朱秀紅，張記鐘，李哲靜，張淑靜，茹廣欣

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，鄭州 450002）

在工農(nóng)業(yè)快速發(fā)展的當(dāng)今時(shí)代，越來(lái)越多的有毒有害物質(zhì)排放到生態(tài)環(huán)境中，人們面臨的污染問(wèn)題日益嚴(yán)重。尤其在生產(chǎn)活動(dòng)中，由于農(nóng)藥化肥的不合理施用、工業(yè)三廢的過(guò)度排放，導(dǎo)致大量重金屬進(jìn)入土壤中。其中，鉛（Pb）和鎘（Cd）為植物生長(zhǎng)的非必需元素，也是主要的重金屬污染物［1］。當(dāng)土壤中Pb和Cd濃度超過(guò)一定范圍時(shí)，會(huì)對(duì)植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生一定的毒害作用，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致植株中毒死亡。

泡桐（Paulownia fortunei）原產(chǎn)于中國(guó)，自然分布或栽培區(qū)遍布全國(guó)23個(gè)?。ㄊ校?、自治區(qū)，是一種重要的優(yōu)質(zhì)速生用材樹(shù)種，在中國(guó)林業(yè)生產(chǎn)中占有特殊地位。泡桐質(zhì)輕、紋理美觀、不易燃燒、不易變形，易干燥、易加工，主要用于生產(chǎn)單板類人造板。此外，相比生物量小的超富集植物，泡桐具有速生、豐產(chǎn)、生物量大、材質(zhì)優(yōu)良、繁育便捷、栽培時(shí)間長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)。但目前為止，關(guān)于泡桐的研究多集中在遺傳選育與繁殖技術(shù)［2］、栽培與造林技術(shù)［3］、病蟲(chóng)害防治［4］、黃酮類化合物提取［5］、生物質(zhì)燃料制備［6］等方面，而有關(guān)泡桐在重金屬脅迫下的生長(zhǎng)生理狀況鮮有研究報(bào)道。

鑒于此，本研究以泡桐1201幼苗為研究對(duì)象，測(cè)定在Pb、Cd脅迫影響下，其幼苗生物量、生理生化指標(biāo)和亞細(xì)胞分布的一系列變化，從植株和細(xì)胞2個(gè)層次上探究泡桐1201幼苗對(duì)Pb、Cd的吸收規(guī)律及耐性機(jī)理，為泡桐在重金屬污染修復(fù)方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

泡桐1201種子來(lái)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室毛莊科教園區(qū)。于2021年6月下旬，在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始試驗(yàn)。選取大小一致、飽滿健康的泡桐種子，經(jīng)H2O2消毒后，用去離子水浸種24 h催芽，后再置于發(fā)芽盒中待其萌發(fā)，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)加入1/8 Hongland營(yíng)養(yǎng)液，促進(jìn)其生長(zhǎng)，2.5 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)一周時(shí)將幼苗置于1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，后移至Hongland完全營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。充分緩苗后，進(jìn)行重金屬脅迫處理，并觀察其長(zhǎng)勢(shì)。

1.2 方法

試驗(yàn)選取長(zhǎng)勢(shì)良好、健康茁壯的泡桐1201幼苗，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，調(diào)整間距，使幼苗受光均勻。采用CdCl2為Cd源、Pb（CH3COO）2·3H2O為Pb源，加入營(yíng)養(yǎng)液中對(duì)幼苗進(jìn)行脅迫處理。試驗(yàn)設(shè)置9個(gè)水平處理，Pb脅迫處理濃度分別為0 mg/L（CK）、100 mg/L（A2）、300 mg/L（A3）、500 mg/L（A4）和800 mg/L（A5）；Cd脅迫處理濃度分別為0 mg/L（CK）、10 mg/L（B2）、20 mg/L（B3）、30 mg/L（B4）和40 mg/L（B5）。各處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株苗。連續(xù)脅迫30 d后，采取樣品，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1 泡桐1201生物量的測(cè)定 去離子水洗凈幼苗，濾紙吸干表面水分，用剪刀將植株根、莖、葉剪開(kāi)，烘箱調(diào)至105℃，殺青2 h，后調(diào)至80℃烘干至恒重，用萬(wàn)分之一電子天平測(cè)定根、莖、葉各部位生物量。

1.3.2 泡桐1201對(duì)重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)及富集系數(shù)的測(cè)定 根部及葉片Cd、Pb含量的測(cè)定：用去離子水沖洗干凈幼苗，后用20 mmol/L Na2-EDTA溶液浸泡根系10 min，解吸其表面附著的Pb2+、Cd2+，用去離子水沖洗干凈，并用濾紙吸干表面水分，105℃殺青15 min，70℃下烘干至恒重，粉碎后過(guò)2 mm篩。混酸消解后用原子吸收分光光度計(jì)（AASZEEnit 700型）測(cè)量。具體公式如下。

