吉浴芳, 宋松泉, 田向榮, 高家東, 戴嘉興, 劉 軍*

(1. 吉首大學 生物資源與環(huán)境科學學院， 湖南 吉首 416000； 2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心， 廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保護與利用重點實驗室， 廣州 510640； 3. 中國科學院植物研究所， 北京 100093 )

種子休眠是活種子在適宜環(huán)境條件下暫時不能萌發(fā)的一種機制，對種子植物的生存和繁衍起到關(guān)鍵作用 (Gao & Ayele, 2014)。種子休眠是植物對環(huán)境適應(yīng)的一個重要表現(xiàn) (Donohue et al., 2010; Huang et al., 2010)。高水平的種子休眠會延遲萌發(fā)和萌發(fā)不整齊，從而導致生長季節(jié)的長度縮短和生長不一致；相反，低水平的休眠可能引起種子在有利的生長季節(jié)開始之前萌發(fā)，存在幼苗死亡的風險 (Donohue et al., 2010)，從而降低作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。

休眠是一個復(fù)雜的性狀，主要由遺傳和環(huán)境因素決定，植物物種之間存在種子休眠的多樣性和普遍性(Baskin & Baskin, 2014)。種子休眠可分為生理休眠 (physiological dormancy, PD)、形態(tài)休眠 (morphological dormancy, MD)、形態(tài)生理休眠 (morphophysiological dormancy, MPD)、物理休眠 (physical dormancy) 和組合休眠 (combinational dormancy) (Baskin & Baskin, 2004，2014; Iwasaki et al., 2022)。PD存在于具有充分發(fā)育和成熟胚的種子中，主要是由種子組分中抑制劑的存在和植物生長物質(zhì)的缺乏所引起的 (Chen et al., 2010)。PD是最普遍的休眠形式，可分為深度、中度和淺生理休眠，廣泛存在于裸子植物和所有主要被子植物中 (Baskin & Baskin, 2004, 2014; Finch-Savage & Leubner-Metzger, 2006)。MD 的種子胚小 (未發(fā)育完全)，但已分化，種子的萌發(fā)不需要釋放休眠的預(yù)處理，但需要較長時間讓胚生長至足夠體積，之后萌發(fā)。MPD的種子具有未發(fā)育完全和生理休眠的胚，其種子萌發(fā)需要釋放休眠的預(yù)處理。MPD的種子胚的生長/胚根突破種皮需要的時間比MD的種子長得多。

植物激素脫落酸 (abscisic acid, ABA) 和赤霉素 (gibberellin, GA) 參與種子休眠和萌發(fā)的控制 (Weitbrecht et al., 2011; Iwasaki et al., 2022)。Dong等 (2012) 發(fā)現(xiàn)，氟啶酮 (fluridone，F(xiàn)lu, ABA生物合成的抑制劑) 和GA3顯著降低萵苣種子萌發(fā)的熱休眠，而烯唑醇 (diniconazole, ABA分解代謝酶ABA 8′-羥化酶的抑制劑) 和多效唑 (paclobutrazol, GA生物合成途徑的抑制劑) 增加萵苣種子萌發(fā)的熱休眠。在降低萵苣種子萌發(fā)的熱休眠中，多效唑具有明顯拮抗氟啶酮的作用，而氟啶酮具有顯著增加GA3的作用。特別是ABA和GA水平之間的平衡及其各自的信號通路在誘導和維持休眠以及促進萌發(fā)的調(diào)控中起重要作用 (Finkelstein et al., 2008; Graeber et al., 2012; 宋松泉等, 2020a, b)。此外，種子休眠還被一些環(huán)境因素釋放，如后熟、變溫、冷/暖層積、交替光照等，具體取決于物種 (Baskin & Baskin, 2004, 2014; Black et al., 2006； Finch-Savage & Leubner-Metzger, 2006)。

