黎海華，羅爾倫，李 蕓，藍勇波

（深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳 518000）

酒中乙醇濃度是評價飲料酒質(zhì)量的重要指標之一，強制性食品安全標準《食品安全國家標準 蒸餾酒及其配制酒》（GB 2757—2012）規(guī)定了氰化物和甲醇的限量指標，氰化物和甲醇均需要用到產(chǎn)品的乙醇濃度進行折算。我國現(xiàn)行的酒的國家標準對乙醇濃度有具體要求。目前酒中乙醇濃度的檢測方法《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》（GB 5009.225—2016）包括密度瓶法、酒精計法、氣相色譜法和數(shù)字密度計法等，但其僅對以前老舊的方法進行了一個匯總，對不合理的地方未加以修訂。例如，氣相色譜法測試過程中未進行20 ℃的恒溫；儀器參數(shù)中使用玻璃填充柱，存在分離效能差、易干擾等缺點，且目前的色譜儀大多采用毛細管柱；內(nèi)標物4-甲基-2-戊醇在水中難于溶解。因此，本研究參考有關(guān)資料[1-5]以及美國分析化學家協(xié)會AOAC官方方法AOAC Official Method 983.13 Alcohol in Wines：Gas Chromatographic Method、AOAC Official Method 984.14 Ethanol in Beer：Gas Chromatographic Method，選擇合適的色譜柱、色譜條件和試驗溫度，建立了以正丙醇作為內(nèi)標測定葡萄酒、果酒及啤酒的氣相色譜法。

1 材料與方法

1.1 材料

流通市場上購買的葡萄酒（乙醇濃度標示值12%vol）、果酒（乙醇濃度標示值11%vol）、啤酒（乙醇濃度標示值4%vol）典型樣品各1 批。

1.2 試劑

乙醇和正丙醇標準品：乙醇（C2H6O，CAS 號：64-17-5，純度≥99.0%），Merck，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準品；正丙醇[CH3（CH2）2OH，CAS 號：71-23-8，純度≥99.0%]，Merck，或經(jīng)國家認證并授予標準物質(zhì)證書的標準品；一級實驗室用水。

1.3 儀器與設(shè)備

7890B 氣相色譜儀（FID）：美國Agilent 公司；K20-NR 恒溫循環(huán)水槽：德國Huber 公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：鍵合/交聯(lián)聚乙二醇固定相石英毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氮；恒流模式；柱流速：1.0 mL·min-1；采用程序升溫：柱初始溫度40 ℃，保持5 min，以3 ℃·min-1速率升溫至55 ℃，再以10 ℃·min-1速率升溫至150 ℃，再以40 ℃·min-1速率升溫至220 ℃，保持5 min；進樣口溫度：200 ℃；檢測器溫度：250 ℃；氫氣流量：30 mL·min-1；空氣流量：350 mL·min-1；進樣量：0.5 μL；進樣方式：分流進樣；分流比：100∶1。

1.4.2 標準溶液的配制

（1）乙醇使用液（10%）。移取恒溫至20 ℃的乙醇10.00 mL 于100 mL 容量瓶中，用20 ℃的水定容至刻度，混勻。臨用現(xiàn)配。

（2）正丙醇內(nèi)標使用液（10%）。移取恒溫至20 ℃的正丙醇10.00 mL 于100 mL 容量瓶中，用20 ℃的水定容至刻度，混勻。臨用現(xiàn)配。

（3）乙醇標準系列工作液。分別移取恒溫至20 ℃的乙醇使用液0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用20 ℃的水定容至刻度，再加入20 ℃的正丙醇內(nèi)標使用液0.50 mL，混勻，得到濃度為0.10%、0.20%、0.50%、1.00%和2.00%的乙醇標準系列曲線。臨用現(xiàn)配。

1.4.3 試樣制備

移取1.00 mL 蒸餾后的試樣（液溫20 ℃）于10 mL 容量瓶中，用20 ℃的水定容至刻度線，加入0.50 mL 恒溫至20 ℃的正丙醇內(nèi)標使用液，混勻。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

以各標準系列溶液的乙醇含量為橫坐標，以乙醇和正丙醇內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。由圖1可知，在乙醇濃度在0.10%～2.00%，標準曲線方程為y=0.801 70x-0.000 42，相關(guān)系數(shù)（r）大于0.999 9。

圖1 乙醇標準曲線

2.2 精密度試驗

本文選擇種類為葡萄酒、果酒、啤酒的樣品進行精密度試驗，其RSD 在0.196%～0.648%，符合《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中對方法精密度的要求，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗測定結(jié)果（n=6）

2.3 加標回收率試驗

本文采用加標回收考察方法的正確性。酒中乙醇為主含量物質(zhì)，不適合直接進行加標測試，需先以蒸餾加熱方式除去乙醇，剩下的樣品基質(zhì)再用100 mL容量瓶定容，作為空白樣品。在空白樣品基質(zhì)中分別加入低、中、高（啤酒：0.10 %vol、4.00 %vol、8.00 %vol；葡萄酒：0.10 %vol、12.0 %vol、18.0 %vol；果酒：0.10 %vol、10.0 %vol、18.0 %vol）3 種濃度的標準溶液覆蓋對應酒類的常用酒精度范圍，每個濃度進行3 平行測定，計算回收率。由表2可知，方法的平均加標回收率在98.2%～100.0%，符合《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中對方法回收率的要求。

表2 加標回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.4 方法比對（t-檢驗法）

依照《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）準確度評價依據(jù)，可根據(jù)已知國家認可的參考方法來評價另一種方法的偏倚，并使用t-檢驗法對分析方法間的顯著性差異進行評估。因此，選取可同時適用GB 5009.225—2016 第一法密度瓶法和本方法檢測的樣品，進行方法對照實驗，以此來對本方法準確度進行考察。選取啤酒、葡萄酒、果酒樣品，使用兩種方法同時測定其乙醇濃度。由表3可知，經(jīng)兩兩配對進行t檢驗，t值在0.60～1.52，均小于2.23[t（0.05,10）=2.23，P=0.95]，說明在95%的置信區(qū)間內(nèi)，兩種檢測方法檢測結(jié)果不存在顯著性差異，說明本方法準確可靠，符合要求。

表3 方法比對試驗結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

本研究建立了測定葡萄酒、果酒及啤酒乙醇濃度的氣相色譜法，對方法中的線性、精密度、加標回收以及t-檢驗等指標進行全方位的方法學驗證，結(jié)果表明該方法精密度好、準確性高，適合于政府監(jiān)督抽查、企業(yè)質(zhì)量控制等，能夠滿足葡萄酒、果酒和啤酒中乙醇濃度的測定要求。