蔡英麗，劉 偉，劉高磊，郭孟配，何培新，馬曉龍

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，武漢 430345；2.中國科學(xué)院昆明植物研究所，昆明 650201；3.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

羊肚菌［Morchellaspp.］隸屬于子囊菌門（Ascomycota）盤菌綱（Pezizomycetes）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬（MorchellaDill.Pers.），是世界范圍內(nèi)著名的食藥用菌［1］。羊肚菌屬整體分為紅色羊肚菌（Rufobrunnea Clade）、黃色羊肚菌（Esculenta Clade）和黑色羊肚菌（Elata Clade）［1］。其中，被馴化的羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種有7個（已明確分類地位），包括黑色支系的梯棱羊肚菌（Morchella importuna）、六妹羊肚菌（Morchella sextelata）、超群羊肚菌（Morchella eximia）［2-5］、頭絲羊肚菌（Morchella exuberans）、歐氏羊肚菌（Morchella owneri）和Mel-13［6］（后3種未有詳細(xì)的栽培報道）；紅色支系的變紅羊肚菌（Morchella rufubrunnea）［7-9］，該物種主要分布于歐洲和美洲。

目前國內(nèi)規(guī)?；耘嗟奈锓N主要為梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌（其栽培面積占整個產(chǎn)業(yè)的80%～90%），以及少量的超群羊肚菌［10，11］。菌種是羊肚菌栽培成功的關(guān)鍵。市場上流通的菌種名稱多種多樣，絕大多數(shù)為所有者自由命名，能稱為品種（Variety）的只有“川羊肚菌”系列（均為梯棱羊肚菌）［12-14］，其他的屬于菌株（Strain）。不同羊肚菌品種或菌株的生態(tài)適應(yīng)性和農(nóng)藝性狀有所差異。例如六妹羊肚菌6號菌株（自由命名）在抗高、低溫方面具有明顯優(yōu)勢，但子實體肉質(zhì)松軟、易碎；梯棱羊肚菌4號菌株（自由命名）抗性較差，但子實體呈寬圓錐形，肉質(zhì)較厚，菌柄較短小，商品性強［11］。此外，之前對7株梯棱羊肚菌的品比試驗發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)菌株的產(chǎn)量約是低產(chǎn)菌株的5倍，出菇密度也相差約3倍［15］。因此，有必要對選育的品種或菌株的生態(tài)適應(yīng)性進行研究，并對農(nóng)藝性狀進行描述記錄。

武漢市屬北亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候。10月之后進入初秋，氣溫會逐漸下降，平均氣溫為20～25℃；從12月底到次年2月是冬季，冬季的平均氣溫一般為1～3℃，3月后進入初春，氣溫回升很快，最高氣溫可以達20℃以上，具有降溫慢、回溫快的特點。本試驗對來自全國不同地區(qū)的47株多孢或組織分離栽培菌株在武漢市進行栽培比較，評價這些菌株在武漢市氣候條件下的生態(tài)適應(yīng)性，進而為后期羊肚菌育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

47株供試羊肚菌菌株的詳細(xì)信息見表1。原始羊肚菌子囊果采集自貴州、四川、湖北、重慶、云南、甘肅、河北等地20個城市的野生環(huán)境或羊肚菌栽培地區(qū)，通過多孢或組織分離，共獲得47株羊肚菌菌株；在前期研究中通過ITS序列測序、比對確定了其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位［2，4，10］。47株羊肚菌均屬于黑色羊肚菌支系，其中，3株為超群羊肚菌，20株為梯棱羊肚菌，剩余24株為六妹羊肚菌。

表1 47株羊肚菌的分類地位及來源

1.2 培養(yǎng)基

菌種制作流程參考文獻［5，10］。

1.2.1 母種18 mm×180 mm試管，PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g，去離子水1 L，pH自然。

1.2.2 原種750 mL玻璃瓶，配方：小麥50 g，木屑180 g，腐殖質(zhì)土30 g，生石灰1%，石膏2%。

1.2.3 栽培種15 cm×30 cm聚丙烯塑料袋，配方：小麥150 g，木屑200 g，腐殖質(zhì)土40 g，生石灰1%，石膏2%；原種、栽培種制作時含水量控制在65%，高壓蒸汽滅菌。18～23℃發(fā)菌，菌種長滿袋后一周內(nèi)使用。