淫羊藿屬 (EpimediumL. ) 植物為小檗科 (Berberidaceae) 多年生草本植物，該屬植物約55 種，我國有45 種，其中淫羊藿 (Epimediumbrevicornum)、箭葉淫羊藿 (E.sagittatum)、柔毛淫羊藿 (E.pubescens)、朝鮮淫羊藿 (E.koreanum) 和巫山淫羊藿 (E.wushanense) 為《中華人民共和國藥典》所收載 (國家藥典委員會，2020) 。淫羊藿為常用中藥，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補腎壯陽、祛風除濕之功效；在臨床上，淫羊藿常被用于治療骨質(zhì)疏松、更年期綜合征、乳房腫塊、高血壓、冠心病等；另外，淫羊藿還具有增強免疫力、抗衰老、抗腫瘤、抗艾滋病等作用。淫羊藿含有多種生理活性很強的成分，主要包括黃酮類化合物、生物堿、多糖、木脂素和一些必需的微量元素 (Kang et al., 2012; 李聰聰?shù)? 2020)。長期以來，種子萌發(fā)困難，淫羊藿的栽培大多采用挖取野生植株進行分蔸種植，但其繁殖系數(shù)低，并對野生資源造成了嚴重破壞。近年來，隨著市場需求的大量增加，淫羊藿野生資源的蘊藏量逐年銳減，瀕臨枯竭。因此，利用種子進行種苗繁育已成為淫羊藿產(chǎn)業(yè)化栽培中亟須解決的關(guān)鍵問題。

淫羊藿屬植物在果實成熟時，種胚發(fā)育不完全，需要經(jīng)過一段時間的冷層積或冷暖層積才能萌發(fā)，具有明顯的休眠現(xiàn)象 (樊家乙等, 2010; 付長珍等, 2012; 田向榮等, 2015; 蘇賀等, 2016; Rhie & Lee, 2020)。GA3處理促進巫山淫羊藿 (蘇賀等, 2016) 和朝鮮淫羊藿 (Rhie & Lee, 2020) 種胚的生長，氟啶酮處理能顯著增加巫山淫羊藿種子的萌發(fā)率 (蘇賀等, 2016)。田向榮等 (2015) 利用常規(guī)萌發(fā)試驗以及直接測量和石蠟制片技術(shù)初步研究了箭葉淫羊藿種子的萌發(fā)特性。目前，箭葉淫羊藿種子的休眠和萌發(fā)特性仍不夠清楚。本文以成熟的箭葉淫羊藿種子為材料，研究了種子對水分的吸收、種子的脫水耐性以及溫度、層積和植物激素對種子萌發(fā)的影響，試圖探明箭葉淫羊藿種子的休眠類型及其釋放休眠和促進萌發(fā)的適宜方法，為產(chǎn)業(yè)化育苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

箭葉淫羊藿 (Epimediumsagittatum) 的成熟果實于2020年6月采自張家界八大公山 (110°07′ E、29°77′ N，海拔1 302 m)，年平均溫度小于9.9 ℃，最冷月為1月，平均溫度3.5～4.3 ℃，最熱月為7月，平均溫度26.3～28 ℃；年均降雨量2 300 mm，春夏季 (4—6月) 降雨最多，約占48%。將收集后的果實置于(25±3)℃和(50±5)%相對濕度下自然干燥，待種子從果莢中脫落后，干燥種子含水量到(9.7±0.49)%，一部分種子用于耐脫水性分析，另一部分種子在4 ℃中貯藏備用。

玉米‘鄭單958’ (Zeaways‘Zhengdan 958’) 和水稻‘日本晴’ (Oryzasativa‘japonica’) 種子由廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物基因中心種質(zhì)資源實驗室提供。

1.2 耐脫水性分析

將含水量為9.7%的種子置于篩網(wǎng)中；將篩網(wǎng)置于盛有干燥硅膠的干燥器中，分別脫水0、2、4、8、12、24、36 h后，一部分種子用于測定含水量，另一部分種子則在4 ℃下層積60 d后在10 ℃和黑暗條件下萌發(fā)。

1.3 含水量測定

種子含水量的測定參照國際種子檢驗協(xié)會的方法 (International Seed Testing Association, 1999) ，以鮮重的百分比表示。

1.4 種子對水分的吸收

箭葉淫羊藿種子、玉米種子和水稻種子分別播種在墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入7 mL 蒸餾水，于25 ℃和黑暗中分別吸脹不同時間后測定種子的含水量。種子的含水量用鮮重百分比來表示。

1.5 層積處理

層積基質(zhì)為珍珠巖。首先，將珍珠巖在自來水中除去粉塵，121 ℃中滅菌30 min，冷卻后裝入自封袋中并加入適量的無菌水，室溫下放置20 min后，用吸管將多余的水吸掉。其次，將含水量為9.7%的箭葉淫羊藿種子與濕潤的珍珠巖 (V/V=1∶10) 在自封袋中充分混合，然后，分別在4、10、(4+10)、(10+4)、(4+10+4) ℃和黑暗條件下層積。最后，層積不同的時間組合后，取樣。一部分種子利用OLYMPUS (SZ61) 體式顯微鏡觀察胚的形態(tài)變化，拍照、計算胚/種子(embryo/seed，E/S)的比例 (胚的長度/種子的長度)；另一部分種子做萌發(fā)試驗，測定種子的萌發(fā)速率和萌發(fā)率。

