徐來仙， 姚 蘭， 周大寨， 郭秋菊， 朱 江， 鄧 楚， 艾 鑫， 夏煜軒

(湖北民族大學(xué) 林學(xué)園藝學(xué)院， 湖北 恩施 445000 )

化感物質(zhì)主要是通過植物分解、根際分泌、雨水淋溶和揮發(fā)等方式釋放到環(huán)境中的水溶性物質(zhì)(Rice, 1984；Kimura et al., 2015)，其中凋落物是林木化感物質(zhì)的重要來源之一，其在分解過程中釋放內(nèi)含物質(zhì)或轉(zhuǎn)化為次生物，從而對種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生影響，進(jìn)而成為林木天然更新障礙的關(guān)鍵因素之一(Caviers et al., 2007；Muturi et al., 2017；Aguilera et al., 2017)。凋落物化感作用的濃度效應(yīng)主要表現(xiàn)為對植物種子發(fā)芽及幼苗生長的“低促高抑”雙重效應(yīng)(李登武等，2010；莊正等，2017)，或隨濃度升高而抑制增強(qiáng)的“抑制效應(yīng)”，從而導(dǎo)致其天然更新出現(xiàn)障礙(張珊珊等，2016；郭曉燕等，2019)。不同部位、分解階段凋落物也具有不同的化感效應(yīng)(Fernandez et al., 2006；Huang et al., 2019)。

水杉(Metasequoiaglyptostroboides)為柏科(Cupressaceae)水杉屬(Metasequoia)孑遺植物，是植物界的“活化石”，為中國特有，屬國家Ⅰ級保護(hù)樹種?，F(xiàn)存水杉原生母樹僅分布于湖北省利川市、湖南省龍山縣和重慶市石柱縣之間狹窄的三角區(qū)域內(nèi)，僅存5 696株。水杉原生母樹周邊林下及利川市小河水杉母樹管理站、利川市林業(yè)科學(xué)研究所人工營造的35～42 a生水杉無性系種子園中，均很難發(fā)現(xiàn)有天然更新的水杉幼苗及幼樹存在(林勇等，2017)。這一現(xiàn)象引起學(xué)術(shù)界對水杉天然更新障礙及更新繁育的極大關(guān)注。許多專家學(xué)者從水杉生長環(huán)境與干擾(胡先骕和鄭萬鈞，1948；林勇等，2017；陳俊等，2020)、種群與遺傳結(jié)構(gòu)(黃小等，2020；劉小紅，2020)、交配與擴(kuò)散格局(陳文文，2016)等方面進(jìn)行了探索，另外也從水杉更新繁育方面進(jìn)行了大量研究，如水杉原生母樹個(gè)體及種子種源差異(吳漫玲等，2020)、溫度(辛霞等，2004)、光照(郭秋菊等，2018)、水分(Fan et al., 2020)、硒元素(郭秋菊等，2018)、整地覆土(李淑嫻等，2012)等對水杉種子萌發(fā)的影響。但是，目前水杉天然更新困難的機(jī)制仍不完全明確。

通過對水杉母樹主要分布區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，水杉林下有大量凋落物，僅偶見1～2株水杉幼苗。木本植物種群的天然更新是在自然力作用下，新個(gè)體不斷產(chǎn)生而使種群得以繁衍和擴(kuò)大的重要方式，而種子萌發(fā)和早期成苗階段是植物天然更新最關(guān)鍵的兩個(gè)階段，這兩階段又受林下凋落物產(chǎn)生化感作用的影響(Aliskan et al., 2015)，并且化感效應(yīng)在不同階段隨著釋放的化感成分變化而變化(Fernandez et al., 2008)。水杉母樹周圍累積的凋落物所產(chǎn)生的化感作用是否會成為水杉天然更新障礙的因素，為此，本研究針對不同類型水杉母樹凋落物設(shè)置不同濃度的水浸提液對水杉種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，以探究水杉凋落物化感作用對水杉種子萌發(fā)與生長的影響，為進(jìn)一步查明水杉天然更新困難障礙提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子和凋落物的收集與處理