1.3.3 泡桐1201丙二醛含量的測(cè)定 酶液制備：分別稱取0.1 g根、葉鮮樣于研缽中，加入pH 7.8的H3PO4緩沖液1.0 mL，冰浴研磨至勻漿，倒入離心管，冷凍離心20 min，所得上清液即為酶液，0～4℃下保存。

丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法［8］。反應(yīng)液制備：先稱取0.6 g TBA，用少量1 mol/L NaOH溶解，再用10% TCA（三氯醋酸）定容至100 mL。取0.5 mL酶液，向其加入1 mL 0.6% TBA，封口沸水浴15 min，取出后迅速冷卻離心10 min，取上清液，測(cè)定其在600、532、450 nm處的波長(zhǎng)。計(jì)算公式如下。

1.3.4 泡桐1201抗氧化酶活性的測(cè)定 酶液制備和MDA活性測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法［9］。反應(yīng)液配制為H3PO4緩沖液：C6H11NO3S∶NBT∶EDTA-Na2∶核黃素∶H2O=15∶3∶3∶3∶2.5。測(cè)定步驟：取6.5 μL酶液，向其加入1.0 mL反應(yīng)液，光照30 min，對(duì)照和空白組均用緩沖液代替，空白組放在暗處，對(duì)照和酶液組光照后避光保存，空白調(diào)零，于560 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。每隔1 min讀數(shù)1次，共讀3次，每分鐘吸光度變化值表示酶活力的大小。

過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法［10］。反應(yīng)液制備：取50 mL 0.1 mol/L pH為6.0的H3PO4緩沖液于燒杯中，向其加入28 μL的C7H8O2，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓鋮s后加入219 μL 30%的H2O2，0～4℃保存。測(cè)定步驟：取6.5 μL酶液和1.0 mL反應(yīng)液于比色皿內(nèi)，于470 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。

過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用雙氧水法［11］。反應(yīng)液制備：取20 μL 0.1 mol/L酶液和1.0 mL反應(yīng)液于比色皿內(nèi)，于240 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。以pH 7.0的H3PO4緩沖液為對(duì)照調(diào)零。

1.3.5 泡桐1201滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定

1）游離脯氨酸含量的測(cè)定。采用酸性茚三酮法［9］。稱取0.1 g鮮樣，向其加入1.0 mL 3%磺基水楊酸溶液，沸水浴中浸提10 min，取出樣品并冷卻至室溫，吸取1.0 mL濾液，加入1.0 mL CH3COOH和1.5 mL酸性C9H6O4，沸水浴30 min。冷卻后加入4 mL甲苯，搖蕩30 s，靜置片刻，取上層液于10 mL離心管中，3 000 r/min高速離心5 min。取反應(yīng)后上層紅色溶液于比色杯中，于520 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。

2）可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）染料結(jié)合法［12］。酶液的提?。悍Q取1.0 g根或葉鮮樣于研缽中，加5.0 mL冰浴研磨至勻漿，然后移入離心管中，靜置30～60 min以充分提取，后在4℃低溫、4 000 r/min條件下高速離心20 min，上層清液即為提取到的可溶性蛋白質(zhì)溶液。反應(yīng)液配制：取0.1 g G-250于試管中，加入50 mL 90%乙醇溶解，再加100 mL 85%磷酸緩沖液，去離子水定容至1 000 mL，于棕色瓶中保存。測(cè)定時(shí)的具體操作：取10 μL可溶性蛋白質(zhì)提取液和1.5 mL G-250充分振蕩混合均勻，靜置2 min，空白組為6.5 μL磷酸緩沖液加1.0 mL G-250，于595 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。

3）可溶性糖含量的測(cè)定。采用蒽酮比色法［13］。切取樣品0.5 g置于研缽內(nèi)，加入去離子水和少量石英砂研磨至勻漿，將研磨后的物質(zhì)定容至100 mL的容量瓶中，于室溫下靜置30 min，并每隔5 min上下混勻1次，過(guò)濾棄去殘?jiān)?。取幾個(gè)干凈的試管，分別加入1 mL樣品和5 mL蒽酮試劑，搖勻后置于沸水浴中加熱10 min，取出冷卻至室溫后，取比色皿在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值。

1.3.6 非蛋白巰基化合物（NPT）含量的測(cè)定 參照Keltjens法［14］。分別稱取1.0 g根、葉鮮樣于研缽中，加入2.0 mL 3%的磺基水楊酸溶液和干凈的石英砂，冰浴研磨至勻漿，后在4℃、8 000 r/min條件下，冷凍離心5 min。取300 μL上清液于試管中，向其加 入630 μL 0.5 mol/L pH為7.5的H3PO4緩 沖 液 和25 μL 6.3 mmol/L的2-硝基苯甲酸，靜置20 min，于421 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。