1.6 種子萌發(fā)

經(jīng)不同處理的種子用0.1% (V/V) NaClO滅菌15 min后，播種在墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入6 mL 蒸餾水或不同濃度的植物激素GA3或氟啶酮，之后在注明溫度和黑暗的條件下萌發(fā)。以胚根突破種皮2 mm作為萌發(fā)的標準。

1.7 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0軟件的單因素方差分析模型 (one-way ANOVA model) 進行分析，平均數(shù)差異的顯著性利用Student-Newman-Keuls (S-N-K)檢驗確定(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子對水分的吸收

為了解種子是否具有物理休眠，將收獲的新鮮箭葉淫羊藿、玉米和水稻種子在25 ℃和黑暗中分別吸脹0～72 h。我們觀察到，箭葉淫羊藿種子具有2個階段的水分吸收，即階段Ⅰ (0～4 h) 的快速吸水和階段Ⅱ(4～72 h)的緩慢吸水直到平臺期。在階段Ⅰ，種子的含水量從9.7%增加到52%；在階段Ⅱ，種子的含水量從52%增加到56.7%。玉米和水稻種子的吸水過程可分為3個階段，即階段Ⅰ的快速吸水和階段Ⅱ的緩慢吸水以及階段Ⅲ種子萌發(fā)后的迅速吸水 (圖1：A)。

干種子在25 ℃和黑暗中吸脹不同時間后，種子的含水量和萌發(fā)率被測定。胚根伸出種皮2 mm作為種子完成萌發(fā)的標準。所有的數(shù)值均為100粒種子重復(fù)3次的平均值±標準誤。Water content and germination of seeds were determined after dry seeds were imbibed at 25 ℃ and darkness for different time. A radicle length of 2 mm was used as the criterion for germination completion. All values were of three replicates for 100 seeds each.圖 1 箭葉淫羊藿、玉米和水稻種子的含水量 (A) 與萌發(fā)率 (B)Fig. 1 Water content (A) and germination percentage (B) of Epimedium sagittatum, Zea mays and Oryza sativa seeds

在吸脹的72 h內(nèi)，未觀察到箭葉淫羊藿種子萌發(fā)；相反，玉米和水稻種子隨著吸水量的增加逐漸萌發(fā)。玉米和水稻種子達到10%萌發(fā)率的時間分別為22 h和33 h，達到50%萌發(fā)率的時間分別為34 h和42 h。當吸脹72 h時，玉米和水稻種子的萌發(fā)率分別達到97%和93% (圖1：B)。

2.2 脫水對種子萌發(fā)的影響

為研究箭葉淫羊藿種子的耐脫水性，將含水量為9.7% (鮮重為基礎(chǔ)) 的箭葉淫羊藿種子置于干燥硅膠表面在不同的時間進一步脫水。脫水初期，種子的含水量下降較快，之后緩慢下降。如脫水2 h時，種子的含水量下降了18.9%；從脫水8 h至脫水12 h，含水量僅下降了4.2% (圖2：A)。

a. 含水量的變化; b. 萌發(fā)率的變化。種子在干燥硅膠表面被分別脫水不同的時間后， 測定種子的含水量和萌發(fā)率。脫水后的種子先在4 ℃下層積60 d，然后在10 ℃和黑暗條件下萌發(fā)72 d。胚根伸出種皮2 mm作為種子完成萌發(fā)的標準，所有的數(shù)據(jù)為50粒種子4次重復(fù)的平均值 ± 標準誤。下同。條形圖上相同的大寫字母表示不同處理之間沒有顯著性差異 (S-N-K, P=0.05)。a. Change of water content; b. Change of germination percentage. Water content and germination percentage of seeds were determined after seeds were dehydrated at surface of dry silica gel for different time. Dehydrated seeds were first stratified at 4 ℃ for 60 d, and then germinated at 10 ℃ and darkness for 72 d. A radicle length of 2 mm was used as the criterion for completion of germination. All values are of four replicates of 50 seeds each. The same below. The same uppercase letters above bars represent no significant differences among different treatments (S-N-K, P=0.05).圖 2 箭葉淫羊藿種子對脫水的反應(yīng)Fig. 2 Response of Epimedium sagittatum seeds to dehydration