試驗(yàn)所用水杉種子為2020年11月從水杉原生母樹1 076號(樹齡118 a，樹高31 m，胸徑87.6 cm，生長地理位置為108°35′45.1″ E、30°07′20.5″ N，海拔1 114 m)采集。種子含水量為9.78%± 1.13%，千粒重為(2.57±0.17) g。

為保證收集凋落物的代表性，在湖北省利川市林業(yè)科學(xué)研究所水杉種子園內(nèi)按東南西北中五個(gè)方向分30個(gè)區(qū)域隨機(jī)布設(shè)凋落物收集框采集。2020年10月末，采集水杉母樹上自然脫落的當(dāng)季凋落物為新鮮凋落物，即尚未進(jìn)入分解過程，包括葉、枝、果、皮等混合物；2020年11月末，收集水杉林內(nèi)地表的凋落物為自然凋落物，包括未分解層、半分解層和全分解層枝葉果皮等的混合物。所有采集回來的凋落物通過室溫風(fēng)干后，分別進(jìn)行相應(yīng)處理。

1.2 方法

1.2.1 凋落物水浸提液制備 首先，將新鮮凋落物和自然凋落物分別風(fēng)干、粉碎(過100目篩)，以蒸餾水為溶劑，按料液比1∶5加入蒸餾水，于室溫條件下振蕩48 h；然后，10 000 r·min-1離心10 min，其上清液即為200 g·L-1的母液，分別為新鮮凋落物浸提液(標(biāo)記為FL)、自然凋落物浸提液(標(biāo)記為NL)；最后，均放入冰箱-18 ℃中保存。

1.2.2 種子萌發(fā)和生長試驗(yàn) 對FL、NL均設(shè)置8種濃度：200、100、50、20、10、5、2、1 g·L-1，以蒸餾水為對照(CK)，共17個(gè)處理，每處理3次重復(fù)。取籽粒飽滿的水杉種子均勻排列于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(Φ 9 cm，使用前于180 ℃消毒2 h)中，每皿50粒，分別加入4 mL相應(yīng)浸提液，置20 ℃(參考國家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)中心利川市四、五月的平均氣溫，為20 ℃)全黑暗(辛霞等，2004；郭秋菊等，2018)的SPX-30085H-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，每3 d更換濾紙并添加4 mL的對應(yīng)處理液以保證浸提液濃度。自水杉種子置床開始，每隔 24 h 觀察記錄發(fā)芽情況，以胚根出現(xiàn)為萌發(fā)標(biāo)志。待種子發(fā)芽后在每個(gè)試驗(yàn)單元隨機(jī)抽取10粒種子測量芽長，記錄測量直至所有種子發(fā)芽完成，約20 d后測定其胚軸(子葉著生點(diǎn)到主根的一段距離)長度和主根(由胚根發(fā)育而成的根)長度(強(qiáng)勝，2005)。根據(jù)發(fā)芽情況計(jì)算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，根據(jù)種子發(fā)芽以及芽、根的生長情況計(jì)算化感效應(yīng)敏感指數(shù)(allelopathy sensitivity index，RI)和化感綜合效應(yīng)指數(shù)(Synthetical effect of allelopathy index，SE)，其計(jì)算公式如下。

式中：Ga為正常發(fā)芽的種子數(shù)；Gt為供試種子數(shù)。

式中：Gmax為發(fā)芽數(shù)最多日的發(fā)芽種子數(shù)；Gt為供試種子數(shù)。

式中：Gp為與Gd相對應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)；Gd為發(fā)芽天數(shù)。

(4) 化感效應(yīng)敏感指數(shù)(RI)(Williamson & Richardson，1988)：

式中：C為對照值；T為處理值；RI>0為促進(jìn)，RI<0為抑制，RI絕對值的大小與作用強(qiáng)度一致。

(5) 化感綜合效應(yīng)指數(shù)(SE)反映化感效應(yīng)的強(qiáng)弱，是指同一處理下對同一受體各測試項(xiàng)目RI的算術(shù)平均值，即