谷胱甘肽（GSH）含量測(cè)定：分別稱取0.5 g根、葉鮮樣于研缽中，剪碎，加入5.0 mL 5.0%的C2HCl3O2和干凈的石英砂，冰浴研磨至勻漿，后在4℃、15 000 r/min條件下，冷凍離心10 min。取2.0 mL上清液于比色皿中，向其加入2.6 mL pH為7.7的H3PO4緩沖液和0.18 mL DTNB，H3PO4緩沖液作空白對(duì)照，搖勻，靜置5 min，于421 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。

螯合肽（PCs）含量為NPT總量與GSH含量二者之差。

1.3.7 亞細(xì)胞中重金屬濃度的測(cè)定 亞細(xì)胞組分的提取參照Xin等［15］的方法。取根、莖、葉鮮樣各0.5 g置于研缽中，加入5 mL預(yù)冷（4℃）提取液［50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、250 mmol/L蔗 糖 和1.0 mmol/L C4H10O2S2］，研磨成勻漿，高速離心（3 000 r/min離心15 min）沉淀（F1）主要為細(xì)胞壁組分。上清液繼續(xù)高速離心（12 000 r/min）30 min，得到沉淀（F2）主要為細(xì)胞器組分，剩余上清液（F3）為可溶組分（包括細(xì)胞液和液泡）。分離后的F1和F2組分分別裝入5 mL離心管中，經(jīng)HNO3-HClO4消化后用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀ICP-AES（IRIS Intrepid II）測(cè)定Pb、Cd濃度，F(xiàn)3組分直接稀釋后測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得最終數(shù)據(jù)使用Excel 2016、SPSS 20.0軟件完成統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素ANOVA完成試驗(yàn)處理，利用Duncan’s法進(jìn)行多重比較（α=0.05），所有圖表均使用Excel 2016軟件制作完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗生物量的影響

通過(guò)方差分析（表1）可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗生物量產(chǎn)生存在顯著性差異。Pb、Cd脅迫下，隨著脅迫濃度的增加，泡桐1201幼苗各部位干重和整株總干重均呈略微升高后顯著降低的趨勢(shì)。其中，A2、A3處理下，幼苗根、莖、葉干重和總干重相比對(duì)照（CK）分別增加44.00%、19.05%、24.14%、13.46%和12.00%、9.52%、-1.72%、3.85%。B2處理下，幼苗根、莖、葉干重和總干重相比CK分別增加12.01%、4.76%、5.17%、6.73%。隨著脅迫濃度的增加，幼苗生物量顯著降低，其中，A5處理下，幼苗根、莖、葉干重和總干重分別為對(duì)照的76.02%、52.38%、65.52%、65.38%；B5處理下，幼苗根、莖、葉干重和總干重分別為對(duì)照的44.00%、38.10%、53.45%、48.08%。

表1 Pb、Cd脅迫對(duì)幼苗生物量的影響

綜上可知，一定濃度（Pb≤100 mg/L、Cd≤10 mg/L）下，泡桐1201幼苗生物量相比CK升高，且Pb脅迫下的促進(jìn)作用更強(qiáng)，Cd脅迫下的促進(jìn)作用較弱；但當(dāng)脅迫濃度超過(guò)一定范圍（Pb>100 mg/L、Cd>10 mg/L）時(shí)，泡桐1201幼苗總生物量顯著受到抑制。

2.2 泡桐1201幼苗對(duì)Pb2+、Cd2+的轉(zhuǎn)運(yùn)及富集

由表2可知，Pb、Cd脅迫下，泡桐1201幼苗各部位重金屬含量均表現(xiàn)為根＞葉＞莖，隨著脅迫濃度的增加，各部位生物富集系數(shù)及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均呈下降趨勢(shì)。Pb脅迫下，根部Pb離子含量為69.47～285.63 mg/kg，葉片Pb離子含量為21.13～32.16 mg/kg，莖部Pb離子含量為10.12～25.97 mg/kg；Cd脅迫下，根部Cd離子含量為60.25～195.29 mg/kg，葉片Cd離子含量為25.02～41.44 mg/kg，莖部Cd離子含量為11.76～21.33 mg/kg。上述結(jié)果表明，重金屬離子在泡桐1201幼苗體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)能力較弱，且幼苗根部為吸收重金屬離子的主要部位。

