張亞妮，劉曼莉，張志剛，萬中義，吳兆圓，王開梅，方 偉

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

青霉屬（Penicillium）真菌是廣泛存在于自然環(huán)境中的一類腐生類真菌。其與大部分腐生類真菌一樣可以產(chǎn)生萜類、聚酮類、生物堿類、大環(huán)內(nèi)酯類和醌類等次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在抗菌、抗病毒、抗腫瘤或抗心血管疾病以及抗蟲等方面表現(xiàn)出不同的活性［1-3］。其中，一些代謝產(chǎn)物已經(jīng)被開發(fā)成藥物，例如目前具有廣譜抗菌活性的青霉素，已經(jīng)用于臨床醫(yī)學(xué)的洛伐他汀和抗真菌的灰黃霉素［4］。近年來，又發(fā)現(xiàn)不少青霉屬真菌來源的結(jié)構(gòu)新穎且活性良好的代謝產(chǎn)物，如新骨架二倍半萜類化合物peniroquesine A至peniroquesine C，它們是從1株婁地青霉Penicillium roquefortiYJ-14中分離所得，peniroquesine B和peniroquesine C對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制活性，尤其是對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的體外細(xì)胞毒性較強(qiáng)，IC50分別為16.40、14.11 μmol/L，顯著高于 陽性對(duì)照cisplatin（IC50為33.55 μmol/L）［5］。新的聚酮類化合物isochaetochromin A1與已知化合物isochaetochromin B1及isochaetochromin B2源自同一株青霉屬真菌FKI-4942，均具有抑制甘油三酯合成的作用，其中isochaetochromin B1的抑制作用最強(qiáng)，IC50為5.6 μmol/L［6，7］。新的硫代二酮哌嗪生物堿penicibrocazine A至penicibrocazine E，這5個(gè)生物堿分離自紅樹植物白骨壤的內(nèi)生真菌青霉菌Penicillium brocaeMA-231發(fā)酵液中?；衔飌enicibrocazine B至penicibrocazine D均對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有較強(qiáng)的抑制活性，其最低抑菌濃度（MIC）分別為32.00、0.25、8.00 μg/mL；化合物penicibrocazine C對(duì)藤黃微球菌（Micrococcus luteus）表現(xiàn)出明顯高于陽性對(duì)照氯霉素（MIC2.0 μg/mL）的抑制活性，其MIC為0.25 μg/mL。此外，化合物penicibrocazine A至penicibrocazine C對(duì)植物病原真菌小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis）表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，其MIC分別為0.25、8.00、0.25 μg/mL［8］。不斷發(fā)現(xiàn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物擴(kuò)展了青霉屬真菌化合物結(jié)構(gòu)及生物活性的多樣性，為新的藥物開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。

湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心擁有豐富的微生物資源，在從真菌來源中篩選具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物過程中，發(fā)現(xiàn)1株具有抑菌活性的菌株，經(jīng)ITS rRNA鑒定為青霉屬Penicilliumsp.KC345662，編號(hào)為NH-1502。對(duì)其發(fā)酵提取物進(jìn)行HPLC-MS初步分析，發(fā)現(xiàn)其含有豐富多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物。為了明確這些次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)菌株P(guān)enicilliumsp.1502進(jìn)行了大量發(fā)酵、提取、分離純化，獲得了化合物1至化合物6，并在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)其進(jìn)行了抑菌、抗植物病原真菌及殺蟲等活性評(píng)價(jià)，以期為青霉屬來源的次級(jí)代謝產(chǎn)物在農(nóng)用方面的研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 真菌NH-1502，分離自武漢市周邊的土樣中，現(xiàn)保存于湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心。菌株經(jīng)ITS分析比對(duì)，其序列與Penicilliumsp.KC345662高度相似（相似度為100%），鑒定為青霉屬真菌Penicilliumsp.1502，保存編號(hào)為NH-1502。

1.1.2 抗細(xì)菌生測(cè)指示菌 大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureusATCC 25923）購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，豬丹毒桿菌（Erysipelothrix rhusiopathiaeWH13013）、豬鏈球菌（Streptococcus suisSC19）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)譚臣教授課題組提供（在無菌條件下將菌液與30%濃度甘油1∶1等體積混合于離心管中，甘油終濃度為15%，-20℃超低溫冰箱中保存）。

1.1.3 抗真菌生測(cè)指示菌 番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、小麥穎枯病菌（Septoria nodorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.Hiveum）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliaeKleb）均分離于染病植物的果實(shí)或葉片（所測(cè)試病原真菌保存在-80℃超低溫冰箱25%甘油管中，使用前將甘油管活化于PDA平板備用）。

1.1.4 供試?yán)ハx 豆蚜（Aphis craccivora）由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心通過野外蚜蟲馴化培養(yǎng)所得。