SE=(發(fā)芽率RI+發(fā)芽勢RI+發(fā)芽指數(shù)RI+芽長RI+胚軸RI+主根RI)/ 6。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 對不同濃度FL、NL處理下水杉種子萌發(fā)和生長進(jìn)行方差分析及多重比較(Duncan)；使用SPSS 18.0軟件對不同處理下水杉種子芽長的生長變化進(jìn)行Logistic模型擬合和計(jì)算生長參數(shù)(楊志玲等，2011；吳漫玲等，2020)，即最大線性生長速率(maximum linear growth rate，MGR，即連日生長量最大時(shí)的生長速率)、線性生長速率(linear growth rate，LGR，即線性生長期內(nèi)的平均生長速率)、線性生長量(total linear growth，TLG，即線性生長期內(nèi)的生長量)和線性生長量占總線性生長量的百分率。具體計(jì)算公式如下。

Logistic模型擬合方程：

式中：y為芽長累計(jì)生長量；k表示擬合芽長的生長極限值；t為生長時(shí)間；a和b為待定系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 凋落物浸提液對水杉種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，不同類型的凋落物浸提液處理后水杉種子萌發(fā)指標(biāo)呈現(xiàn)一定差異性。不同濃度FL對種子發(fā)芽指數(shù)有顯著影響(P<0.05)，對發(fā)芽率和發(fā)芽勢則影響不顯著(P>0.05)。FL處理后，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)隨著濃度升高呈現(xiàn)波動變化且均在50 g·L-1處理時(shí)最高；而在1 g·L-1處理時(shí)發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著比CK分別減少36.842%、32.677%。不同濃度NL對發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)影響不顯著(P>0.05)，在1 g·L-1處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)均高于CK，其中發(fā)芽勢(36%)顯著比10 g·L-1高2.349倍?？傮w來看，在FL濃度為50 g·L-1時(shí)對水杉種子萌發(fā)有一定促進(jìn)作用，而在1、100、200 g·L-1時(shí)則有一定抑制作用；NL處理下，當(dāng)濃度為1 g·L-1時(shí)顯示一定促進(jìn)作用，而5、10、200 g·L-1則抑制種子萌發(fā)。

同一類型凋落物的不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。下同。Different lowercase letters of the same type of litter indicate significant differences (P<0.05). The same below.圖 1 水杉凋落物浸提液對自身種子萌發(fā)的影響Fig. 1 Influence of Metasequoia glyptostroboides litter extract on its own seed germination

2.2 凋落物浸提液對水杉種子生長的影響

2.2.1 凋落物浸提液對3個(gè)種子生長指標(biāo)的影響 由圖2可知，不同濃度FL對芽長、胚軸長和主根長影響極顯著(P<0.01)，并且所有經(jīng)過FL處理的種子生長的3個(gè)指標(biāo)值均小于CK。當(dāng)濃度高于10 g·L-1時(shí)，隨著濃度的升高，各指標(biāo)值下降程度越大；當(dāng)?shù)陀诖藵舛葧r(shí)，3個(gè)種子生長指標(biāo)值呈現(xiàn)波動變化。不同濃度NL對芽長和主根長有極顯著影響(P<0.01)，對胚軸長影響顯著(P<0.05)，并且這3個(gè)種子生長指標(biāo)均在CK處理時(shí)為最大值(45.000、11.767、28.867 mm)，其次為10 g·L-1，并且濃度高于10 g·L-1時(shí)，各生長指標(biāo)值隨濃度升高逐步降低；在1～5 g·L-1范圍內(nèi)，芽長和胚軸長呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，主根長則表現(xiàn)為先降低再升高，這表明隨著浸提液濃度的增加，種子生長表現(xiàn)出一定的濃度梯度抑制作用。經(jīng)過FL和NL處理后，不同類型不同濃度的凋落物浸提液均對水杉種子萌發(fā)后的生長呈現(xiàn)出一定的抑制作用，當(dāng)濃度高于20 g·L-1時(shí)，其抑制程度尤為顯著。