表2 Pb、Cd脅迫對(duì)幼苗各部位的重金屬離子濃度和生物轉(zhuǎn)移系數(shù)及富集的影響

2.3 Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗MDA含量的影響

通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗MDA活性產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。由圖1可知，隨著重金屬脅迫濃度的增大，泡桐1201根部及葉片MDA含量均呈增加的趨勢(shì)，且隨著重金屬離子濃度的升高，MDA的含量也逐漸增高。其中，A2、A3、A4、A5處理下泡桐1201根部MDA含量分別為對(duì)照處理的1.02、1.05、1.27、1.37倍，葉片MDA含量分別為對(duì)照處理的1.05、1.08、1.15、1.26倍；B2、B4、B5處理下泡桐1201根部MDA含量分別為對(duì)照處理的1.05、1.37、1.43倍，葉片MDA含量分別為對(duì)照處理的1.10、1.18、1.31倍，而B(niǎo)3處理下泡桐1201根部、葉部MDA含量均與對(duì)照處理相當(dāng)。

圖1 Pb、Cd脅迫對(duì)幼苗MDA含量的影響

2.4 Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗抗氧化酶活性的影響

2.4.1 Pb、Cd脅迫對(duì)SOD活性的影響 通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗SOD活性產(chǎn)生顯著性差異。由圖2可知，Pb脅迫處理下，泡桐1201葉片SOD活性與對(duì)照相比整體上變化趨勢(shì)較復(fù)雜。其中，A4處理SOD活性達(dá)到峰值，比對(duì)照顯著提高17.65%，A5比對(duì)照顯著提高2.94%；根部SOD活性總體上呈先降低后升高的趨勢(shì)，A3處理比對(duì)照顯著降低13.46%，A5比對(duì)照顯著提高17.31%。Cd脅 迫處 理下，B4處理 泡桐1201葉片SOD活性達(dá)到峰值，比對(duì)照顯著提高11.76%，B2、B5處理比對(duì)照均提高5.88%但差異不顯著；根部SOD活性總體上呈先下降后升高的趨勢(shì)，B2、B3處理比對(duì)照分別顯著降低7.69%、15.38%，B4、B5比對(duì)照分別顯著提高3.85%、15.38%。且各離子濃度脅迫處理下，泡桐1201幼苗根部SOD活性均顯著（P<0.05）高于葉片SOD活性。

圖2 Pb、Cd脅迫對(duì)幼苗SOD活性的影響

2.4.2 Pb、Cd脅迫對(duì)POD活性的影響 通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗POD活性產(chǎn)生顯著性差異。由圖3可知，Pb、Cd脅迫處理下，泡桐1201幼苗根部和葉片POD活性均呈逐漸上升的趨勢(shì)，且脅迫的金屬離子濃度與幼苗各部位POD含量呈顯著正相關(guān)。A5處理根部、葉片POD活性分別為對(duì)照的1.68、2.51倍。B5處理根部、葉片POD活性分別為對(duì)照的1.71、2.51倍。各離子同濃度脅迫處理下，泡桐1201幼苗根部POD活性均顯著（P<0.05）高于葉片POD活性。

圖3 Pb、Cd脅迫對(duì)幼苗POD活性的影響

2.4.3 Pb、Cd脅迫對(duì)CAT活性的影響 通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗CAT活性產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。由圖4可知，Pb、Cd脅迫處理下，泡桐1201根部CAT活性呈逐漸上升的趨勢(shì)，且隨著脅迫濃度的增加，根部CAT活性越來(lái)越高。其中，A5、B5處理幼苗根部CAT活性分別為對(duì)照的2.11、2.33倍；但在泡桐1201葉片中，隨著脅迫濃度的升高，葉片CAT活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，但每個(gè)處理的CAT活性均高于對(duì)照。其中，A2、B2處理葉片CAT活性均為對(duì)照的1.26倍。不同的是各離子濃度脅迫處理下，泡桐1201幼苗葉片中的CAT活性均顯著（P<0.05）高于根部。

圖4 Pb、Cd脅迫對(duì)幼苗CAT活性的影響

2.5 Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.5.1 Pb、Cd脅迫對(duì)游離脯氨酸含量的影響 通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗游離脯氨酸含量產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。由圖5可知，隨著脅迫濃度的增加，泡桐1201根部及葉片游離脯氨酸含量均呈逐漸增高的趨勢(shì)。其中，A2、A3、A4、A5處理下泡桐1201根部游離脯氨酸含量分別為對(duì)照的2.22、2.82、4.25、5.30倍，葉片游離脯氨酸含量分別為對(duì)照的1.06、1.47、1.70、1.82倍；B2、B3、B4、B5處理下泡桐1201根部游離脯氨酸含量分別為對(duì)照的2.54、3.17、5.71、6.29倍，葉片游離脯氨酸含量分別為對(duì)照的1.18、2.41、2.88、3.12倍。

