摘 "要 "透射電子顯微鏡是醫(yī)學院校利用率較高的大型儀器設備之一，由于設備昂貴、對制樣技術要求較高等原因，現(xiàn)主要被用于科研工作。為提高醫(yī)學生的專業(yè)素養(yǎng)和科研能力，在對外開放實驗教學中開展透射電子顯微鏡生物制樣技術的學習，通過課堂示教、集體觀摩等方式，讓學生掌握生物制樣過程、制樣要點、在實際工作中的意義等，為醫(yī)學生步入臨床和科研工作打下基礎，也為大型儀器設備進入醫(yī)學生實驗教學提供經(jīng)驗交流。

關鍵詞 "醫(yī)學生；透射電子顯微鏡；透射電鏡生物制樣技術；實驗教學

中圖分類號：G642.423 " 文獻標識碼：B

文章編號：1671-489X（2022）13-0143-03

0 "引言

隨著我國高等教育的持續(xù)發(fā)展和科技水平的不斷提升，越來越多的大型精密儀器被投入高校和科研院所，其中透射電子顯微鏡在醫(yī)學、材料科學、化工、紡織、物理、生命科學等學科領域發(fā)揮著重要作用。透射電子顯微鏡簡稱透射電鏡，是人們探究微觀世界的大型儀器之一。

1 "我國電子顯微鏡的發(fā)展

我國電子顯微鏡的研制開始于20世紀50年代，第一臺中型透射電鏡于1958年由中國科學院長春光學精密機械與物理研究所研制成功，分辨率為10 nm，加速電壓50 kV，是當時我國的重大科技成果。1959年，大型透射電鏡研制成功，性能進一步提高，放大倍數(shù)10萬倍，加速電壓達到100 kV，分辨率

2.5 nm。1980年研制的DX-4透射電鏡，分辨率已達到0.3 nm，放大倍率為60萬倍[1-2]。隨著技術水平的不斷提高，現(xiàn)在的透射電鏡分辨率已達0.1～

0.3 nm，最大放大倍率達到150萬倍以上。目前電鏡的種類，除了常見的透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）外，還有超高壓電鏡（UVEM）、反射式電鏡（REM）和分析電鏡（AEM）等。電鏡迅速發(fā)展的同時，電鏡技術也得到不斷發(fā)展，在常規(guī)超薄切片技術的基礎上出現(xiàn)冷凍復型技術、電鏡細胞化學技術、免疫電鏡技術、負染色技術、電鏡放射自顯影技術、冷凍制樣技術[3]等，由此也推動多學科發(fā)展。

2 "透射電鏡生物制樣技術實驗教學內容

通過學院教務系統(tǒng)申報透射電鏡生物制樣技術實驗教學的上課時間和學生數(shù)（為保證實驗教學質量，限制20人之內），由學生自愿申報，學生負責人聯(lián)系教師，報告具體人數(shù)和學生名單。授課教師帶領學生參觀透射電鏡實驗室，向學生介紹透射電鏡的發(fā)展現(xiàn)狀、設備構造、工作原理、主要參數(shù)以及應用領域等相關理論知識，介紹生物制樣技術在科研工作中發(fā)揮的作用以及在臨床中對疾病診斷、鑒別診斷的意義；列舉科研工作中的制樣經(jīng)驗，引入一些經(jīng)典的透射電鏡照片，使講解更生動。在學習生物制樣技術前，把包埋模具、銅網(wǎng)、鉆石刀、重金屬染色劑（鈾和鉛）等制樣工具和試劑介紹給學生，使學習內容由淺入深。透射電鏡生物制樣技術包括取材、固定、梯度脫水、浸透、包埋、聚合、修塊、切片和染色等步驟，由于操作過程煩瑣和制樣時間所限（通常7～10天完成），制樣過程由教師分步驟示教講解操作要點。制作透射電鏡超薄切片需要注意以下幾點。

1）取材遵循五字原則，即快、小、冷、凈、準?？欤航M織離體后盡快進入固定液，避免細胞內溶酶體膜破裂，組織自溶。?。?.5%戊二醛固定液滲透速率較慢（僅為0.5 mm/h）[4]，為使固定液迅速浸入細胞和組織間隙，組織標本的取材大小應為

1 mm3。冷：取材過程在冰盒上進行，冷的環(huán)境可以降低各種酶的活性，使超微結構保持原有狀態(tài)。凈：用緩沖液沖洗組織標本表面，避免殘留血液、黏液等，影響實驗結果。準：取材的位置要求定位和定向準確，避免重切重染增加工作量，對于珍貴的組織標本，無法重現(xiàn)相同結構，將造成重大損失。注意某些組織具有方向性，比如腸道、皮膚、氣管、血管、神經(jīng)、眼組織等，取材時注意區(qū)分。