圖 2 水杉凋落物浸提液對自身種子生長的影響Fig. 2 Influence of Metasequoia glyptostroboides litter extract on its own seed growth

2.2.2 凋落物浸提液對芽生長進(jìn)程的影響 水杉種子的芽長在試驗(yàn)期間的生長表現(xiàn)為開始較為緩慢，之后較迅速，達(dá)到一定值后，又趨于緩慢，直至生長停止?？梢?，芽長的生長變化符合“S”型生長曲線特點(diǎn)，故采用Logistic模型擬合。由表1可知，F(xiàn)L和NL處理下種子芽長Logistic擬合方程的決定系數(shù)為0.988～0.998，均達(dá)到了極顯著相關(guān)水平。隨著2種凋落物浸提液濃度的增加，芽長的生長曲線越平緩，芽長進(jìn)入線性生長期的時(shí)間越晚(圖3)。當(dāng)浸提液濃度達(dá)到100、200 g·L-1時(shí)，F(xiàn)L處理下芽長的生長曲線明顯低于NL處理下的生長曲線，說明高濃度下FL對芽長生長進(jìn)程的抑制作用更明顯。由表2可知，F(xiàn)L和NL處理后，水杉種子芽長MGR和LGR均隨著濃度的增加逐漸下降，1～5 g·L-1時(shí)高于CK，而當(dāng)濃度增加到50 g·L-1及以上時(shí)，MGR和LGR均小于CK；TLG均小于CK，除2、5 g·L-1處理外，其余處理均隨著濃度的增加而逐漸降低；線性生長量占總生長量的百分率為55.263%～64.683%。

表 1 不同濃度凋落物浸提液處理水杉種子芽長生長曲線方程的擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of shoot length growth curves equation of Metasequoia glyptostroboides seeds treated with different concentrations of litter extract

表 2 不同濃度凋落物浸提液處理水杉種子芽長的生長參數(shù)Table 2 Growth parameters of shoot length of Metasequoia glyptostroboides seeds treated with different concentrations of litter extracts

圖 3 不同濃度凋落物浸提液對水杉種子芽長生長曲線的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of litter extracts on shoot length growth curves of Metasequoia glyptostroboides seeds

2.3 凋落物浸提液對水杉的化感效應(yīng)評價(jià)

由表3可知，F(xiàn)L處理后，種子萌發(fā)指標(biāo)的化感效應(yīng)敏感指數(shù)(RI)在1～5 g·L-1和100～200 g·L-1處理時(shí)為負(fù)數(shù)，即表現(xiàn)為抑制作用，其中1 g·L-1對種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的抑制最強(qiáng)，200 g·L-1對發(fā)芽指數(shù)抑制最強(qiáng)，而10～50 g·L-1有不顯著的促進(jìn)作用。NL在1、2 g·L-1濃度處理時(shí)，種子萌發(fā)指標(biāo)的RI為正值，即有一定促進(jìn)作用，在此之后，隨著濃度的升高，表現(xiàn)為無顯著促進(jìn)作用和抑制作用。FL和NL處理對水杉種子芽長、胚軸長和主根長均有抑制作用，在濃度≥10 g·L-1時(shí)，濃度越高抑制作用越強(qiáng)，同時(shí)對主根長的抑制作用高于胚軸長和芽長。

為綜合分析凋落物浸提液對水杉種子萌發(fā)和生長的化感效應(yīng)，進(jìn)行化感效應(yīng)綜合指數(shù)(SE)計(jì)算，結(jié)果見表3。FL各濃度均抑制種子萌發(fā)和生長(-0.001～0.562)，抑制作用表現(xiàn)為1～10 g·L-1范圍內(nèi)逐漸下降，10～50 g·L-1則為先上升再下降的趨勢，100～200 g·L-1抑制最強(qiáng)；NL對水杉種子萌發(fā)和生長的影響為“低促高抑”的雙重效應(yīng)，1 g·L-1時(shí)為一定促進(jìn)作用(0.044)，濃度高于1 g·L-1時(shí)為抑制作用，并且濃度越高抑制越強(qiáng)。綜合來看，F(xiàn)L對水杉種子萌發(fā)和生長的抑制強(qiáng)度大于NL，并且不同濃度呈現(xiàn)出不同的抑制效果。