脫水4 h和8 h，當含水量從9.7%下降到7.3%和5.7%時，種子 (經(jīng)4 ℃層積60 d后) 的萌發(fā)率增加；隨著進一步脫水，種子的萌發(fā)率稍微下降，但仍高于對照，與對照沒有顯著性差異 (圖2：B)。脫水后，種子的萌發(fā)速率加快，如未經(jīng)脫水的種子在萌發(fā)處理后155 d時開始萌發(fā)，而經(jīng)過脫水的種子在萌發(fā)處理后105 d時開始萌發(fā) (未表明數(shù)據(jù))。

2.3 溫度對種子萌發(fā)的影響

為發(fā)現(xiàn)箭葉淫羊藿種子的適宜萌發(fā)溫度，將采集的新鮮干燥種子分別在4、10、15、20、25 ℃和黑暗條件下吸脹30 d，其萌發(fā)率為零 (未表明數(shù)據(jù))。但是，在4 ℃和10 ℃的條件下，種子分別在吸脹的115 d和145 d 開始萌發(fā)，隨著吸脹時間的增加，種子的萌發(fā)率也增加；當吸脹240 d時，種子的萌發(fā)率分別為55%和44% (圖3：A)。而在15、20、25 ℃的條件下，到吸脹的240 d，種子的萌發(fā)率分別為2%、0和0。種子在4 ℃和10 ℃的條件下能夠部分萌發(fā)，在4 ℃下的萌發(fā)速率和萌發(fā)率明顯高于10 ℃ (圖3：A)。

A. 采集的新鮮干燥種子; B. 10 ℃層積60 d后轉(zhuǎn)移到4℃層積30 d的種子。A. Freshly-collected dry seeds; B. Seeds stratified at 10 ℃ for 60 d and transfered to 4 ℃ for 30 d.圖 3 溫度對箭葉淫羊藿種子萌發(fā)的影響Fig. 3 Effects of temperature on germination of Epimedium sagittatum seeds

為進一步找到種子的適宜萌發(fā)溫度，將在10 ℃層積60 d后轉(zhuǎn)移到4 ℃中層積30 d的種子置于不同溫度和黑暗條件下萌發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4、10、15、20、25 ℃下，種子的萌發(fā)率分別為88%、85%、3%、2%和0，適宜的萌發(fā)溫度為4 ℃和10 ℃。在萌發(fā)初期，種子在10 ℃中的萌發(fā)速率稍微高于4 ℃，但隨著萌發(fā)時間的增加，在4 ℃下的萌發(fā)速率和萌發(fā)率都高于10 ℃ (圖3：B)。

2.4 層積處理對胚生長和種子萌發(fā)的影響

2.4.1 層積對胚生長的促進作用 箭葉淫羊藿種子從果莢脫落時，種子中胚的體積較小，呈球形胚，E/S比值僅為0.07 (圖4：A，B)。 隨著在4 ℃和10 ℃中層積時間的增加，胚逐漸從球形胚發(fā)育到心形胚、魚雷形胚和成熟胚，胚的體積也不斷增加 (圖4)。

采集的新鮮干燥種子用不同的溫度組合層積表明的時間后，用體式顯微鏡觀察和測定胚的大小，拍照和計算E/S比值。A，B. 在4 ℃和10 ℃層積過程中胚的形態(tài)變化; C-E. 在不同溫度組合層積過程中E/S比值的變化。圖中箭頭表示溫度變化的時間點。所有的數(shù)據(jù)為10粒種子3次重復(fù)的平均值±標準誤。The freshly-collected dry seeds were stratified in different temperature combinations for an indicated time, and the embryo size was then observed, measured, and photographed by stereomicroscope, and the E/S ratio was calculated. A，B. Morphological change of embryo during stratification at 4 ℃ and 10 ℃, respectively; C-E. Change of E/S ratio during stratification at different temperature combinations. The arrow in the figure indicates the time point of temperature change. All values are of three replicates of 10 seeds each.圖 4 不同層積處理對箭葉淫羊藿胚生長 (胚/種子， E/S) 的影響Fig. 4 Effects of different stratification treatments on embryo growth (embryo/seed, E/S) of Epimedium sagittatum seeds

當種子在4 ℃中層積時，胚在層積0～60 d時生長緩慢 (E/S比值較小)，到層積60 d時，E/S比值為0.09；在層積的61～90 d里胚逐漸生長，到層積90 d時E/S比值為0.14；在層積90 d后胚迅速生長，到層積165 d時E/S比值為0.88 (圖4：C)。