1.2.4 外源營養(yǎng)袋12 cm×24 cm聚丙烯塑料袋，配方：小麥120 g，谷殼20 g，木屑40 g，腐殖質(zhì)土20 g，生石灰1%，石膏2%；含水量65%～70%，0.15 MPa高壓蒸汽滅菌2 h，冷卻后使用。

1.3 大棚栽培模式及區(qū)試設(shè)置

在武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院北部園區(qū)，采用大棚套小拱棚模式開展羊肚菌栽培試驗。栽培大棚規(guī)格為長度40.0 m，寬度8.0 m，棚肩高度1.5 m，頂高3.0 m，栽培大棚采用外遮陽模式，遮陽率為80%～90%。本試驗共使用了5個大棚，每個棚內(nèi)設(shè)置47個栽培小區(qū)，規(guī)格為畦長度3.80 m、畦面寬1.20 m、畦高0.15 m、畦間寬0.20 m，每個小區(qū)栽培面積4.56 m2。47株羊肚菌菌株隨機播種在每個大棚的栽培小區(qū)內(nèi)，每個菌株重復(fù)5次。

1.4 栽培管理

栽培管理參考文獻［5］，略有改動。播種前1個月在棚內(nèi)撒石灰，用量約300 g/m2，翻耕均勻；調(diào)節(jié)土壤含水率為20%～25%，在整理好的廂面上按照0.4 kg/m2的菌種使用量進行撒播，之后覆土3～5 cm，覆蓋黑色農(nóng)用地膜，進入養(yǎng)菌階段；播種后7～15 d，每個小區(qū)均勻放置16袋外源營養(yǎng)袋，在營養(yǎng)袋下部劃口，均勻扣在長滿菌絲的廂面上。次年春天，地溫升至5～7℃時，撤去地膜，移走外源營養(yǎng)袋，滴灌澆水，進行催菇；此時搭建小拱棚，高0.5 m；原基發(fā)生后，噴水管理采用霧化微噴方式，保持土壤含水率20%～28%，空氣相對濕度80%～95%，確保子囊果的正常發(fā)育。

1.5 性狀測量

統(tǒng)計并計算47株羊肚菌菌絲在栽培菌袋中的生長速度及密度、菌核有無、大小及密度和滿袋時間，每個菌株統(tǒng)計5袋。

在子囊果子實層裸露，即棱紋展開、凹坑明顯時進行采摘［16］。采收時用刀將菌柄基部割下，稱重并計數(shù)，用于計算平均產(chǎn)量、子實體密度及單菇鮮重。

1.6 數(shù)據(jù)處理和分析

利用IBM SPSS Statistics 25軟件中的鄧肯多重比較方法對數(shù)據(jù)進行生物學(xué)統(tǒng)計分析，利用皮爾森相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 47株羊肚菌菌絲生長特性比較分析

47株羊肚菌在栽培袋中菌絲滿袋時間、菌絲密度、菌絲長速以及菌核有無、菌核密度及大小和位置存在明顯差異（表2）。菌絲滿袋時間為26～41 d，菌絲長速為0.16～0.44 mm/h。菌株WHM37、WHM38、WHM22、WHM44和WHM20菌 絲 長 速 最 快，超 過0.40 mm/h，滿袋時間最短，為26～28 d；菌株WHM02、WHM28、WHM17、WHM25、WHM15和WHM18菌絲長速低于0.25 mm/h，滿袋時間≥41 d，其中，WHM15和WHM28的菌絲密度極低，顯著弱于其他菌株。整體來看，菌絲長速與滿袋時間成反比關(guān)系。WHM01、WHM02、WHM03、WHM15、WHM28和WHM29共6株菌株不產(chǎn)生菌核，其他菌株產(chǎn)生的菌核多數(shù)在菌袋頂部及中上部，少數(shù)在中部產(chǎn)生，菌核密度及大小不一。由47株羊肚菌的菌絲生長特性比較分析可知，菌絲長勢極弱的菌株可能不會產(chǎn)生菌核。

