zhǔn)雖低于柞蠶育種制種，但嚴(yán)格保證柞蠶生產(chǎn)制種鏡檢質(zhì)量對秋蠶生產(chǎn)產(chǎn)量及質(zhì)量仍至關(guān)重要。本文對柞蠶生產(chǎn)制種鏡檢的技術(shù)進(jìn)行總結(jié)，以期為柞蠶生產(chǎn)制種鏡檢提供參考。

1 鏡檢準(zhǔn)備

1)鏡檢場所準(zhǔn)備：按用途可分為制片區(qū)、顯微鏡檢查區(qū)、洗滌區(qū)。制片區(qū)內(nèi)需要有掏蛾、穿刺、點片的工作臺，裝廢蛾的器具；顯微鏡檢查區(qū)要清潔、明亮，光線充足，工作臺要整潔；洗滌區(qū)要有上下水，室外要有寬敞的環(huán)境晾曬點片玻璃條。

2)鏡檢用具：載玻片(25mm×5mm×3mm白玻璃條)、蓋玻片、滴水瓶、載玻片墊板、600～720倍電子生物顯微鏡、火柴棍、擦鏡紙等。

2 鏡檢的組織分工及過程

目前柞蠶生產(chǎn)制種的整個鏡檢過程由制片組、鏡檢組、洗滌組、扒卵組、清理組、稱量組、保卵組組成，每項工作都保質(zhì)保量完成才能保證整個鏡檢過程有序高效進(jìn)行。

制片組：此環(huán)節(jié)每小組一般2～3人。以3人一組為例，1人負(fù)責(zé)將產(chǎn)卵袋內(nèi)母蛾掏出，并將產(chǎn)卵袋按次序排好，1人接過母蛾后用火柴棍在母蛾腹部背處2～3環(huán)節(jié)皮下脂肪處插入，旋轉(zhuǎn)幾下后拔出，將帶有脂肪組織的火柴棍交于點片人研磨。點片人將長條載玻片放在墊板上，每個墊板上要有10個點片位置標(biāo)記，點片人用滴水瓶按10個點片標(biāo)記滴上10滴適宜量的清水。長條載玻片一端斜口、一端齊口，以斜口端為開始端，即第一個點對應(yīng)第一個產(chǎn)卵袋內(nèi)母蛾。點片人將帶有脂肪組織的火柴棍按照次序在相應(yīng)水滴處進(jìn)行3～5圈的研磨，每個產(chǎn)卵袋對應(yīng)一個點片位置，研磨完成后，丟棄火柴棍，迅速蓋好蓋玻片，繼續(xù)進(jìn)行下一個點片工作。整條載玻片10個點片程序都完成后，掏蛾人將排好次序的產(chǎn)卵袋遞給點片人，點片人將載玻片放在產(chǎn)卵袋上放置于顯微鏡旁，以備鏡檢人員檢查使用。制片組重點工作是產(chǎn)卵袋的排序，排列次序一定要準(zhǔn)確無誤，在完成一組點片程序后，將產(chǎn)卵袋遞于點片人的過程中，切記不能把產(chǎn)卵袋翻轉(zhuǎn)，否則產(chǎn)卵袋的次序就會整個打亂，造成鏡檢人將無毒蠶卵舍棄而將有毒蠶卵留下；點片人點片時，一定要以斜口端為起始端，每條載玻片點10個點，即對應(yīng)10個產(chǎn)卵袋的母蛾，禁止少點和多點，保持每條載玻片點10個點的規(guī)則不變，這樣可以有效減少點片過程中出現(xiàn)的失誤。