圖5 Pb、Cd脅迫對(duì)游離脯氨酸含量的影響

2.5.2 Pb、Cd脅迫對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響 通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。由圖6可知，Pb脅迫下，泡桐1201幼苗體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量隨Pb、Cd脅迫濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。A3、B3處理根部及葉部中可溶性蛋白質(zhì)含量均達(dá)最高值，A3處理根部、葉部分別為對(duì)照的2.27、2.46倍，B3處理根部、葉部分別為對(duì)照的1.57、1.56倍；隨著Pb、Cd脅迫濃度的繼續(xù)增加，泡桐1201幼苗根部及葉片可溶性蛋白質(zhì)含量降低，A5處理根部、葉片可溶性蛋白質(zhì)含量分別為對(duì)照的1.37、1.35倍，B5處理根部、葉片可溶性蛋白質(zhì)含量分別比對(duì)照降低了4.65%、19.96%。各離子濃度脅迫處理下，泡桐1201幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量均低于根部。

圖6 Pb、Cd脅迫對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

2.5.3 Pb、Cd脅迫對(duì)可溶性糖含量的影響 通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗可溶性糖含量產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。由圖7可知，Pb、Cd脅迫處理下，隨著脅迫濃度的增加，泡桐1201根部和葉片可溶性糖含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)。A3、B2處理葉片可溶性糖含量分別為對(duì)照的1.23、1.11倍，根部可溶性糖含量分別為對(duì)照的1.21、1.10倍，且均隨脅迫濃度的增加，可溶性糖含量逐漸降低。各離子濃度脅迫處理下，泡桐1201幼苗根部可溶性糖含量均顯著（P<0.05）高于葉片，但相同金屬離子脅迫下泡桐1201幼苗根部與葉片的可溶性糖含量變化趨勢(shì)保持一致。

圖7 Pb、Cd脅迫對(duì)可溶性糖含量的影響

2.6 Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗體內(nèi)非蛋白巰基化合物含量的影響

2.6.1 Pb、Cd脅迫對(duì)NPT含量的影響 通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗NPT含量產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。由圖8可知，Pb、Cd脅迫下，隨著脅迫濃度的升高，泡桐1201幼苗各部位NPT含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，且葉片中NPT含量顯著（P<0.05）高于根部。A3處理根部、葉片中NPT含量分別為對(duì)照的1.20、1.53倍；B3處理根部、葉片中NPT含量分別為對(duì)照的1.13、1.57倍。

圖8 Pb、Cd脅迫對(duì)NPT含量的影響

2.6.2 Pb、Cd脅迫對(duì)GSH含量的影響 通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗GSH含量產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。由圖9可知，隨著Pb、Cd脅迫濃度的增加，泡桐1201幼苗各部位GSH含量均呈降低的趨勢(shì)，但是不同離子脅迫下根部GSH的含量均高于葉片。A5、B5處理根部GSH含量比對(duì)照分別降低27.94%、44.85%，葉片GSH含量比對(duì)照分別降低48.76%、52.07%。泡桐1201幼苗體內(nèi)的GSH含量與Pb、Cd脅迫濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），隨著脅迫濃度的增加，各部位GSH含量顯著降低。

圖9 Pb、Cd脅迫對(duì)GSH含量的影響

2.6.3 Pb、Cd脅迫對(duì)PCs含量的影響 通過(guò)方差分析可知，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗PCs含量產(chǎn)生顯著性差異（P<0.05）。由圖10可知，隨著Pb、Cd脅迫濃度的增加，泡桐1201幼苗各部位PCs含量變化趨勢(shì)不顯著，但是葉片中PCs含量均顯著高于根部（P<0.05）。不同濃度Pb脅迫下，泡桐1201幼苗體內(nèi)PCs含量變化較復(fù)雜，A3處理中，泡桐1201根部及葉片PCs含量達(dá)峰值，分別為對(duì)照的3.58、4.51倍；不同濃度Cd脅迫下，泡桐1201幼苗各部位PCs含量隨著脅迫濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，B3處理泡桐1201根部、葉片PCs含量分別為對(duì)照的3.41、4.17倍，達(dá)峰值；Pb、Cd脅迫均會(huì)促進(jìn)泡桐1201幼苗PCs含量的增加，促進(jìn)強(qiáng)度表現(xiàn)為Pb脅迫＞Cd脅迫。

