吳錫芳 ，汪 勇 ，彭麗莎 ，羅 潔 ，王 楓

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院頭頸外科，云南 昆明 650118;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科，云南 昆明 650032）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是常見(jiàn)頭頸部惡性腫瘤之一，很容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，目前治療主要以放療為主綜合治療。鼻咽癌新生血管在它的發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高表達(dá)可促進(jìn)血管新生，VEGF 高表達(dá)的患者治療后總體生存情況較差，并且更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是促淋巴管生長(zhǎng)因子，VEGF-C 在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮很大的作用，但目前關(guān)于VEGF-C在鼻咽癌輻射敏感性方面報(bào)道很少。

本研究以VEGF-C 作為研究問(wèn)題著眼點(diǎn)，探討VEGF-C 對(duì)鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞小鼠移植瘤輻射敏感性影響及其機(jī)制，以期為鼻咽癌抗VEGFC 治療聯(lián)合放療提供理論支持，也為鼻咽癌患者的治療提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株，CNE-2 細(xì)胞來(lái)源于上海復(fù)旦大學(xué)，培養(yǎng)條件：1 640+10%FBS+1%雙抗+1%谷氨酰胺完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，接種細(xì)胞于6 孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%，按組別進(jìn)行換液，常規(guī)傳代。

1.2 研究方法

1.2.1 質(zhì)粒和siRNA 干擾用銳博human VEGFC siRNA 轉(zhuǎn)染套裝對(duì)CNE-2 細(xì)胞進(jìn)行VEGF-C siRNA 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選出干擾效果最好的siRNA 序 列。VEGF-C siRNA 靶序列如下：siRNA-1，5 ′-GGCTTATGCAAGCAAAGATCTG G-3′；siRNA-2，5′-ACCCAGAATATTGGAAAA TGTAC-3′；siRNA-3，5′-CAGAATATTGGAA AATGTACAAG-3′；NC，5′-UUCUCC GAACG UGUCACGUTT-3′。

CNE-2 細(xì)胞組換液為1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，siRNA NC 對(duì)照組換液為含80 nM NC 的1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；干擾序列換液為含80 nM siRNA 干擾序列的1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，Q-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞VEGFC 的表達(dá)情況，通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)干擾效果最好序列，并采用此序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 定量RT-PCR（qRT-PCR）按Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中獲得的cDNA 為模板，GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照，SYBR? Green PCR Master Mix 用于qPCR 測(cè)定、20 μL PCR 擴(kuò)增體系。反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 免疫印跡分析收到細(xì)胞后，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸干凈，PBS 洗滌2 次，每孔細(xì)胞板，加入300 μL 的RIPA 裂解液（含50 μL 蛋白酶抑制劑），冰盒上裂解5 min，然后用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，將細(xì)胞收集到1.5 mL 離心管中，并加入100 μL SDS 蛋白上樣緩沖液，水浴93 ℃ 10 min，取出后自然冷卻，測(cè)定總蛋白濃度。經(jīng)過(guò)SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜（采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜）。免疫反應(yīng)，將PVDF 膜置于5%的牛血清白蛋白中，室溫（20 ℃～30 ℃）封閉1 h；脫色搖床上，TBST 漂洗3 次，每次5 min；盡量吸干BSA 液，加入一抗（VEGFC 蛋白抗體稀釋比1∶200，GAPDH 蛋白抗體稀釋比1∶3 000）5 mL，裝入雜交袋中，將剪好的PVDF 膜置于其中，捆綁于靜音混合儀上，放置4 ℃冰箱中過(guò)夜；取出雜交袋，室溫復(fù)溫10 min，去除一抗液體，加入TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min；加入酶標(biāo)二抗（兔二抗 1∶3 000，鼠二抗 1∶3 000），室溫孵育2 h。TBST 洗膜3 次，每次10 min。ECL 顯色：用吸水紙盡量吸干PVDF 膜上的水分后，將其平放在采集化學(xué)發(fā)光信號(hào)凝膠成像儀里；吸取ECL 試劑盒中的A 液和B 液各50 μL 加入900 μL 雙蒸水中，混勻，均勻地滴加到膜上；點(diǎn)擊live aquire，開(kāi)始采集圖像。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用CCK-8 溶液測(cè)定細(xì)胞存活率。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清于96 孔板，另按試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置空白孔、對(duì)照孔、陰性組，每組3 孔重復(fù)；向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液；培養(yǎng)箱中孵育24 h，酶標(biāo)儀（美國(guó)MD 公司）450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與照射通過(guò)昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所購(gòu)買(mǎi)周齡均為6 周左右的SPF 級(jí)BALB/C 小鼠用SPF 級(jí)飼料條件飼養(yǎng)，經(jīng)過(guò)1 周時(shí)間待小鼠情況穩(wěn)定后，對(duì)小鼠進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)（合格證號(hào)：1107271911003162）。