表2 47株羊肚菌的菌絲生長特性比較分析

2.2 羊肚菌子實體農(nóng)藝性狀比較及相關(guān)性分析

采用大棚套小拱棚的模式進行羊肚菌栽培。播種 日期 為2020年12月10日，采 收期 為2021年2月24日至3月18日。栽培結(jié)果顯示，除了菌株WHM01和WHM02（2株均為超群羊肚菌）、WHM12（梯棱羊肚菌）、WHM28（六妹羊肚菌）未出菇外，其他43個羊肚菌菌株均正常出菇（表3）。利用鄧肯多重比較分析得知，不同羊肚菌菌株的平均產(chǎn)量、出菇密度、單菇鮮重均存在顯著差異。5株梯棱羊肚菌 菌 株（WHM05、WHM09、WHM13、WHM16和WHM20）的平均產(chǎn)量均超過400 g/m2，出菇密度均超過60個/m2，其中菌株WHM05和WHM13的 平均產(chǎn)量最高，分別為557.98、685.61 g/m2，同時出菇密度也最大，分別為93.03、95.83個/m2；但這5個菌株的單菇鮮重較低，均低于8.00 g。此外，3株六妹羊肚菌菌株（WHM 36、WHM43和WHM44）的平均產(chǎn)量均超過400 g/m2，菌株WHM36的出菇密度相對較高，約為50個/m2，但單菇鮮重較低，為8.75 g；而菌株WHM43和WHM44的出菇密度相對較低，分別為36.65、27.18個/m2，但單菇鮮重較高，分別為13.66、16.07 g。其 次，2株梯棱羊肚菌（WHM07和WHM14）和6株六妹羊肚菌菌株（WHM34、WHM35、WHM 37、WHM38、WHM39和WHM47）的平均產(chǎn)量超過300 g/m2，出菇密度為28～52個/m2。4株梯棱羊肚菌（WHM08、WHM10、WHM15和WHM19）和4株六妹羊肚菌菌株（WHM24、WHM29、WHM30和WHM 32）的平均產(chǎn)量低于150 g/m2，出菇密度極低，均小于14個/m2；雖然其中的WHM32菌株的單菇鮮重最高（約20 g），但由于其出菇密度僅為6.23個/m2，因此其平均產(chǎn)量不高。惟一1株出菇的超群羊肚菌WHM03，其單菇鮮重相對較高，為12.22 g，而其出菇密度只有18.51個/m2，因此，平均產(chǎn)量相對較低，為218.51 g/m2。

表3 43株羊肚菌的子實體農(nóng)藝性狀比較分析

對43株羊肚菌菌株的平均產(chǎn)量、出菇密度和單菇鮮重之間的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果（表4）顯示，平均產(chǎn)量與出菇密度之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.913，呈極顯著正相關(guān)（P=0）；出菇密度與單菇鮮重之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)為-0.484，呈極顯著負(fù)相關(guān)（P=0.001）；平均產(chǎn)量與單菇鮮重之間無顯著相關(guān)性。相關(guān)性分析表明，出菇密度是影響羊肚菌產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。

表4 43株羊肚菌子實體農(nóng)藝性狀間的相關(guān)系數(shù)

此外，對六妹羊肚菌（WHM24至WHM47）和梯棱羊肚菌（WHM04至WHM23）的出菇密度和單菇鮮重比較分析發(fā)現(xiàn)，在出菇密度上前者［（25.54±11.36）個/m2］普遍低于后者［（38.50±26.84）個/m2］，而在單菇鮮重上前者［（11.58±3.19）g］普遍高于后者［（8.42±2.13）g］。從圖1也可以看出，梯棱羊肚菌（代表菌株WHM20）的出菇密度大，但子實體的菌蓋短、菌柄長粗、肉質(zhì)?。ǖ湫偷母邷匾鸬幕伟l(fā)育），抗雜能力差；而六妹羊肚菌（代表菌株WHM35、WHM36和WHM47）的出菇密度一般，但子實體的菌蓋長、菌柄短細(xì)、肉質(zhì)厚，抗雜能力強。這表明梯棱羊肚菌的出菇能力較強，但對高溫耐性和抗雜能力較弱，而六妹羊肚菌的出菇能力較弱，但能夠耐高溫且抗雜能力強。

