吳 彥，徐赫男，薛 云，劉啟斌，劉 鴻，李志華，陸 漓，許春平

（1.廣西中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，南寧 530001；2.康贊（北京）生物科技有限公司，北京 100176；3.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，鄭州 450002）

近年來，隨著世界控煙形勢的日趨嚴峻，世界各國煙草行業(yè)已把研究和開發(fā)包括口含型煙草在內(nèi)的新型煙草制品作為解決煙草行業(yè)未來發(fā)展瓶頸的重要手段和戰(zhàn)略取向［1，2］。由于口含型煙草制品不經(jīng)過燃燒環(huán)節(jié)，由口腔直接吸收，相對于傳統(tǒng)卷煙，消除了二手煙的危害，世界衛(wèi)生組織認為其安全性更高，是傳統(tǒng)卷煙的理想替代品［3，4］。口含型煙草制品的研發(fā)和銷售在北歐和北美等一些國家和地區(qū)取得了較快發(fā)展，市場銷量不斷增加。然而，美國、瑞典等國家的口含煙制品在口味上并不能廣泛迎合中式卷煙消費群體，中國亟需培育具有中國特色的新型煙草制品以應對國際煙草巨頭的挑戰(zhàn)。

中醫(yī)中藥是中華民族的瑰寶。中醫(yī)學自古以來就有“藥食同源”理論。根據(jù)中藥的功能性配伍，在口含煙中添加從藥食同源的植物中提取的天然成分，不僅具有調(diào)節(jié)口味的傳統(tǒng)功效，而且其含有的活性成分還是對吸煙者健康的有益補充。

羅漢果，葫蘆科多年生藤本植物的果實，被譽為“神仙果”，是國家首批批準的藥食兩用材料之一。羅漢果含豐富的維生素以及糖甙、果糖、葡萄糖、蛋白質、脂類等成分，具有潤肺止咳、生津止渴的功效。因此，將羅漢果提取物添加到口含煙中發(fā)揮其清咽利喉、生津止咳的功效，既能使消費者享受吸煙帶來的滿足感，同時又能減輕煙草中的有害物質對人體造成的傷害。然而，傳統(tǒng)方法提取的天然香料粗提物中不可避免地帶有蛋白質、淀粉、蠟質等大分子物質［5，6］，這些物質會嚴重影響口含煙的吸食體驗。據(jù)文獻報道［7-14］，復合生物酶可以降解植物細胞間質中的大分子成分，使之轉化為單糖、氨基酸和致香物質前體，同時還能破壞植物細胞壁的致密結構，從而改善提取物的口感，提高有效成分的提取得率。

本研究將生物酶解技術應用于功能型口含煙天然香料的提取工藝中，用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術分析化學成分，利用峰面積歸一化法計算各個峰的相對含量，對比了普通水提法和酶解法得到的羅漢果香料的揮發(fā)性化學成分。酶解法不僅能夠優(yōu)化提取物的風味品質，還可以提高致香成分的含量，為研究和開發(fā)具有中國特色的新型煙草制品供了有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羅漢果，購自廣西壯族自治區(qū)桂林市；口含煙基料，上海新型煙草研究院提供；α-淀粉酶、纖維素酶、漆酶、果膠酶、風味蛋白酶由康贊（北京）生物科技有限公司提供；無水乙醇、碳酸氫鈉、丙二醇、山梨酸鉀、木糖醇，國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設備

EYELA N-1300DW型旋轉蒸發(fā)儀、EYELA NVP-2000型隔膜真空泵、EYELA CA-116A型 冷卻水循環(huán)裝置，上海艾朗科技有限公司；HWCL-5型集熱式恒溫磁力攪拌浴，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；GZ120 GZ120.S型懸臂式恒速強力電動攪拌機，江陰市保利科研器械有限公司；303-4B型電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱，余姚市儀器儀表廠；Q-100A3型高速多功能粉碎機，上海冰都電器有限公司；TG-16G型臺式高速離心機，常州市金壇高科儀器廠；Agilent 6890/5973型氣質聯(lián)用儀，美國Agilent公司；MS204S型分析天平，Mettler Toled。