照射條件：Synergy VAMT，放射源為6MV X-射線(xiàn)，細(xì)胞單次受照射劑量為2 Gy 源皮距100 cm 照射，劑量率為300 cGy/min。

1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)向小鼠腋下皮下注射鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，每日觀察瘤體生長(zhǎng)情況，待瘤體體積達(dá)到0.7 cm3左右，將小鼠隨機(jī)分為6 組，每組6 只：模型瘤體組為瘤體內(nèi)注射50 μL 生理鹽水連續(xù)注射4 d，然后每3 d 補(bǔ)注射1 次；siRNANC 組，每天注射濃度為50 nM 的siRNA-NC 50 μL，連續(xù)注射4 d，然后每3 d 補(bǔ)注射1 次；siRNAVEGF-C 組，每天注射濃度為50 nM siVEGF-C 50 μL，連續(xù)注射4 d，然后每3 d 補(bǔ)注射1 次；照射組為瘤體內(nèi)注射50 μL 生理鹽水連續(xù)注射4 d，然后每3 d 補(bǔ)注射1 次，同時(shí)每日進(jìn)行2 Gy X 射線(xiàn)照射，連續(xù)照射4 d；siRNA-NC+照射組為瘤體內(nèi)注射siRNA-NC，連續(xù)注射4 d，瘤體每日照射2 Gy，連續(xù)照射4 d，然后每3 d 補(bǔ)注射1 次；照射組+siRNA-VEGF-C，瘤體內(nèi)注射50 nM si-VEGF-C 50 μL，連續(xù)注射4 d，瘤體每日照射2 Gy，連續(xù)照射4 d，然后每3 d 補(bǔ)注射1 次。照射后繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠15 d，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，同時(shí)用游標(biāo)卡尺對(duì)腫瘤體積測(cè)量1 次，V=a2×b/2（a 為瘤體長(zhǎng)徑、b 為瘤體短徑）。15 d 后處死小鼠進(jìn)行瘤體取材，比較腫瘤大小。

1.2.7 小鼠移植瘤組織免疫組化實(shí)驗(yàn)（1）石蠟切片制備 將固定好的組織放入包埋盒中，用乙醇進(jìn)行脫水處理，二甲苯透明，將透明好的組織塊置入在石蠟內(nèi)，讓石蠟易于滲入。將過(guò)濾好的新蠟傾入包埋器中，盡快將浸透蠟的組織塊放到里面。用石蠟切片機(jī)將石蠟塊切成4 μm 厚的切片。進(jìn)行貼片，將完畢的石蠟切片在60 ℃烤箱烘烤過(guò)夜。

（2）免疫組化染色 切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化，用PBS 漂洗，抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫封閉，在用PBS 漂洗，用濾紙將切片周?chē)乃治桑?%羊血清封閉，加合適濃度的第一抗體，反復(fù)用PBST 漂洗，滴加PV9000 試劑Ⅰ、Ⅱ，每張組織切片上滴加DAB 顯色液，室溫避光孵育5 min，蒸餾水沖洗，終止顯色，蘇木素復(fù)染。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察顯色結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.O 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析（one way ANOVA），2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；應(yīng)用ImageJ 軟件做蛋白電泳條帶灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定的沉默VEGF-C 表達(dá)鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2 的建立

將VEGF-C 特異性siRNA 序列（siVEGF-C-1、siVEGF-C-2 和siVEGF-C-3）分別轉(zhuǎn)染到CNE-2細(xì)胞中。采用CCK-8 法、qRT-PCR 法和免疫印跡法檢測(cè)不同siRNA 對(duì)CNE-2 細(xì)胞增殖及VEGFC mRNA 和蛋白表達(dá)的影響。如圖1 所示，干擾CNE-2 細(xì)胞的VEGF-C 后，在0、12、24、36 h后，測(cè)定細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖逐漸下降，其中siVEGF-C-1 組細(xì)胞增殖下降最明顯，見(jiàn)圖A。采用qRT-PCR 法檢測(cè)mRNA 的表達(dá)，3 組序列中，siVEGF-C-1 組mRNA 表達(dá)量最低，siVEGFC-1 組VEGF-C mRNA 與正常組和陰性對(duì)照組比較明顯降低（P＜ 0.01），見(jiàn)圖B。siRNA-1 序列轉(zhuǎn)染CNE-2 細(xì)胞48 h 后，通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)VEGF-C 的蛋白表達(dá)，如圖C 和D 所示，與正常組和陰性對(duì)照組（NC）相比，VEGF-C 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜ 0.01）。結(jié)果表明，采用VEGF-C siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒（RBbio）第1 組序列，進(jìn)行干擾CNE-2 細(xì)胞VEGF-C 能降低VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)，成功干擾鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 中VEGF-C 表達(dá)。