鏡檢組：正式鏡檢前，鏡檢人員要先檢查顯微鏡視野是否清楚，調(diào)整顯微鏡燈光亮度和光圈大小，調(diào)整到一個適宜的亮度和進(jìn)光量，保證視野清晰。點片人員將點好的載玻片和產(chǎn)卵袋放置在顯微鏡旁后，鏡檢人員拿起載玻片，以斜口端為鏡檢起始端，調(diào)整粗螺旋及細(xì)螺旋，將視野調(diào)整到一個清楚看到蛾脂肪組織的位置，此時輕輕推動載玻片，微微調(diào)整細(xì)螺旋，一個點查看了5個清晰視野后，再進(jìn)入下一個點的檢查。鏡檢過程中，發(fā)現(xiàn)有微粒子孢子的點，將此處蓋玻片向上推出，然后進(jìn)入下一個點的檢查，整條載玻片10個點全部檢查完成后，確認(rèn)有微粒子點蓋玻片的位置點，然后將對應(yīng)的產(chǎn)卵袋舍棄，此工作一定要做到準(zhǔn)確無誤。目前鏡檢用的顯微鏡大部分都是單筒顯微鏡，鏡檢人員在鏡檢時，要保持雙眼睜開的狀態(tài)，嚴(yán)禁閉一只眼進(jìn)行鏡檢工作，這樣會造成眼部疲勞、失誤增多。提倡鏡檢培訓(xùn)時，用左手向右推動載玻片，用右眼看目鏡，左眼看載玻片，這樣在完成一個點進(jìn)入下一個點的過程中，右眼不用離開目鏡，有利于加快鏡檢速度。鏡檢中，目鏡觀察到的清晰視野有兩個，即分上下兩層，由于微粒子孢子比重大多沉于下層，所以鏡檢的目標(biāo)視野是下層[2]。鏡檢過程中會發(fā)現(xiàn)，點片人滴水多少直接影響鏡檢質(zhì)量。滴水過多，蓋玻片的外緣會有多余的水，在蓋玻片推動過程中，多余水容易污染鏡頭，污染鏡頭后，需要先完成鏡頭清理，然后才能正常鏡檢；滴水過少，會使蓋玻片和載玻片緊緊貼合在一起，視野清晰度較差，增大漏檢的幾率，所以鏡檢人員在鏡檢初始期要根據(jù)視野情況及時告知點片人是否需要調(diào)整點片時的滴水量，這樣經(jīng)過2～3條點片過程，點片人即可較好地控制點片滴水量。鏡檢過程中，遇到無法看到清晰視野的情況時，首先選擇退回看上一個點，如果上個點可以清晰看出，此時再看下一個點，一般就能解決問題；如退回下個點仍然無法看清，此時考慮鏡頭污染的問題，看上個點和待檢點中間及周圍是否有多余的水或者母蛾脂肪組織，如是多余水造成鏡頭污染，可用擦鏡紙擦拭鏡頭并清除污染水，如是脂肪組織造成鏡頭污染，此時可以在載玻片的兩端空隙較大的地方滴兩滴清水，調(diào)整粗螺旋，讓鏡頭多次和清水接觸和分離，然后用擦鏡紙迅速吸走鏡頭多余水分，即可解決脂肪組織污染鏡頭問題。鏡檢人員在拿到載玻片鏡檢前，可以先觀察蓋玻片周圍是否有多余的水或脂肪組織，發(fā)現(xiàn)多余水或脂肪組織后，用面巾紙擦拭多余水或脂肪組織后再進(jìn)行鏡檢，這樣就可以減少污染鏡頭的情況出現(xiàn)。鏡檢人員在鏡檢推片過程中，如左眼看到蓋玻片周圍有多余水或脂肪組織時，推片過程可以繞過該處，防止污染鏡頭。鏡檢工作在整個制種過程中至關(guān)重要，所以鏡檢人員一定要經(jīng)過長期培訓(xùn)，嚴(yán)格考試，取得上崗合格證后才能持證上崗。鏡檢人員在鏡檢過程中，如遇到無法解決的鏡檢問題時，應(yīng)立即告訴點片人停止點片，然后告知鏡檢室負(fù)責(zé)人相關(guān)情況，及時解決問題，切禁帶問題進(jìn)行鏡檢作業(yè)。