2）特殊組織固定需要注意：腦對缺氧較敏感，需要先灌流固定再取材；管狀組織取0.5 cm左右長軸方向固定；肺組織密度小，用紗布包裹后放入固定液即可下沉；視網(wǎng)膜易脫離、皺褶，應先灌流固定，再剪開角膜注入固定液[5]；睪丸白膜下面是精曲小管，常規(guī)取材易散開，應在白膜上面劃若干小口，固定一段時間后再取材；細菌和細胞取材3×106～5×106即可，吸管吹散使充分接觸固定液，自然沉降切勿離心。

3）前固定是2.5%戊二醛，固定時間至少四小時；經(jīng)過充分浸洗，浸入后固定液1%鋨酸中，后固定時間因不同組織而異，一般不超過兩小時。

4）梯度脫水時間要充分，組織在包埋劑中浸透最好過夜。

5）獲得連續(xù)切片的關鍵之一是修塊，使包埋塊切面成正方形、長方形或者梯形，且邊角銳利。

6）超薄切片厚度60～90 nm為宜，此厚度在切片機鏡下呈銀鏡樣反射。鉆石刀價格昂貴，應在熟練操作玻璃刀的基礎上謹慎對刀，防止碰撞。

7）染色是重點環(huán)節(jié)，鈾染液需靜置取上清，鉛染液要過濾，整個染色過程要避光，減少暴露空氣的機會，避免出現(xiàn)染色液污染。組織超薄切片制作完成，由指導教師開機上樣，學生實地觀摩學習，結合透射電鏡下組織超微結構圖像，教師邊講解邊提問，既學習新知識，又回顧書本上的內容，引導學生不斷探索生命的奧秘。

3 "醫(yī)學生學習透射電鏡生物制樣技術的必

要性

3.1 "學習透射電鏡生物制樣技術課的思路

透射電鏡為大型精密儀器，價格昂貴，操作復雜，導致多數(shù)高校只將其用于科研工作，極少在實驗教學中面向學生開放，學生對其知之甚少，或者只在書本上有大概了解，沒有實踐學習的機會。為使其能在高?？蒲泻徒虒W中發(fā)揮作用，體現(xiàn)價值[6]，學校建立對外開放實驗教學平臺。學生通過書本上透射電鏡生物制樣技術的文字和圖片介紹，在頭腦中形成的是抽象的概念，對內容的理解也是膚淺的，對生物制樣的過程沒有直觀感受，導致學習的興趣和積極性不高。開設透射電鏡生物制樣技術實驗教學，可以通過教師現(xiàn)場講授和學生觀摩學習的方式，拉近學生與設備的距離，也拉近理論與臨床實踐的距離，使科教臨相互滲透，讓學生對透射電鏡制樣技術的方法、應用和意義等有比較全面的掌握，加深印象，牢記所學知識點。

目前，多數(shù)高校在透射電鏡授課方面對設備工作原理、構造與操作等講授比較多，對制樣技術沒有提及或涉及較少。由于透射電鏡是形態(tài)學研究的精密儀器之一，對于醫(yī)學生來說，組織結構的觀察辨識是醫(yī)學基礎課，學習生物制樣技術可讓他們看到光鏡下所看不到的結構，極大地拓寬視野[7]和專業(yè)知識，幫助其掌握制樣過程的細節(jié)和注意事項，不僅知其然，而且知其所以然。對樣品超微結構的觀察和研究，不僅要有分辨率精準的設備，更要有制備樣品所用的各種技術方法，兩者相輔相成，缺一不可，為此開設透射電鏡生物制樣技術課程。

3.2 "學習透射電鏡生物制樣技術的意義

通過學習透射電鏡生物制樣技術，學生不僅可以掌握超薄切片的制備方法，而且可以學習如何從這些超微結構中發(fā)現(xiàn)組織病理的改變，進而對疾病的鑒別診斷給出正確結論，從而不斷提升專業(yè)修養(yǎng)，增強為患者服務的本領。學生可以在計算機上看到組織超微結構圖像，從觀察細胞器開始，培養(yǎng)探索生命和疾病本質的興趣，激發(fā)從醫(yī)的信心和立志為患者解除病痛的決心。

學習透射電鏡生物制樣技術可以強化課堂理論學習，同時使各個相關學科知識點融會貫通，提高學生學習的積極性，培養(yǎng)其學習熱情。在實際工作中，大部分科研人員和臨床醫(yī)生不能親自完成生物制樣，通常由專業(yè)的實驗技術人員完成。醫(yī)生的職業(yè)特點要求他們終身學習，掌握全面的醫(yī)學相關知識。因此，醫(yī)學生開展透射電鏡生物制樣技術的學習，既可以啟發(fā)興趣、拓展知識面，激發(fā)主動學習的意識，增強救死扶傷的本領，也有助于養(yǎng)成良好的科學研究思維和素養(yǎng)。