圖1 羊肚菌出菇情況及子實體形態(tài)（部分）

3 討論

本試驗收集了47株來自20個城市的羊肚菌生產(chǎn)區(qū)的栽培菌株，對其在武漢市（高溫）氣候的栽培適應(yīng)性進行了評價。結(jié)果表明，不同羊肚菌物種及同一物種下的不同菌株對環(huán)境適應(yīng)性存在顯著性差異。WHM05、WHM09、WHM13、WHM16、WHM20等菌株雖然產(chǎn)量高且出菇密度大，但是肉質(zhì)薄、抗雜菌能力較弱；WHM10、WHM22、WHM24、WHM32、WHM40等菌株單菇鮮重較高、肉質(zhì)厚且抗雜菌能力較強，但是出菇密度和產(chǎn)量較低；這些菌株在武漢市的氣候條件下表現(xiàn)出相對較弱的適應(yīng)性。WHM43和WHM44菌株的產(chǎn)量較高、出菇密度適中、單菇鮮重較高、菇型好且抗雜菌能力較強，在武漢市氣候條件下表現(xiàn)出相對較強的適應(yīng)性，這種差異性在本質(zhì)上是由遺傳物質(zhì)決定的。劉偉等［17］利用14條RAPD引物在來自全國的26個梯棱羊肚菌和10個六妹羊肚菌栽培菌株（包括本試驗中的大部分菌株）中共擴增出124條多態(tài)性條帶，表明2種羊肚菌在種間和種內(nèi)均具有遺傳多樣性。

本研究顯示，羊肚菌的平均產(chǎn)量與出菇密度呈極顯著正相關(guān)，與單菇鮮重?zé)o顯著相關(guān)性，而出菇密度與單菇鮮重呈極顯著負(fù)相關(guān)。Gong等［1］對2個香菇測交群體的農(nóng)藝性狀進行了評價與分析，相關(guān)性分析表明，單菇重和菇數(shù)作為香菇產(chǎn)量構(gòu)成因素，它們之間相互制約：菇數(shù)對產(chǎn)量具有較強的正效應(yīng)，而與單菇重互作的負(fù)效應(yīng)部分減弱了對產(chǎn)量的正效應(yīng)；單菇重對產(chǎn)量也有直接的正效應(yīng)，但與菇數(shù)互作負(fù)效應(yīng)抵消了直接的正效應(yīng)。在香菇產(chǎn)量的2個組成因素中，菇數(shù)與產(chǎn)量的影響更大，是更為關(guān)鍵的組分，本研究結(jié)果與其相似。在以后的羊肚菌育種過程中，突出對出菇數(shù)的選擇，兼顧單菇重，對產(chǎn)量的提高可能更有利。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)菌核且菌絲長速極慢的羊肚菌菌株不產(chǎn)生子實體。劉偉等［18］提出了一套包括菌株身份（Identity）識別、交配型基因（Mating type）檢測和菌株活力（Vitality）測定在內(nèi)的羊肚菌生產(chǎn)菌株栽培適宜性IMV評價系統(tǒng)，其中包括了對菌絲長勢和菌核產(chǎn)生的評價。此外，相關(guān)研究及生產(chǎn)實踐表明不產(chǎn)生菌核的菌株不宜用于規(guī)?；a(chǎn)［19］。因此，菌種生產(chǎn)過程中要對菌種質(zhì)量進行評價。

根據(jù)本研究結(jié)果，可篩選出菇密度大（P1）、子囊果形態(tài)好、耐儲存（P2）菌株作為親本，通過單孢雜交、多孢雜交、原生質(zhì)體融合等手段，輔以分子標(biāo)記技術(shù)，開展針對溫型、產(chǎn)量、品質(zhì)等目標(biāo)的育種工作。