馬秋蓮，周 露，潘馨竹，王 健，馬 蓉，徐程偉

（寶應(yīng)縣有機食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，江蘇揚州 225800）

自然環(huán)境中存在大量的李斯特氏菌，該菌有7個菌株，單增李斯特氏菌作為該菌中的一種，能夠引發(fā)人、動物共同患病[1]。該菌屬于食源性致病菌，存在于土壤、糞便、蔬菜和多種食品中。例如，肉制品、水產(chǎn)品及奶制品等更容易受到單增李斯特氏菌的污染[2]。它具有較強的致病性，隨著人們所吃的食物一起進入消化系統(tǒng)，會使人們產(chǎn)生敗血癥、腦膜炎等疾病[3]。因此，我國食品安全標準中嚴格規(guī)定須檢測食品中是否存在這種致病菌[4]。

能力驗證的本質(zhì)是借助實驗室之間的對比來判斷其檢測、校準等能力，對實驗室檢測能力進行評價中多使用該手段。食品檢驗檢測機構(gòu)在質(zhì)控中，為了解和判斷各實驗室是否具備檢測出該致病菌的能力，通常為各實驗室提供參加能力驗證的機會，即通過每一次的能力驗證，讓每個實驗室發(fā)現(xiàn)自身存在的問題，從而進行整改，進而不斷提高各個實驗室的檢測技術(shù)和質(zhì)量控制水平[5]；提高檢驗人員的檢測能力。為了檢測本實驗室是否掌握食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測能力情況，本實驗室參加了大連中食國實組織的單核細胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證活動。實驗室嚴格按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）[6]標準，以BAX Q7為依據(jù)快速篩查驗證3 個樣品，利用高特異性引物原理快速對病原微生物特有的基因信號進行檢測?，F(xiàn)對本次能力驗證的過程、結(jié)果及操作等進行總結(jié)分析，得出相關(guān)結(jié)論，為后期檢驗檢測工作的開展提供依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

大連中食國實提供實驗所需的乳粉樣品，該樣品以人工方式進行污染，其顏色和形狀為白色凍干塊狀，將其分別保存于真空西林瓶中，編號為270、159 和318。

1.2 試劑與儀器

李氏增菌肉湯LB1、LB2；李斯特氏菌顯色平板基（科瑪嘉）；單核細胞增生李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板；PALCAM 瓊脂平板；含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）；血平板；革蘭氏染色液；生化鑒定試劑盒及BAX Q7 試劑盒。

本實驗所需的儀器包括電熱恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、電子天平、均質(zhì)器、超純水機和BAX Q7 等。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢驗依據(jù)

《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）和中食國實能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書。

1.3.2 實驗步驟

依據(jù)單增李斯特氏菌檢驗?zāi)芰︱炞C中的相關(guān)標準，先對實驗樣品進行處理，按照增菌、分離、初篩及鑒定這4 個流程進行具體實驗，利用試劑盒、微生物生化鑒定系統(tǒng)及基因指紋圖譜鑒定系統(tǒng)對菌種進行鑒定，選擇陽性對照菌進行具體實驗，最后以報告的形式將實驗結(jié)果呈現(xiàn)出來。

1.3.3 檢測過程

（1）前增菌和增菌。由于樣品可能存在致病性，本次實驗過程需要在BSL-2 實驗室進行，同時使用生物安全柜對實驗人員以及樣品進行保護。首先無菌開啟西林瓶，用40 mL 的生理鹽水稀釋，此溶液為待測樣品原液。用移液管吸取25 mL 待測樣品原液到225 mL LB1增菌液中，將其充分混勻，放置在環(huán)境溫度為29～31 ℃下培養(yǎng)24 h。按照此方法，分別對3 個樣品進行處理，并使用單增李斯特氏菌CMCC（B）54002 菌株作陽性對照。使用BAX Q7 試劑盒初步篩選出培養(yǎng)后的增菌液，吸取0.1 mL 經(jīng)培養(yǎng)過的樣品菌液放置于10 mL LB2增菌液中，在溫度為30 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)24 h，以此類推，使用以上相同方法做一個陽性對照，陽性對照是用單增李斯特氏菌FSCC178006 菌株。

（2）分離培養(yǎng)。取LB2增菌液1 環(huán)分別將其接種至3 種不同的培養(yǎng)基平板上，劃線后3 種平板于36 ℃培養(yǎng)24～48 h。該致病菌在單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、李斯特氏菌顯色平板基及PALCAM 瓊脂平板上的代表性菌落形態(tài)分別為藍綠色光滑規(guī)則小菌落，且周圍有乳白色脂肪沉淀環(huán)、棕黑色水解圈小圓形灰綠色菌落；藍色，邊緣整齊帶有白色暈環(huán)的菌落；圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈。