圖1 鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 中VEGF-C 干擾序列篩選Fig. 1 The establishment of VEGF-C silenced NPC cell lines

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾VEGF-C 對(duì)小鼠移植瘤輻射敏感性影響

對(duì)小鼠腋下皮下注射鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，每日觀察瘤體生長(zhǎng)情況，待瘤體直徑達(dá)到0.7 cm3左右，將小鼠隨機(jī)分為6 組，每組6 只。每3 d 觀察腫瘤大小，15 d 后處死小鼠進(jìn)行瘤體取材。收集數(shù)據(jù)繪制腫瘤生長(zhǎng)折線(xiàn)圖，結(jié)果如圖2 所示，si-VEGFC 組腫瘤體積小于si-NC 陰性對(duì)照組和瘤體組；si-VEGFC+照射組腫瘤體積小于單獨(dú)照射組。結(jié)果說(shuō)明：干擾VEGF-C 使腫瘤生長(zhǎng)速度減慢，干擾VEGF-C 可增加輻射敏感性。

圖2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾VEGF-C 對(duì)腫瘤大小影響Fig. 2 Animal experiment to detect the influence of interfering VEGF-C on tumor size n=6。

2.3 采用免疫組化檢測(cè)干擾VEGF-C 對(duì)小鼠VEGF-C、p-65、ATM 影響

剝離小鼠的腫瘤，4%多聚甲醛固定、包埋、切片，進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)VEGF-C、ATM、p65 蛋白表達(dá)變化。如圖3 所示免疫組化結(jié)果表明：在干擾組中，VEGF-C 蛋白表達(dá)明顯少于瘤體組和陰性對(duì)照組（P＜ 0.05），照射組與瘤體組相比VEGF-C 增加（P＜ 0.05）；與照射組相比，干擾組+照射組中VEGF-C 蛋白表達(dá)降低（P＜ 0.05），這表明：干擾組成功降低VEGF-C 表達(dá)，同時(shí)也說(shuō)明輻射可刺激VEGF-C 表達(dá)升高。圖4 所示p65 蛋白表達(dá)，與瘤體組相比，p65 蛋白表達(dá)在干擾組中增加（P＜ 0.05）；但與照射組相比，干擾組+照射組p65 變化不明顯，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明干擾VEGF-C 可增加p65 表達(dá)。圖5 表示ATM 蛋白表達(dá)變化，與瘤體組和陰性組相比，干擾VEGF-C后ATM 表達(dá)減少（P＜ 0.05）；與照射組和陰性對(duì)照組+照射組相比，照射組+干擾組中ATM 減少（P＜ 0.05）。免疫組化結(jié)果表明：干擾鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 中VEGF-C，使p65NF-κB 升 高，NFκB 通路下游ATM 降低。

圖3 免疫組化檢測(cè)VEGF-C 表達(dá)（×400）Fig. 3 Immunohistochemical detection of VEGF-C expression（×400）

圖4 免疫組化檢測(cè)p65 表達(dá)（×400）Fig. 4 Immunohistochemical detection of p65 expression（×400）

圖5 免疫組化檢測(cè)ATM 表達(dá)（×400）Fig. 5 Immunohistochemical detection of ATM expression（×400）