當種子在10 ℃中層積時，胚的生長逐漸增大；到層積165 d時，其E/S比值為0.8 (圖4：D)。我們觀察到，在10 ℃中層積的種子，其E/S比值顯著大于在4 ℃中層積的種子，如種子在10 ℃中層積60 d的E/S比值 (0.24) 比在4 ℃中層積相同時間的比值(0.09) 增加了167% (圖4：D)。

當種子在4 ℃中層積30 d后轉(zhuǎn)移到10 ℃中層積時，胚的生長速率比一直在4 ℃中層積生長更快。例如，從4 ℃中層積30 d后轉(zhuǎn)到10 ℃中繼續(xù)層積60 d的種子，其E/S比值 (0.25) 比在4 ℃中層積90 d的種子 (0.144) 增加了約74%；在4 ℃中層積60 d后轉(zhuǎn)移到10 ℃中層積的種子其E/S比值在層積初期與一直在4 ℃中層積的種子類似，隨著在10 ℃中層積時間的延長，其E/S比值有所增加 (圖4：C)。種子在10 ℃中層積30 d或60 d后轉(zhuǎn)移到4 ℃中層積時，其E/S比值均顯著大于一直在10 ℃中層積種子的E/S比值。例如，種子一直在10 ℃中層積90 d時，其E/S比值為0.4；在10 ℃中層積30 d后轉(zhuǎn)移到4 ℃中層積60 d，其E/S比值為0.83；在10 ℃中層積60 d后轉(zhuǎn)移到4 ℃中層積30 d， 其E/S比值為0.67 (圖4：D)。

種子在4 ℃層積30 d和10 ℃層積90 d后轉(zhuǎn)移到4 ℃中層積，或在4 ℃層積60 d和10 ℃層積60 d后轉(zhuǎn)移到4 ℃中層積，胚的生長 (E/S) 都表現(xiàn)出相同的趨勢；而在層積75～135 d時，前者的生長比后者稍微快些，在136～165 d時，二者的生長沒有明顯差異；到層積165 d時，二者的E/S比值均大于0.8 (圖4：E)。

2.4.2 層積對種子萌發(fā)的促進作用 種子在4 ℃中分別層積30 d或60 d后，置于10 ℃和黑暗中萌發(fā)，隨著層積時間的延長，種子的萌發(fā)速率和萌發(fā)率顯著增加 (圖5：A)。種子在10 ℃中層積30 d或60 d后，置于4 ℃和黑暗中萌發(fā)，種子的萌發(fā)速率和萌發(fā)率也顯著增加，在10 ℃中層積30 d和60 d的作用效果類似 (圖5：B)。

A. 種子在4 ℃中分別層積30 d和60 d， 之后在10 ℃和黑暗條件下萌發(fā); B. 種子在10 ℃中分別層積30 d和60 d，之后在4 ℃和黑暗條件下萌發(fā); C. 種子在4 ℃中層積30 d后轉(zhuǎn)移到10 ℃中繼續(xù)層積90 d，或在4 ℃中層積60 d后轉(zhuǎn)移到10 ℃中繼續(xù)層積60 d，之后在4 ℃和黑暗條件下萌發(fā)。圖中箭頭表示種子開始萌發(fā)的時間點。胚根伸出種皮2 mm作為種子完成萌發(fā)的標準。所有的數(shù)據(jù)為50粒種子4次重復(fù)的平均值±標準誤。下同。A. Seeds were stratified at 4 ℃ for 30 and 60 d, respectively, and then germinated at 10 ℃ and darkness; B. Seeds were stratified at 10 ℃ for 30 and 60 d, respectively, and then germinated at 4 ℃ and darkness; C. Seeds are stratified at 4 ℃ for 30 d and transfered 10 ℃ for 90 d or at 4 ℃ for 60 d and at 10 ℃ for 60 d, and then germinated at 4 ℃ and darkness. The arrow in the figure indicates the time point at which the seed begins to germinate. A radicle length of 2 mm was used as the criterion for completion of germination. All values are of four replicates of 50 seeds each. The same below.圖 5 不同層積處理對箭葉淫羊藿種子萌發(fā)的影響Fig. 5 Effects of different stratification treatments on germination of Epimedium sagittatum seeds