表 3 水杉凋落物浸提液對自身種子萌發(fā)和生長的化感效應(yīng)敏感指數(shù)和化感綜合效應(yīng)指數(shù)的影響Table 3 Allelopathy sensitivity index and synthetical effect of allelopathy index of Metasequoia glyptostroboides litter extracts on its own seed germination and growth

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)是植物生活史的重要階段，并且顯著地受到凋落物的化感效應(yīng)影響，從而影響種群的建立和更新(劉芳黎等，2017)。本研究證實(shí)水杉凋落物對水杉種子的萌發(fā)與生長有一定程度的抑制作用， 說明水杉母樹凋落物對該種群的天然更新存在一定化感效應(yīng)。新鮮凋落物浸提液在極低濃度(1 g·L-1)時(shí)阻礙種子發(fā)芽，這與Macias(1995)的研究一致，可能是新鮮凋落物中含有萘類、酯類、醇類等化感物質(zhì)，干擾種子內(nèi)部物質(zhì)的代謝，抑制細(xì)胞分裂、伸長及膜滲透性等，進(jìn)而阻礙種子萌發(fā)，因此表現(xiàn)出低濃度對種子萌發(fā)具有強(qiáng)烈抑制作用。但是，究竟是哪種化感物質(zhì)起作用還有待進(jìn)一步研究。高濃度(100、200 g·L-1)處理的新鮮凋落物浸提液對水杉種子萌發(fā)和生長均有一定抑制作用，這與晉夢然等(2020)研究格氏栲(Castanopsiskawakami)未分解層浸提液在高濃度時(shí)抑制杉木(Cunninghamialanceolata)種子發(fā)芽的結(jié)果一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是，隨著化感物質(zhì)在高濃度下積累到一定程度，會導(dǎo)致細(xì)胞器受到破壞(Mahdavikia et al., 2017)，從而影響植物對水分和礦物質(zhì)吸收利用，致使種子萌發(fā)和生長受到限制。水杉自然凋落物浸提液對水杉種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)影響不顯著，除了濃度為1 g·L-1時(shí)呈現(xiàn)一定的促進(jìn)作用外，其余均為抑制作用，并且在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高濃度的自然凋落物浸提液會延遲種子萌發(fā)。Garnett等(2004)研究發(fā)現(xiàn)新澤西州剛松、美洲越橘(Gaylussaciabacatta)和美國白櫟(Quercusalba)3種主要樹種的凋落物均對新澤西州剛松的種子發(fā)芽無影響，這主要是因?yàn)樽匀坏蚵湮锸芡寥乐形⑸?、風(fēng)化、淋溶等作用的影響，導(dǎo)致其化感物質(zhì)活性有一定降低(Araniti et al., 2016)，化感作用也隨之減弱。

幼苗階段在植物整個(gè)生活史中至關(guān)重要，而芽是從種子到早期幼苗建成的最初階段，其會受到眾多因素的影響(藺吉祥等，2011)。水杉新鮮和自然凋落物浸提液均抑制芽長、胚軸長和主根長，尤其是濃度高于20 g·L-1時(shí)極不利于種子萌發(fā)后的生長，這與毛紅椿(Toonaciliatavar．pubescens)凋落葉水浸液對毛紅椿幼苗生長抑制作用相同(郭曉燕等，2019)。植物凋落物釋放的化感物質(zhì)能夠破壞內(nèi)根組織、抑制根毛形成(Aguilera et al., 2017)，降低對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，阻礙有機(jī)物質(zhì)的迅速積累，從而導(dǎo)致水杉種子生長受到明顯抑制，最終影響水杉幼苗在種群中的存活力和競爭能力，這在一定程度上阻礙了水杉種群天然更新。本研究發(fā)現(xiàn)，水杉凋落物浸提液濃度對主根長的抑制作用高于胚軸長和芽長的抑制作用，這也進(jìn)一步證實(shí)了Chon等(2002)的研究結(jié)果，即苜蓿(Medicagosativa)根系比種子萌發(fā)率和胚軸長對化感自毒物質(zhì)的反應(yīng)更敏感。由于種子發(fā)芽后由主根直接向外界汲取生長所需能量，因此根是最先受到影響且影響程度比其他部分更加顯著(張志忠等，2013)。