3 討論

目前研究表明鼻咽癌中VEGF 表達(dá)率可達(dá)60%～80%左右，通過(guò)Meta-analysis 分析發(fā)現(xiàn)：組織和血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平的測(cè)定具有重要意義，可預(yù)測(cè)鼻咽癌預(yù)后[3]。鼻咽癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)率比較高，首診患者以頸部腫塊為主要癥狀的多達(dá)40%～50%左右。VEGF 亞型的VEGF-C 是較早發(fā)現(xiàn)能特異性促進(jìn)淋巴管新生的生長(zhǎng)因子[4]。黃方等[5]研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中高表達(dá)的VEGF-C、NF-κB p65 及Survivin 與鼻咽癌的臨床分期及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)VEGF-C、NF-κB p65 及Survivin 表達(dá)水平，可預(yù)判鼻咽癌惡性程度及轉(zhuǎn)移具有一定的意義。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可通過(guò)自分泌和旁分泌形式釋放VEGF-C，與表達(dá)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子3 受體特異性結(jié)合，進(jìn)而刺激下游信號(hào)通路ERKl/2 和P13K/AKT 信號(hào)通路，誘導(dǎo)新生淋巴管和加速腫瘤細(xì)胞往區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[6-7]。

為發(fā)現(xiàn)VEGF-C 更多潛在的功能，本研究使用RNA 干預(yù)技術(shù)，實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)結(jié)果表明：VEGF-C 的mRNA 表達(dá)水平在siVEGF-C 組均顯著下調(diào)；Western Blot 檢測(cè)VEGF-C 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，結(jié)果表明在siVEGF-C 組顯著下調(diào)。證明成功干擾鼻咽癌細(xì)胞 CNE-2 中VEGF-C 基因，可用此技術(shù)研究VEGF-C 與放射敏感性的關(guān)系。

小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，干擾VEGF-C 后，接種了鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞小鼠生長(zhǎng)速度減慢，對(duì)于照射組，干擾+照射組腫瘤明顯變小。15 d 后處死小鼠，通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)，與照射組相比，干擾+照射組，VEGF-C、ATM 減少，與瘤體組相比，干擾組p-65 增加，VEGF-C、ATM 減少。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)和免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 中VEGF-C通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路增加輻射敏感性。這與細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致：在鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞干擾VEGF-C 后，通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路引起ATM減少引起細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)減少，進(jìn)而提高放療敏感性[8]。

Gorski 等[9]研究證實(shí)：Lewis 肺癌細(xì)胞體外接受電離輻射后，VEGF 的表達(dá)明顯增高。這提示電離輻射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞VEGF 高表達(dá)，可能是腫瘤治療過(guò)程中產(chǎn)生抵抗性有關(guān)。有研究證實(shí)VEGFR2 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)高低與其對(duì)放射線(xiàn)抗拒密切相關(guān)，阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGFR2 能提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性[10]。劉亮等[11]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素能增強(qiáng)VEGFR2 高表達(dá)肺癌細(xì)胞放射敏感性，其機(jī)制可能是內(nèi)皮抑素降低VEGFR2 表達(dá)后，通過(guò)PI3K/AKT 和MAPK/ERK 2 條非乏氧途徑下調(diào)HIF-1a 表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放射敏感性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明：抑制鼻咽癌CNE-2 小鼠VEGFC 表達(dá)后，明顯增加輻射敏感性。

放療引起的DNA 損傷可激活NF-κB，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[12]。NF-κB 可以同時(shí)存在促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和抑制轉(zhuǎn)錄的作用，轉(zhuǎn)錄因子究竟發(fā)揮促進(jìn)還是抑制作用，與其結(jié)合的調(diào)控因子有關(guān)，而究竟哪些調(diào)控因子會(huì)一起結(jié)合上去，則與刺激因素有關(guān)[13-14]。NF-κB 作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可與ATM 發(fā)生特異性的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的DNA 損傷。Jung 等[15]研究表明：ATM 能夠激活NF-κB，并影響輻射敏感性，他們數(shù)據(jù)表明，ATM 功能降低通過(guò)激活NF-κB，促進(jìn)放療敏感性。ATM 作為P53 上游基因，P53 蛋白有2 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)被ATM 磷酸化后活性上調(diào)來(lái)調(diào)控DNA修復(fù)，當(dāng)損傷不能被完全修復(fù)，P53 介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)DNA 損傷修復(fù)基因ATM，在siVEGF-C+照射組中，免疫組化表明ATM 表達(dá)下降，導(dǎo)致了細(xì)胞DNA 修復(fù)受損，進(jìn)而使DNA 損傷加重，增加放療敏感性。

綜上所述，在移植鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞小鼠中，干擾VEGF-C 后可明顯提高放療療效，其機(jī)制主要通過(guò)激活NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)而降低ATM 表達(dá)，使DNA 損傷修復(fù)能力下降。本研究結(jié)果為鼻咽癌的抗血管治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，隨著研究不斷深入，相信越來(lái)越多證據(jù)將會(huì)證實(shí)輻射聯(lián)合抗血管治療可提高放療療效。