圖10 Pb、Cd脅迫對(duì)PCs含量的影響

2.7 Pb2+、Cd2+在泡桐1201幼苗體內(nèi)的亞細(xì)胞分布

由圖11、圖12可知，Pb、Cd脅迫下，泡桐1201幼苗體內(nèi)Pb2+、Cd2+均主要分布在F1（細(xì)胞壁）和F3（可溶性組分）中。其中，Pb脅迫下，細(xì)胞壁和可溶性組分中Pb2+積累量分別占總量的49.62%～77.42%和12.14%～30.83%，在F2中占比較少，僅占10.45%～19.55%；Cd脅迫下，細(xì)胞壁和可溶性組分中Cd2+積累量分別占總量的50.61%～75.89%和12.74%～30.80%，在F2中Cd2+分布僅占11.37%～18.60%。隨著Pb、Cd脅迫濃度的增加，Pb2+、Cd2+積累量在F1中占比均顯著（P<0.05）增加，在F3中的占比顯著（P<0.05）降低，在F2中占比也降低，表明細(xì)胞壁為吸收Pb2+、Cd2+的主要部位。

圖11 Pb脅迫下Pb2+在泡桐1201幼苗體內(nèi)的亞細(xì)胞分布

圖12 Cd脅迫下Cd2+在泡桐1201幼苗體內(nèi)的亞細(xì)胞分布

3 小結(jié)與討論

在一定范圍內(nèi)，通過(guò)比較重金屬脅迫下植物與對(duì)照組之間生物量的大小，可以反映植物對(duì)重金屬的耐受性［16］，生物量越大則表明植物越能固定和積累空間資源［17］。本試驗(yàn)中，當(dāng)泡桐1201幼苗遭受低濃度Pb、Cd脅迫時(shí)，泡桐1201幼苗生物量略高于CK；但隨著脅迫濃度的升高，泡桐1201幼苗生物量相比CK顯著降低。這可能是因?yàn)榈蜐舛戎亟饘倜{迫激發(fā)了泡桐1201幼苗自身防御系統(tǒng)，提高了新陳代謝水平，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，所以在一定范圍內(nèi)泡桐1201幼苗的各部位生物量增加。高濃度Pb、Cd脅迫打破了泡桐1201幼苗自身防御承受能力，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理代謝功能被破壞，葉片萎縮，根系變黑，生物量顯著下降。這與劉鳳等［18］的研究結(jié)果類似，惠俊愛(ài)等［19］也證實(shí)了當(dāng)Cd離子在玉米體內(nèi)積累到一定程度時(shí)，其某些功能性細(xì)胞會(huì)被破壞。這說(shuō)明重金屬脅迫激活了植物代謝系統(tǒng)，加速植物對(duì)重金屬的吸收，吸收的重金屬又反過(guò)來(lái)抑制植物正常生長(zhǎng)代謝［20］。

從本試驗(yàn)的相關(guān)結(jié)果可以看出，泡桐1201幼苗根部為富集重金屬的主要部位，其次是葉片，最后是莖部，說(shuō)明泡桐1201幼苗根部對(duì)Pb、Cd的滯留及富集作用強(qiáng)于莖、葉，從而減少Pb、Cd對(duì)地上部位的損傷，此結(jié)果與周振等［21］的研究結(jié)果相符。泡桐1201幼苗對(duì)Cd的吸收富集及轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)于Pb，地下部分重金屬含量變化幅度大于地上部分，原因可能是與泡桐1201幼苗根系分泌物含量及由根系分泌物引起一系列變化有關(guān)。這與檀建新等［22］、閻雨平等［23］、石元值等［24］的研究結(jié)果一致。

MDA是生物體內(nèi)自由基與脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物之一，其含量與植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化和質(zhì)膜被破壞程度呈正相關(guān)，是衡量植物逆境生長(zhǎng)的重要指標(biāo)［25］。本研究結(jié)果顯示，Pb脅迫下，泡桐1201幼苗根部及葉片MDA含量均與脅迫濃度呈正相關(guān)；Cd脅迫下，幼苗根部及葉片MDA含量隨著脅迫濃度的升高先降低后升高，但降幅不明顯。表明泡桐1201幼苗抵抗Cd脅迫的能力強(qiáng)于Pb，高濃度重金屬脅迫使幼苗體內(nèi)活性氧大量累積，不能被及時(shí)清除，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化程度加重，植株受傷害程度增大，這與前人對(duì)Pb、Cd脅迫對(duì)芳樟幼苗的研究結(jié)果一致［26］。