透射電鏡生物制樣過程中的每一步驟都需要細致入微，認真對待，任何的失誤都會造成制樣失敗。因此，在實驗教學中應注意啟發(fā)學生熱愛醫(yī)學、尊重生命，積極探索微觀世界，樹立嚴謹?shù)目蒲凶黠L和醫(yī)者的責任感。

醫(yī)學生在基礎醫(yī)學學習階段應多學習與臨床和科研相關的實驗技術，掌握臨床病理診斷和科研工作的前沿技術方法，為將來進入工作崗位打下堅實基礎。透射電鏡超薄切片也是臨床某些疾病病理診斷的黃金指標，醫(yī)學生能從形態(tài)學角度分析病情，是加強專業(yè)學習的關鍵。

深入學習透射電鏡生物制樣技術是醫(yī)學生增強本領的需要，是理論與實踐相結合的需要，是拓展專業(yè)知識的需要，更是提高臨床技能和科研實驗能力的需要。要培養(yǎng)醫(yī)學生的動手能力、思考能力，提高實驗操作技能，啟發(fā)探索微觀世界的興趣，同時引導他們無論將來從事臨床工作還是科研工作，務必求真，務必尊重科學。透射電鏡技術的進步大大加深人類對生命科學的認識，從宏觀世界到微觀世界，從細胞水平進入分子水平，從分子水平再到原子水平，透射電鏡在醫(yī)學領域發(fā)揮了革命性的作用。讓透射電鏡生物制樣技術走進醫(yī)學院校課堂是時代所需[8]，是醫(yī)學生扎實學習醫(yī)學基礎知識的需要，是他們提高專業(yè)本領的要求，而掌握透射電鏡生物制樣技術是醫(yī)者的使命擔當，更是他們的職業(yè)所必須。

3.3 "透射電鏡生物制樣技術在臨床醫(yī)學中的應用

透射電鏡生物制樣技術在臨床各種疾病的早期診斷、鑒別診斷、預后和治療監(jiān)測過程中具有重要意義。遺傳性疾病和代謝異常導致的疾病，其光鏡切片并不能在早期觀察到細胞器結構的改變。如先天的肝臟代謝異常，應用透射電鏡觀察線粒體在早期的病理變化對診斷有很高價值。有些腎病，比如免疫復合物性腎炎、膜性腎炎等，光鏡下無明顯結構改變，免疫熒光有時定位不準或抗體效價降低，只能通過透射電鏡觀察超微結構中上皮細胞、系膜、肌膜細胞和間質改變，明確腎小球內電子致密沉積物的精確定位等來確診[9]。各種早期腫瘤篩查，通過尋找組織細胞的分化標記，確診和鑒別腫瘤類型。如急性髓系白血病的診斷分型，通過透射電鏡觀察細胞核和線粒體的結構、形態(tài)變化，可以提高鑒別能力，分型效果具有明顯優(yōu)勢[10]。病毒性疾病的鑒別診斷，常用透射電鏡負染技術，負染色的特點是反差強，可以看到病毒亞單位結構、細菌和支原體的超微結構等，它也是病毒性致病因子的快速診斷方法之一[11]，能夠發(fā)現(xiàn)和識別病毒，為病毒的分類、病毒復制過程、病毒與宿主之間的關系等提供直觀圖像依據(jù)。

透射電鏡技術與免疫學技術相結合形成免疫電鏡技術，通過標記物可以精確定位和檢測細胞表面和細胞內部的抗原、抗體。有些腎病單靠透射電鏡不能確診，比如lg A腎病合并膜性腎炎，用膠體金標記特異性抗體lg A和lg G，通過觀察腎小球上皮下和系膜區(qū)免疫復合物沉積分布情況和電子致密物的成分，確定腎病的分型[12]。

透射電鏡生物制樣技術的不斷發(fā)展，使其被廣泛應用到臨床醫(yī)學和基礎醫(yī)學的各個方面，為醫(yī)學基礎研究提供更多的研究手段，為疾病診斷提供可靠依據(jù)。

4 "結束語

醫(yī)學生通過透射電鏡生物制樣技術的學習，認識到制樣技術的重要性：在臨床上是發(fā)現(xiàn)和診斷某些疾病的重要手段，在科研中是認識物質世界的重要工具，是發(fā)現(xiàn)結構與功能之間關系的基本方法。制樣技術是動手性極強的形態(tài)學研究手段，能開闊學生專業(yè)知識視野，同時幫助學生養(yǎng)成認真細致和尊重客觀事實的工作態(tài)度。由于受制樣時間、課時和所用試劑稀缺等因素影響，目前透射電鏡生物制樣技術課程內容還不能完全在臨床醫(yī)學的各個專業(yè)開設，學生無法親自完成制樣。隨著計算機的發(fā)展，期待未來可以有透射電鏡生物制樣技術的虛擬仿真系統(tǒng)，使生物制樣過程變得生動形象，同時能對學生制樣的效果進行評價和打分，徹底解決生物制樣實驗教學中學生只看不做的問題。

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