1.3 試驗方法

1.3.1 常規(guī)醇提法制備羅漢果口含煙用香料 將羅漢果粉碎至40目，精確稱取100.00 g羅漢果粉末，置于1 000 mL的圓底燒瓶中，每次加入75%的乙醇600 mL，回流提取2次，每次2 h，將2次浸提液合并，于50℃下減壓濃縮，得到相對密度為1.33的羅漢果浸膏38.75 g。將上述羅漢果浸膏加入100 mL無水乙醇充分回溶，將其回溶液在10 000 r/min的轉速下離心10 min，取上清液，用0.20 μm有機微孔濾膜過濾，得到紅棕色羅漢果口含煙用香料，冷凍待分析。

1.3.2 酶解法制備羅漢果口含煙用香料 將羅漢果粉碎至40目，精確稱取100.00 g羅漢果粉末，置于1 000 mL的圓底燒瓶中。加入50 mL混合酶制劑（其中溶有α-淀粉酶0.2 mol/L、纖維素酶0.3 mol/L、果膠酶0.15 mol/L、風味蛋白酶0.3 mol/L），于55℃下酶解反應2 h。酶解后，將混合物在115℃下高溫處理，使酶制劑中的酶失活。將經(jīng)酶制劑處理過的羅漢果用600 mL 75%的乙醇水溶液于80℃下回流提取2次，每次2 h。將2次浸提液合并，減壓濃縮除去溶劑，制得相對密度為1.32的羅漢果浸膏50.80 g。將上述羅漢果浸膏加入100 mL無水乙醇充分回溶，將其回溶液在10 000 r/min的轉速下離心10 min，取上清液，用0.20 μm有機微孔濾膜過濾，得到棕褐色羅漢果口含煙用香料，冷凍待分析。

1.3.3 羅漢果煙用香料的GC-MS分析

1）樣品的預處理。準確稱取20.00 g制備好的樣品于1 L圓底燒瓶中，加入300 mL去離子水和適量沸石，同時蒸餾萃取裝置的另一端為裝有40 mL二氯甲烷的250 mL圓底燒瓶，在水浴溫度60℃下萃取2 h。萃取完畢后，向萃取液中加入0.2 mL內(nèi)標溶液（稱取0.50 g硝基苯置于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度），減壓濃縮至2 mL，用無水硫酸鈉干燥，然后進行GC/MS分析。每個樣品平行測定5次。

2）GC/MS分析。GC/MS分析條件：HP-5MS毛細管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250℃；程序升溫：初始溫度50℃，維持3 min，以5℃/min升溫 至260℃，維 持5 min；汽 化 溫度：270℃；載氣：He，1 mL/min；分流比：5∶1；電離方式：電子轟擊（EI）；檢測器溫度：300℃；傳輸線溫度：280℃；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；質量掃描范圍：30～700 amu；檢索譜庫：NIST11譜庫。

1.3.4 羅漢果風味袋裝口含煙的制備 取4份50 g口含煙基料，分別加入5、10、15、20 g口含煙用羅漢果提取物，5 g甜味劑（50%的蜂蜜和50%的木糖醇），在溫度為80℃的條件下，于恒溫恒濕箱中濕熱處理2 h。將濕熱處理后的煙草物料水分含量調(diào)節(jié)到40%。在水分調(diào)節(jié)后的物料中加入2.0 g碳酸氫鈉作為酸堿調(diào)節(jié)劑并混合均勻。在酸堿調(diào)節(jié)后的混合物料中噴灑加入3 g食用薄荷精油。在加香后的物料中添加2 g維生素E、0.15 g山梨酸鉀和2 g丙二醇，密封平衡后用熱封過濾紙包裝成小袋，紫外殺菌處理后即得羅漢果風味的袋裝口含煙制品。

2 結果與分析

2.1 樣品特征描述

通過普通醇提法和酶解法制備的羅漢果口含煙用香料的外觀、收率及香型特征如表1所示。由表1可知，酶解法提取的羅漢果口含煙用香料收率為50.80%，明顯高于普通醇提法的收率38.75%，原因是復合酶可以破壞細胞間質的致密成分，從而減少細胞滲透阻力，促使有效成分充分溶出。2種提取方法得到的羅漢果浸膏都具有羅漢果的特征香味，酶解提取法得到的羅漢果浸膏顏色加深，香氣更加醇厚，層次感更加豐富，原因是生物酶可以降解羅漢果中的淀粉、蛋白質、鞣酸等對口味不利的大分子物質，使之轉化為氨基酸、單糖等小分子物質和致香物質前體，從而改善和豐富提取物的口感。