植物體的抗氧化酶系統(tǒng)分為酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)。當(dāng)植物遭受重金屬脅迫時(shí)，二者發(fā)揮協(xié)同作用可及時(shí)有效地抵御多種理化因子脅迫、清除細(xì)胞內(nèi)活性氧、維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性［27］。SOD屬防御性酶，可清除活性氧［28，29］，POD可把SOD的歧化產(chǎn)物H2O2轉(zhuǎn)化成水，消除活性氧，產(chǎn)生細(xì)胞所需要的某些代謝物［30］，CAT與SOD、POD具有協(xié)同作用，主要清除植物通過(guò)呼吸作用和光合作用等途徑產(chǎn)生的過(guò)氧化物［31-33］。本研究結(jié)果顯示，Pb、Cd脅迫下，泡桐1201幼苗葉片SOD活性無(wú)顯著變化，隨著脅迫濃度的增加，根部SOD活性呈先降低后升高的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榕萃?201幼苗根部需要緩沖時(shí)間去適應(yīng)重金屬脅迫環(huán)境，導(dǎo)致根系SOD活性降低。隨著重金屬脅迫濃度的升高，3種酶活性均顯著增強(qiáng)并產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)而降低重金屬脅迫環(huán)境對(duì)泡桐1201根部細(xì)胞造成的傷害。Pb、Cd脅迫處理下，泡桐1201幼苗葉片CAT活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，POD活性總體呈升高的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榕萃?201幼苗葉片SOD活性可抵御低濃度重金屬脅迫，POD和CAT在泡桐1201幼苗葉片遭遇高濃度重金屬脅迫時(shí)，產(chǎn)生協(xié)同作用，聯(lián)合清除ROS等物質(zhì)。但有研究表明，隨著Cd脅迫濃度的增加，雞冠花幼苗葉片SOD活性先升后降，同期POD活性顯著升高，CAT活性也先升后降，認(rèn)為雞冠花幼苗葉片清除細(xì)胞內(nèi)活性氧時(shí)占主導(dǎo)作用的是POD［34］。這可能是由于試驗(yàn)材料、脅迫方式、處理時(shí)間等的不同，導(dǎo)致植物抗氧化酶系統(tǒng)受到不同程度的影響，后續(xù)機(jī)制可進(jìn)一步深入研究。

Pb、Cd脅迫下，泡桐1201幼苗根部和葉部脯氨酸含量均與重金屬脅迫濃度呈正相關(guān)，低濃度時(shí)，含量升高不顯著；高濃度時(shí)，含量顯著高于對(duì)照。說(shuō)明低濃度重金屬脅迫對(duì)泡桐1201幼苗傷害不明顯，高濃度脅迫會(huì)導(dǎo)致泡桐1201幼苗體內(nèi)活性氧大量累積，從而誘導(dǎo)植株體內(nèi)積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸發(fā)揮作用，聯(lián)合其他抗氧化酶清除過(guò)量ROS，維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓和含水量及質(zhì)膜的完整性，增強(qiáng)植株的抗逆能力。

植物遭受逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及游離脯氨酸，可以清除活性氧自由基、維持細(xì)胞膜穩(wěn)定、儲(chǔ)存能量等，以滿足植株正常生長(zhǎng)代謝，同時(shí)可間接反映細(xì)胞損傷程度［35-37］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Pb脅迫下，隨著脅迫濃度的升高，泡桐1201幼苗體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)及可溶性糖含量呈先上升后降低的趨勢(shì)，但含量均高于對(duì)照。這說(shuō)明面對(duì)低濃度的重金屬脅迫，泡桐1201幼苗可通過(guò)調(diào)節(jié)自身可溶性蛋白質(zhì)及可溶性糖含量來(lái)調(diào)節(jié)滲透勢(shì)，抵御脅迫造成的傷害，但當(dāng)脅迫濃度超出了泡桐1201幼苗自身承受能力時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)將被破壞，可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)含量就會(huì)降低，這與張方靜等［38］對(duì)月季的研究結(jié)果一致。同時(shí)，由于外界環(huán)境壓力加強(qiáng)，泡桐1201幼苗需要利用更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致體內(nèi)可溶性糖含量降低。

植物在抵御重金屬脅迫時(shí)，其體內(nèi)產(chǎn)生的巰基化合物會(huì)緩解植物受毒害程度［39］。富集在植物細(xì)胞中的金屬及重金屬會(huì)誘導(dǎo)NPT的合成，并促使其螯合金屬離子來(lái)降低重金屬對(duì)植物的毒害作用［40］。金屬離子的高度活性使其極易親和-SH基團(tuán)，細(xì)胞通過(guò)合成植物螯合素PCs，從而降低細(xì)胞質(zhì)中游離金屬離子濃度來(lái)保護(hù)基本生物分子的-SH基團(tuán)［41，42］。本研究結(jié)果表明，Pb、Cd脅迫下，泡桐1201幼苗葉片NPT和PCs含量明顯高于根部，說(shuō)明重金屬促進(jìn)泡桐1201幼苗地上部分非蛋白巰基化合物的合成，以修復(fù)和保護(hù)蛋白質(zhì)的-SH基團(tuán)免受金屬毒性而不被氧化，且NPT和PCs含量變化趨勢(shì)均呈先升高后降低的趨勢(shì)，表明低濃度Pb、Cd脅迫會(huì)誘導(dǎo)NPT和PCs的產(chǎn)生從而緩解植物所受重金屬毒害作用；隨著脅迫濃度的升高，二者含量逐漸降低，這可能是由于高濃度脅迫加劇了植物細(xì)胞過(guò)氧化損傷，植物體內(nèi)ROS產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)失衡，從而誘導(dǎo)合成NPT和PCs的能力下降。這與Mahdavian等［43］的研究結(jié)果一致。