種子在10 ℃中層積30 d或60 d后在4 ℃中的萌發(fā)速率和萌發(fā)率遠比在4 ℃中層積30 d或60 d后在10 ℃ 中萌發(fā)的種子高得多 (圖5：A，B)。例如，4 ℃中層積30 d和60 d的種子在10 ℃中的最初萌發(fā)時間分別為125 d和90 d，在萌發(fā)150 d時的萌發(fā)率分別為22.5%和67%；在10 ℃中層積30 d和60 d的種子在4 ℃中的最初萌發(fā)時間均為45 d，在萌發(fā)150 d時的萌發(fā)率分別為93%和96 %。在4 ℃中層積60 d的種子在10 ℃中萌發(fā)率達到50%的時間為135 d，而在10 ℃中層積30 d的種子在4 ℃中萌發(fā)率達到50%的時間僅為60 d(圖5：A，B)。

兩種變溫層積 (4 ℃層積30 d + 10 ℃層積90 d或4 ℃層積60 d + 10 ℃層積60 d) 都能顯著增加種子在4 ℃中的萌發(fā)速率和萌發(fā)率，萌發(fā)率達到50%的時間均為70 d (圖5：C)；與在10 ℃中層積30 d 或60 d后在4 ℃中萌發(fā)的種子比較，種子的萌發(fā)速率和萌發(fā)率稍微降低，但比在4 ℃中層積30 d或60 d后在10 ℃中萌發(fā)的種子高得多 (圖5)。

2.5 赤霉素和氟啶酮對種子萌發(fā)的促進作用

為了解箭葉淫羊藿種子萌發(fā)對植物激素GA3和氟啶酮的響應(yīng)，種子先在10 ℃和黑暗中層積120 d，使胚發(fā)育成熟，再在不同濃度的GA3、氟啶酮和GA3+ 氟啶酮中萌發(fā)。結(jié)果表明，1、10 μmol·L-1GA3對種子的萌發(fā)沒有作用，100～10 000 μmol·L-1GA3明顯地促進種子萌發(fā)，10 000 μmol·L-1GA3的促進作用明顯低于1 000 μmol·L-1GA3，以及種子的萌發(fā)率仍然低于70% (圖6：A)。5～500 μmol·L-1氟啶酮顯著地促進種子萌發(fā)，其萌發(fā)率都高于90%，均比對照增加46%及以上 (圖6：B)。在添加10、100 μmol·L-1GA3的同時，分別添加10 μmol·L-1或100 μmol·L-1的氟啶酮，種子的萌發(fā)速率 (未表明數(shù)據(jù)) 和萌發(fā)率都比單獨添加相同濃度的GA3高得多，萌發(fā)率約為95% (圖6：C)。

種子在10 ℃和黑暗中層積120 d，之后在不同濃度的GA3 (A)、Flu (B) 和GA3 + Flu 組合 (C) 以及4 ℃和黑暗中萌發(fā)60 d。Seeds were stratified at 10 ℃ and darkness for 120 d, and then germinated in different concentrations of GA3 (A), Flu (B) and GA3 + Flu combinations (C) as well as at 4 ℃ and darkness for 60 d.圖 6 植物激素赤霉素 (GA3) 和氟啶酮 (Flu) 對淫羊藿種子萌發(fā)的影響Fig. 6 Effects of phytohormone gibberellin (GA3) and fluridone (Flu) on germination of Epimedium sagittatum seeds

3 討論

3.1 箭葉淫羊藿種子對水分的吸收

種子萌發(fā)隨著水分吸收開始，當胚根突破種皮萌發(fā)結(jié)束 (Bewley et al., 2013)。箭葉淫羊藿種子的水分吸收具有快速吸水 (階段Ⅰ) 和緩慢吸水 (階段Ⅱ) 兩個階段，缺乏吸水的第Ⅲ階段。在階段Ⅰ，種子的含水量迅速增加到52%，表明箭葉淫羊藿種子的種皮是透水的，不具有物理休眠。階段Ⅰ的水分吸收是由襯質(zhì)勢 (matrix potential) 驅(qū)動的，因為干種子的水勢非常低 (Obroucheva & Antipova, 1997)。階段Ⅱ的緩慢吸水直到72 h (甚至更長，未表明數(shù)據(jù)) 是水分吸收的滯后期。以上結(jié)果與巫山淫羊藿種子的水分吸收類似 (樊家乙等, 2010)。階段Ⅲ的水分吸收是由種子萌發(fā)引起的；在吸脹的72 h內(nèi)，箭葉淫羊藿種子的萌發(fā)率為零，沒能觀察到水分吸收的第Ⅲ階段。在25 ℃下，玉米和水稻種子的水分吸收具有階段Ⅰ的快速吸水，階段Ⅱ的短暫緩慢吸水以及階段Ⅲ的迅速吸水。玉米和水稻種子的萌發(fā)率隨著吸水逐漸增加，分別在吸脹后的34 h和42 h達到50%萌發(fā)率。