表1 不同提取方法制備的羅漢果香料的外觀及香型特征

2.2 GC/MS分析鑒定結果

對羅漢果提取物選用HP-5MS毛細管柱，進樣0.5 μL，利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行分析鑒定，采用峰面積歸一法，定量出各化學成分的相對質量分數(shù)。按照上述GC-MS分析條件對羅漢果揮發(fā)性化學成分進行分析，通過譜庫檢索（譜庫：NIST11譜庫），醇提法和酶解法分別鑒定出揮發(fā)性半揮發(fā)性成分22種和30種，分析結果如表2和表3所示。

表3 羅漢果提取物揮發(fā)性香味化學成分的GC-MS分析結果（酶解法）

從表2可以看出，醇提法提取的羅漢果浸膏中，共分離并鑒定出了22種化合物，所鑒定的組分占總峰面積的92.60%。主要成分有角鯊烯（14.32%）、順式十八碳-9-烯酸（12.58%）、香葉基芳樟醇（12.48%）、棕櫚酸（10.26%）、香葉基香葉醇（9.27%）、硬脂酸（8.47%）、2-亞甲基-5α-膽甾烷-3β-醇（7.36%）、5-羥甲基糠醛（4.28%）等。

表2 羅漢果提取物揮發(fā)性香味化學成分的GC-MS分析結果（醇提法）

從表3可以看出，酶解法提取的羅漢果浸膏中，共分離并鑒定出了30種化合物，所鑒定的組分占總峰面積的95.83%。主要成分有糠醛（12.46%）、香葉基香葉醇（13.34%）、棕櫚酸（12.43%）、香葉基芳樟醇（9.26%）、硬 脂 酸（6.25%）、5-羥 甲 基 糠 醛（6.21%）、2-亞甲基-5α-膽甾烷-3β-醇（5.78%）、2-乙?；量?.27%）等。

比較分析表2和表3，醇提法和酶解法提取的羅漢果香料中致香物質的成分和含量存在一些差異，采用醇提法制備的羅漢果浸膏中，含量較高的致香成分主要有酸類、烯烴類、醇類和醛類等。酶解法制備的羅漢果浸膏中，主要致香成分除了醛類、醇類和酸類外，還包括酯類和雜環(huán)類等化合物。酶解法提取的羅漢果香料中含有5-羥甲基糠醛、角鯊烯、金合歡醇、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、香葉基香葉醇、香葉基芳樟醇、順-β-金合歡烯等豐富的香味成分物質，其中，5-羥甲基糠醛具有似焦糖、谷物烘烤氣息，有果香、面包香；角鯊烯是煙葉中非色素的萜烯類物質，既能增進煙葉的香氣和吸味，又可通過降解轉化形成致香成分；金合歡醇［15］具有特有的鈴蘭花香氣，并有青香和木香香韻；順-β-金合歡烯、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮等也是煙葉中的重要致香成分。

酶解法提取的羅漢果浸膏致香成分的種類更加豐富，原因是復合酶制劑可以使對口味不利的蛋白質、淀粉、鞣酸、蠟質等大分子物質分解和轉化為致香物質前體，從而促進致香物質的積累和生成。

2.3 羅漢果提取物添加到口含煙的感官評價結果

將酶解法制備的羅漢果提取物添加到口含煙基料中，按“1.3.4”方法制成袋裝口含煙制品。組織專業(yè)人員進行感官評價，結果表明，該香料添加量為口含煙基料的質量百分比30%時口感最佳，羅漢果的香味醇厚，口味甘甜，潤肺止渴生津，且與煙草本身所特有的味道完美融合，口感純正。

3 小結

酶解法提取的羅漢果香料致香成分含量豐富，適用于口含煙加香。將該香料按照質量比30%添加到袋裝口含煙中，羅漢果的香味醇厚，口味甘甜，潤肺止渴生津，且與煙草本身所特有的味道完美融合。該羅漢果提取物豐富了袋裝口含煙制品的風格特征，改善了袋裝口含煙口感協(xié)調(diào)舒適性，既滿足了吸食者的心理需求，又保護了吸食者的身體健康，賦予產(chǎn)品多元化功能。