GSH是一種重要的非酶抗氧化劑，能幫助細(xì)胞抵抗氧化反應(yīng)，清除潛在的有毒ROS［44］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Pb、Cd脅迫下，泡桐1201幼苗中GSH降低的同時(shí)PCs顯著增加，植物通過(guò)消耗較多的GSH合成PCs用于抵抗重金屬脅迫；Cd脅迫下GSH含量降幅大于Pb脅迫，表明GSH在面對(duì)重金屬脅迫時(shí)起重要作用。但當(dāng)脅迫濃度較高時(shí)，GSH含量的急劇降低從而對(duì)其他細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生有害影響，最終表現(xiàn)為抑制生長(zhǎng)，因此，泡桐1201幼苗體內(nèi)對(duì)Pb、Cd具有更高耐受性可歸因于PCs對(duì)金屬元素的螯合能力增強(qiáng)。

泡桐1201幼苗在Pb、Cd脅迫后，Cd2+、Pb2+主要貯存在細(xì)胞壁中，其次是可溶性組分中，細(xì)胞器中積累量最低。這可能是因?yàn)榕萃?201幼苗細(xì)胞壁中多糖、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素等物質(zhì)對(duì)重金屬離子的吸附固持，減少了金屬離子的跨質(zhì)膜運(yùn)輸，降低原生質(zhì)體中的金屬離子濃度，提高植株抗逆能力［45］。當(dāng)細(xì)胞壁對(duì)Pb2+、Cd2+吸收達(dá)飽和狀態(tài)時(shí)，Pb2+、Cd2+將進(jìn)入可溶性組分?？扇苄越M分中檸檬酸、植物絡(luò)合素、金屬硫蛋白、硝酸和蘋(píng)果酸等物質(zhì)與游離Pb2+、Cd2+相結(jié)合，形成一種活性很弱的螯合態(tài)，從而避免造成細(xì)胞器損傷，甚至功能性喪失，此為液胞區(qū)室化效應(yīng)［46］。因此，泡桐1201幼苗的耐性機(jī)理可能是植物通過(guò)細(xì)胞壁固持和細(xì)胞中液泡區(qū)室化實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb、Cd的固定、絡(luò)合、再分配，達(dá)到緩解Pb、Cd脅迫對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒害，從而增強(qiáng)泡桐1201幼苗對(duì)重金屬Pb、Cd的耐性和富集能力。這與水稻［47］、龍葵［48］的耐性機(jī)理相似。

綜合本試驗(yàn)以上分析可得，Pb、Cd脅迫對(duì)泡桐1201幼苗生物量的影響表現(xiàn)為低促高抑。泡桐1201幼苗對(duì)Cd的吸收及富集作用強(qiáng)于Pb，幼苗各部位重金屬含量均表現(xiàn)為根＞葉＞莖，各部位生物富集系數(shù)及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均呈下降趨勢(shì)，泡桐1201幼苗根部起到了緩沖及保護(hù)屏障的作用，成為吸收富集Pb、Cd的主要部位。Pb、Cd脅迫下，隨著脅迫濃度的升高，泡桐1201幼苗根部SOD活性先降低后升高，葉片SOD活性變化并不顯著；葉片CAT活性隨脅迫濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，根部POD活性和CAT活性與脅迫的濃度均呈正相關(guān)?？扇苄蕴呛侩S脅迫濃度的增強(qiáng)均呈先升高后降低的趨勢(shì)，可溶性蛋白質(zhì)含量也呈先升高后降低的趨勢(shì)，游離脯氨酸含量與脅迫濃度呈正相關(guān)。NPT含量隨著脅迫濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢(shì)，GSH含量呈降低趨勢(shì)，PCs含量變化較復(fù)雜，但總體上呈先升高后降低的趨勢(shì)，且葉片非蛋白巰基含量顯著高于根部。亞細(xì)胞各組分中分布的Cd2+、Pb2+積累量與脅迫濃度呈正相關(guān)。結(jié)合以上結(jié)果分析可以看出，泡桐1201幼苗對(duì)低濃度Pb、Cd脅迫有較好的耐受性，從植株和細(xì)胞2個(gè)層次上探究泡桐1201幼苗對(duì)Pb、Cd的吸收規(guī)律及耐性機(jī)理，可以為泡桐在重金屬污染修復(fù)方面的應(yīng)用提供一定的理論研究和現(xiàn)實(shí)依據(jù)。