洗滌組：洗滌組人員工作是將載玻片及蓋玻片收集、洗滌、晾曬。洗滌人要及時收集鏡檢后的載玻片，收集后將蓋玻片推到水中小塑料筐內(nèi)，將推完蓋玻片的載玻片放在有水的大盆中。蓋玻片收集一定量后，將裝有蓋玻片的小塑料筐在洗衣粉或洗滌劑溶液中輕輕晃動，洗去脂肪組織等，然后在清水的塑料盆內(nèi)繼續(xù)清洗，清洗2～3遍至無污染物即可，置于水盆上方控去多余水分。將蓋玻片放入一個陶瓷盤中，將陶瓷盤放入微波爐，用中小火烘烤10～15 min。微波爐烘烤禁止使用大火，大火可以縮短蓋玻片干燥時間，但極易造成蓋玻片破碎，減少蓋玻片的使用次數(shù)。長條載玻片用清水清洗干凈后，放置在室外進(jìn)行晾曬，晾干后及時收取以備鏡檢使用。扒卵組：鏡檢人員將無毒產(chǎn)卵袋放于身后待扒卵盆中，扒卵人員進(jìn)行扒卵。扒卵人員拿起5～6個產(chǎn)卵袋，袋口朝下，雙手搓動產(chǎn)卵袋，讓卵落入盆中，然后再單個產(chǎn)卵袋檢查，手伸進(jìn)產(chǎn)卵袋中，將粘附在產(chǎn)卵袋上的卵粒扒入盆中?？债a(chǎn)卵袋袋口朝上，壓緊放入空筐內(nèi)，以備下次產(chǎn)卵使用。扒卵過程中，一定要檢查仔細(xì)，防止卵遺漏在產(chǎn)卵袋中。完成一個品種扒卵后，要及時將扒好的卵收集到一個盆中，做好標(biāo)記后放置一旁，待進(jìn)入下一個卵清理程序。

清理組：扒好的卵集中后，進(jìn)入清理環(huán)節(jié)。此時卵內(nèi)有蛾膀、蛾爪、蛾灰、皮套、火柴棍、蓋玻片等，首先清理大的表層垃圾，如火柴棍、皮套、大的蛾膀等。目前卵清理有兩種方式，一是人工用簸箕清理多余的卵內(nèi)垃圾，二是用蛾籽電動清理機。人工清理時，要在地上鋪上紗網(wǎng)，把卵內(nèi)垃圾用簸箕清理到紗網(wǎng)上，把清理后的卵倒入盆中；完成一個品種后，要把紗網(wǎng)上的垃圾倒入簸箕中再次進(jìn)行清理，將遺落的卵清理出來。蛾籽電動清理機清理時，先將盆中大卵粒帶手套搓成單個卵粒或小卵粒，再將卵倒入機器入口容器內(nèi)，開動機器，調(diào)成一個適宜的進(jìn)風(fēng)量和篩動量，下面兩個出口處放置兩個接置桶。一般一個循環(huán)很難將卵內(nèi)垃圾清理干凈，所以電動清理卵時，最少要完成2個循環(huán)才能將卵內(nèi)垃圾清理干凈。一個品種卵完成清理后，要關(guān)閉電源，打開電動清理機，將清理機內(nèi)遺落的卵清理出來，以待清理下個品種使用。清理組工作如果是人工清理時，對清理人使用簸箕技術(shù)要求較高，所以要選用技術(shù)較好的人作為人工清理人員。電動清理時，要清理人熟練掌握清理機的使用方法，調(diào)整好適宜的進(jìn)風(fēng)量、篩動量和進(jìn)卵量，才能較好較快的完成卵清理工作。

稱量組：整個鏡檢工作完成后，鏡檢出來的卵要進(jìn)行分袋稱重，每袋1～1.5 kg，計算出各品種卵總量，繼而計算出百蛾產(chǎn)卵量、微粒子卵比例等。在進(jìn)行稱量前，首先要把同品種卵混合均勻，然后再進(jìn)行稱量。

保卵組：由于柞蠶卵未完成整個受精過程，所以卵稱量后需要進(jìn)入高溫保卵室，溫度18～20 ℃、相對濕度75%保存24 h，以完成整個受精過程。每日進(jìn)保卵室時間和出保卵室時間都要固定，以保證整個制種期種卵積溫大致相同。待完成24 h保卵后，卵再進(jìn)入溫度5～8 ℃的低溫保卵室進(jìn)行保存。保卵時，將裝卵袋平鋪在繭床上，要求繭床高度相同，保證卵積溫大致相同。

3 結(jié) 語

柞蠶生產(chǎn)制種鏡檢是保證柞蠶生產(chǎn)質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，肉眼選蛾階段僅能淘汰弱蛾，病癥不明顯的微粒子病蛾只能依靠鏡檢才能查出患病個體，進(jìn)而杜絕微粒子病的母體傳染。柞蠶生產(chǎn)制種的制種量較大，鏡檢工作繁重，如何高質(zhì)量完成鏡檢工作，熟練掌握各項工作的操作規(guī)程尤為關(guān)鍵。所以在制種過程中要盡量保證鏡檢工作人員穩(wěn)定，切忌臨時調(diào)換鏡檢人員，任何一個環(huán)節(jié)人員操作不當(dāng)，都可能造成整個鏡檢工作前功盡棄。