（3）初篩。從上述平板上選取一定量的可疑菌落，本實驗中選取的量為每個平板上3～5 個菌，將其接種至鼠李糖、木糖發(fā)酵管中，在溫度為35～37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h，同時在TSA-YE 平板上劃線，在溫度為35～37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)24 h，從中分別選取陰性木糖、陽性鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物，進行進一步的鑒定。

（4）形態(tài)學(xué)鑒定及生化實驗。對TSA-YE 平板上的可疑單菌落分別染色后進行鏡檢，并依據(jù)環(huán)凱單增李斯特氏菌成套生化鑒定管說明書進行實驗操作，具體參照標準為GB 4789.30—2016 中5.4.1～5.4.5[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 增菌和選擇性分離結(jié)果

樣品270、159 和318 LB2增菌的培養(yǎng)液都比較渾濁，由此可以判定樣品中有微生物生長。PALCAM平板上3 個樣品呈現(xiàn)出的形狀和顏色為圓形、灰綠色，周圍生長的單個菌落形態(tài)為棕黑色水解圈，該菌落與致病菌的菌落形態(tài)頗為相似，說明該菌為單增李斯特氏菌的概率很大；李斯特顯色平板上的270、陽性菌株部分呈現(xiàn)出圓形、藍綠色，部分為乳白色暈環(huán)的單個菌落，依據(jù)產(chǎn)品說明書，判斷其很可能是單增李斯特氏菌；李斯特顯色平板上的樣品159、318 部分呈現(xiàn)出圓形、藍綠色，生長的單個菌落無乳白色暈環(huán)，說明這兩種樣品為該致病菌的概率很小。此外，樣品270 和陽性菌株的單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基均分離出藍綠色光滑規(guī)則的小菌落，而159和318 分離出無色光滑規(guī)則的小菌落，則推斷出159和318 樣品很可能是英諾克李斯特氏菌。

2.2 初篩及生化實驗

對樣品270 分離的可疑菌落與陽性菌進行對照，其結(jié)果與陽性對照結(jié)果一致。但是樣品159 和318 中分離出的可疑菌落除SIM 生化管，其他生化鑒定結(jié)果和陽性對照結(jié)果一致，但是溶血試驗為陰性，所以排除其為單核細胞增生李斯特氏菌，見表1。使用BAX Q7 試劑盒初步篩選出培養(yǎng)后的增菌液，當溫度處于75～80 ℃時，若系統(tǒng)內(nèi)出現(xiàn)一個峰值，則表示實驗有效，當溫度為85～90 ℃時，會出現(xiàn)峰值，且峰值較大，表示樣品的陽性較強。實驗儀器上270 顯示為陽性，其余2 種樣品顯示為陰性。結(jié)果見圖1～圖4。

表1 環(huán)凱單增李斯特氏菌成套生化鑒定管鑒定結(jié)果

圖1 陽性對照BAX Q7 圖譜

圖2 樣品270 BAX Q7 圖譜

圖3 樣品159 BAX Q7 圖譜

圖4 樣品318 BAX Q7 圖譜

3 結(jié)論與討論

本次能力驗證嚴格依據(jù)GB 4789.30—2016 的檢驗方法，對可疑菌進行鑒定，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品270與陽性菌株的形態(tài)一致，而樣品159 和318 疑似為英諾克李斯特氏菌，而非單核細胞增生李斯特氏菌。在檢測過程中發(fā)現(xiàn)，PALCAM 培養(yǎng)基在區(qū)分單核細胞增生、英諾克李斯特氏菌這兩種菌方面存在一定的局限性，主要原因是PALCAM 培養(yǎng)基中的七葉苷成分，而實驗中的這兩種菌都能水解七葉甙，并與鐵離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，讓菌落顏色反應(yīng)為棕褐色，產(chǎn)生褐色暈圈，所以無法對這兩種菌進行有效區(qū)分[7]。

能力驗證不僅可以衡量實驗室的檢測能力，而且可為實驗室內(nèi)外部質(zhì)控提供有效手段。實驗室通過參加本次檢測能力驗證活動，全面了解本實驗室關(guān)于食品微生物的檢測能力，并且本次能力驗證中所使用的培養(yǎng)基、試劑及實驗儀器設(shè)備等與本實驗室日常實驗工作所使用的一樣，不僅能夠驗證本實驗室的檢測能力及試驗方法、結(jié)果的精確度，還有利于提高本實驗室內(nèi)控質(zhì)量水平和檢驗?zāi)芰Γ瑸楹笃谑称肺⑸餀z驗檢測工作實施提供新思路。