3.2 脫水對種子萌發(fā)的影響

成熟脫水是正常性種子 (orthodox seed) 發(fā)育的末端事件，在植物種子 (質(zhì)) 資源保存中起關(guān)鍵作用 (宋松泉等, 2022)。箭葉淫羊藿種子的含水量從9.7%下降至4.6%，種子經(jīng)4 ℃層積60 d后的萌發(fā)率仍然為56.3%，表明種子具有耐脫水性。值得注意的是，種子萌發(fā)率低于60%，不是由于種子被脫水傷害，而是在4℃層積60 d未能完全解除種子的休眠特性。本研究結(jié)果為淫羊藿屬植物種子的干燥及其種質(zhì)資源的長期保存提供了耐脫水的依據(jù)。

3.3 溫度對種子萌發(fā)的影響

溫度既是影響種子萌發(fā)最重要的環(huán)境因素之一，也決定種子萌發(fā)的能力和速率，并打破種子的初生和/或次生休眠 (Brándel 2004; Baskin & Baskin, 2014)。箭葉淫羊藿種子分別在4、10、15、20、25 ℃和黑暗條件下吸脹30 d，其萌發(fā)率為零，表明種子具有休眠特性。然而，在4 ℃和10 ℃的條件下，種子分別在吸脹115 d和145 d時開始萌發(fā)；到吸脹240 d時，種子的萌發(fā)率分別為55%和44%；在15、20、25 ℃的條件下，到吸脹240 d時，種子的萌發(fā)率分別為2%、0和0。這表明箭葉淫羊藿種子具有深休眠特性，溫度顯著影響種子的萌發(fā)，以及4～10 ℃可能是箭葉淫羊藿種子萌發(fā)的適宜溫度。蘇賀等 (2016) 的研究結(jié)果表明，巫山淫羊藿種子只能在低溫 (4 ℃) 中萌發(fā)，不能在變溫 (10 ℃/20 ℃) 中萌發(fā)。

在10 ℃層積60 d后轉(zhuǎn)移到4 ℃中層積30 d的種子，在4、10、15、20、25 ℃下的萌發(fā)率分別為88%、85%、3%、2%和0，表明種子的適宜萌發(fā)溫度為4～10 ℃。

3.4 層積處理對胚生長和種子萌發(fā)的影響

Graeber等 (2012) 提出，休眠是一種數(shù)量性狀，其深度隨著發(fā)育進程而變化。初生休眠是種子在成熟過程中形成的，在生理成熟時達到最高水平；在隨后的干藏 (后熟) 或?qū)臃e過程中，種子的休眠深度逐漸降低 (Finch-Savage & Leubner-Metzger, 2006; Holdsworth et al., 2008)。箭葉淫羊藿種子脫落時，種子中胚的體積較小 (E/S比值為0.07)；隨著種子在4、10 ℃中層積時間的增加，胚逐漸從球形胚發(fā)育到心形胚、魚雷形胚和成熟胚 (E/S比值大于0.8)；這表明箭葉淫羊藿種子具有形態(tài)休眠，在4、10 ℃層積過程中，胚能夠逐漸生長發(fā)育。田向榮等 (2015) 觀察到類似的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)箭葉淫羊藿種子的胚未分化，停留在球形胚階段，在后熟過程中，胚的結(jié)構(gòu)逐步發(fā)育，形成子葉胚。朝鮮淫羊藿 (王晶等, 2013) 和巫山淫羊藿 (樊家乙等, 2010) 種子也具有類似的特性，需要經(jīng)過一定時間的層積才能促進胚的生長。這些結(jié)果與朝鮮淫羊藿在田間條件下胚的生長、萌發(fā)和出苗的物候一致。朝鮮淫羊藿種子的胚未發(fā)育，在田間條件下在6—9月初，胚很少生長，但從9月下旬至11月胚迅速生長，到12月初胚已完成生長，胚的長度比初始長度增加了16倍；種子在次年3月萌發(fā)，萌發(fā)率達84.4% (Rhie & Lee, 2020)。