“S”型生長曲線描述某一種群受空間約束的生長過程(盧恩雙等，2002)，本研究發(fā)現(xiàn)，水杉種子芽長的生長動態(tài)變化也符合“S”型生長曲線(R2≥0.988)，并且低濃度(≤20 g·L-1)凋落物浸提液在一定程度上促進(jìn)芽的生長速率，而中高濃度則抑制芽的生長。這是由凋落物化感作用的濃度依賴性造成的，低濃度作用下誘導(dǎo)植物產(chǎn)生耐受蛋白、采取快速生長等方式以應(yīng)對不良環(huán)境，當(dāng)濃度超過植物自我調(diào)節(jié)能力的閾值時(shí)，其受到的化感抑制作用更明顯 (Craine & Dybzinski, 2013)。

此外，芽長在試驗(yàn)生長周期內(nèi)的線性生長量占總生長量的百分率在55%以上，進(jìn)一步證實(shí)無論是在何種條件下線性生長期都是水杉生長過程中的關(guān)鍵時(shí)期(吳漫玲等，2020)。

化感效應(yīng)敏感指數(shù)是衡量化感作用強(qiáng)度的重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)新鮮和自然凋落物浸提液對種子萌發(fā)后生長的影響大于對種子萌發(fā)的影響。一方面是因?yàn)檠颗c化感物質(zhì)直接接觸，且接觸的時(shí)間最長，化感抑制作用表現(xiàn)明顯；另一方面，由于種子擁有種皮、種翅等保護(hù)作用，導(dǎo)致其對化感作用的響應(yīng)有一定程度的滯后(Devaney et al., 2018)。不同類型不同濃度的凋落物浸提液對林木種子萌發(fā)和生長的影響不同，化感綜合效應(yīng)指數(shù)顯示水杉新鮮凋落物浸提液對水杉種子萌發(fā)和生長的抑制強(qiáng)度大于自然凋落物浸提液，這與郭曉燕等(2018)和劉芳黎等(2017)的研究結(jié)果一致，均表明新鮮凋落物抑制作用大于自然凋落物，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是凋落物在不同分解階段產(chǎn)生的化感物質(zhì)種類或含量不同，從而造成化感效應(yīng)的差異化。本研究所有結(jié)果是在室內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件下得出，存在一定局限性，需要結(jié)合田間試驗(yàn)進(jìn)一步探討、驗(yàn)證水杉凋落物對水杉天然萌發(fā)與更新的影響機(jī)制。此外，天然更新受到復(fù)雜自然環(huán)境(溫度、光照、水分、凋落物等)、人為因素(采種、干擾等)和物種自身特性(種子活力、種源、繁殖特性、遺傳種群結(jié)構(gòu)等)等多因素影響，如何有效促進(jìn)水杉天然更新還需進(jìn)一步綜合研究。

種子萌發(fā)和早期生長是天然更新的重要階段，本研究發(fā)現(xiàn)水杉新鮮和自然凋落物水浸提液均對自身種子萌發(fā)和生長產(chǎn)生了化感作用，并且總體表現(xiàn)為一定的抑制作用，驗(yàn)證了水杉凋落物的化感作用是影響水杉天然更新的障礙因素之一。由于水杉每年落葉時(shí)間剛好在球果成熟前后，因此今后在水杉母樹保護(hù)與繁育管理中，建議在種子雨高峰期前適當(dāng)清理水杉凋落物，以避免化感物質(zhì)富積，為種子萌發(fā)和幼苗生長提供適宜環(huán)境，從而促進(jìn)水杉種群天然更新。