當種子在4 ℃中層積30 d后轉(zhuǎn)移到10 ℃中層積時，胚的生長速率比一直在4 ℃中層積生長更快；在10 ℃中層積的種子，其E/S比值顯著大于在4 ℃中層積的種子。這表明10 ℃層積有利于胚的生長發(fā)育。此外，當種子在10 ℃中層積30 d或60 d后轉(zhuǎn)移到4 ℃中層積時，其E/S比值均顯著大于一直在10 ℃中層積種子的E/S比值，表明胚和/或胚乳中可能存在某些生長抑制物質(zhì)，在4 ℃中層積比在10℃中層積更有利于這些生長抑制物質(zhì)的釋放和胚的生長。本研究結(jié)果表明，變溫層積有利于箭葉淫羊藿種胚的生長發(fā)育。Rhie和Lee (2020) 發(fā)現(xiàn)，當朝鮮淫羊藿種子在20 ℃或15 ℃的恒溫下培養(yǎng)時，胚幾乎不生長。

在10 ℃萌發(fā)條件下，箭葉淫羊藿種子的萌發(fā)速率和萌發(fā)率隨著在4 ℃中層積時間的延長而顯著增加。同樣，在4 ℃萌發(fā)條件下，箭葉淫羊藿種子的萌發(fā)速率和萌發(fā)率也隨著在10 ℃中層積時間的延長而顯著增加；而在10 ℃中層積30 d或60 d后在4 ℃中的種子萌發(fā)速率和萌發(fā)率卻遠遠高于在4 ℃中層積30 d或60 d后在10 ℃ 中萌發(fā)的種子 。這些萌發(fā)結(jié)果與層積溫度對E/S比值的影響類似。付長珍等 (2012) 報道，擬巫山淫羊藿種子在15 ℃中處理1～7個月后轉(zhuǎn)移到4 ℃中，胚的生長和種子萌發(fā)率顯著增加，但隨著15 ℃處理時間的延長，種子的萌發(fā)率增加，而種子的萌發(fā)速率下降。

4 ℃層積30 d + 10 ℃層積90 d或4 ℃層積60 d + 10 ℃層積60 d的變溫層積都能顯著增加種子在4 ℃中的萌發(fā)速率和萌發(fā)率，這與變溫層積對E/S比值的影響類似。

3.5 赤霉素和氟啶酮對種子萌發(fā)的促進作用

ABA是休眠誘導與維持的正調(diào)控因子，是種子萌發(fā)的負調(diào)控因子；而GA3能釋放休眠，促進萌發(fā)和拮抗ABA的效應(yīng)，它們的水平和信號轉(zhuǎn)導在種子休眠釋放和萌發(fā)中起重要作用 (Hauvermale et al., 2012; 宋松泉等, 2020a, b; Iwasaki et al., 2022)。對于在10 ℃和黑暗中層積120 d 的 (胚成熟) 箭葉淫羊藿種子，1、10 μmol·L-1GA3對種子的萌發(fā)沒有作用，100～10 000 μmol L-1GA3明顯地促進種子萌發(fā)，但種子的萌發(fā)率仍然低于70%。這表明GA3能部分促進種子的萌發(fā)。5～500 μmol·L-1氟啶酮顯著促進種子的萌發(fā)，其萌發(fā)率均大于90%；對于種子的萌發(fā)，10 μmol·L-1或100 μmol·L-1的氟啶酮對GA3有加成作用。蘇賀等 (2016) 利用變溫 (10 ℃/20 ℃) 層積90 d 的巫山淫羊藿種子作為材料，研究了氟啶酮和赤霉素對巫山淫羊藿種子休眠解除的影響，發(fā)現(xiàn)氟啶酮的作用較強，赤霉素的作用較弱，并且氟啶酮可以促進在變溫中不能萌發(fā)的種子萌發(fā)。Rhie和Lee (2020) 觀察到，GA3處理能增加朝鮮淫羊藿種子胚的生長，但對種子萌發(fā)的促進作用較小，萌發(fā)率低于10%。這些結(jié)果都表明，ABA在抑制箭葉淫羊藿種子萌發(fā)中可能具有重要作用。

4 結(jié)論

箭葉淫羊藿種子的種皮透水，不具有物理休眠；種子具有耐脫水性，能在低含水量和低溫的條件下貯藏；在4～25 ℃和黑暗條件下，種子的萌發(fā)率為零；E/S比值非常小，4、10 ℃和變溫層積能顯著促進胚的發(fā)育以及增加種子的萌發(fā)速率和萌發(fā)率；GA3和氟啶酮能顯著增加種子的萌發(fā)速率和萌發(fā)率。根據(jù)Baskin和Baskin (2004, 2014)、Finch-Savage和Leubner-Metzger (2006) 的觀點，本研究認為，箭葉淫羊藿種子的休眠類型為MPD，釋放休眠和促進萌發(fā)的最適方法是將種子先在10 ℃中層積30 d，再置于4 ℃的環(huán)境中讓其萌發(fā)。