1.1.5 儀器和主要試劑Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)，δ為mg/L，J為Hz）（德國(guó)Bruker BioSpin公司）；BUCHI ROTAVAPOR R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦）；Waters 2695型高效液相色譜儀（Waters2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站MasslynxV4.0）、Waters高效制備液相色譜儀（Waters2525泵，帶2767自動(dòng)收集系統(tǒng)，Waters2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站MasslynxV4.0）、Waters Xevo TQD UPLC-MS超高效液質(zhì)聯(lián)用（美國(guó)Waters）；提取分離用試劑甲醇、乙酸乙酯和乙腈均為國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)；去離子水（德國(guó)默克）；春雷·王銅（春雷霉素含量2%，王銅含量45%），購自陜西麥可歲生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株發(fā)酵和提取 菌株NH-1502在種子培養(yǎng)基（PDA）中于28℃，以轉(zhuǎn)速120 r/min進(jìn)行振搖培養(yǎng)。發(fā)酵96 h后，在無菌條件下將種子發(fā)酵液（10%）轉(zhuǎn)移至含有發(fā)酵培養(yǎng)基（PDA）的500 mL錐形瓶中（每瓶200 mL）發(fā)酵，在28℃的溫度下，置于搖床上以120 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)120 h。初篩時(shí)發(fā)酵液50 mL，冷凍干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，離心，取上層有機(jī)相，回收乙酸乙酯后加入1 mL甲醇溶解，作為活性跟蹤半制備樣品。向大量發(fā)酵的5 L發(fā)酵液中加入5 L乙酸乙酯，攪拌提取3次，合并提取液過濾后真空濃縮得到提取物1.2 g。

1.2.2 代謝產(chǎn)物的分離純化 大量發(fā)酵的乙酸乙酯提取物用少量甲醇溶解，經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行柱層析，用石油醚/乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，洗脫組分通過HPLC檢測(cè)合并為12段（Fr.1至Fr.12）。根據(jù)HPLC檢測(cè)分析結(jié)果，應(yīng)用制備液相色譜對(duì)組分Fr.4至Fr.8進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，色譜柱為Waters Sunfire prep C18OBD柱（19 mm×250 mm，5 μm），流速為24 mL/min，洗脫梯度33 min（梯度為20%～100%乙腈），由Fr.4分離到化合物1（5.65 mg）和化合物2（12.88 mg），由Fr.5獲得化合物3（10.54 mg），由Fr.6獲得化合物4（8.22 mg），由Fr.7獲得化合物5（20.67 mg），由Fr.8獲得化合物6（2.27 mg），其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物結(jié)構(gòu)

1.2.3 生物活性測(cè)定 藥物最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI 2012）推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行。將純化的細(xì)菌劃線接種于LB或TSA固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于LB或TSB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h。將菌液按1∶1 000的比例接種于LB或TSB液體培養(yǎng)基，于37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為0.5（菌量約為1×108CFU/mL），再將菌懸液1∶100稀釋后備用。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入50 μL倍比稀釋不同濃度的藥物，加入50 μL稀釋的菌液，每種藥物每株菌3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。對(duì)照藥物選擇青霉素、鏈霉素置于37℃溫箱中孵育16～20 h，讀取結(jié)果。肉眼觀察微量稀釋孔中以無細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象的最高藥物稀釋濃度為該藥物對(duì)該種細(xì)菌的藥物最小抑菌濃度。平行操作3次，以3次結(jié)果的平均值作為此藥對(duì)該細(xì)菌的MIC。

抗真菌活性測(cè)試采用96孔盤法［9］，將化合物1至化合物6配制成100 μg/mL的溶液。同時(shí)提前準(zhǔn)備好指示菌及瓊脂培養(yǎng)基的混合物（指示菌的濃度約為1×107CFU/mL），在無菌96孔板中，每孔加入待測(cè)樣品10 μL，加入培養(yǎng)基與指示菌的混合物90 μL，混合均勻，每樣品重復(fù)3孔，培養(yǎng)4 d后檢查結(jié)果?；钚苑旨?jí)評(píng)價(jià)指標(biāo)：采用目測(cè)分級(jí)法進(jìn)行，按3、5、7、9分級(jí)記錄菌絲生長(zhǎng)的密度。各級(jí)數(shù)具體指標(biāo)以標(biāo)準(zhǔn)樣品藥效為基準(zhǔn)確定。3表示對(duì)病原真菌菌絲無抑制作用，與加入溶劑空白對(duì)照組的病原真菌菌絲生長(zhǎng)一致；5表示靶標(biāo)菌絲部分生長(zhǎng)；7表示靶標(biāo)菌絲少量生長(zhǎng)；9表示抑菌率為100%，指示病原真菌無菌絲生長(zhǎng)。陽性對(duì)照為春雷·王銅稀釋500倍溶液。

化合物1至化合物6對(duì)蚜蟲的殺蟲活性采用浸葉法［10］。每種化合物用0.1%吐溫-80乙醇溶液制備成5種濃度梯度（1 000、500、250、125、62.5 μg/mL）。在實(shí)驗(yàn)室條件下，將帶蚜蟲大豆幼苗浸入不同濃度的供試樣品溶液5 s，吸取多余的溶液，然后置于室溫培養(yǎng)。每種處理重復(fù)3次，72 h后，與陰性對(duì)照和85%阿維菌素陽性對(duì)照比較，觀察死亡率。然后計(jì)算致死濃度50%（LC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色粉末，分子式為C18H18O8，相對(duì)分子質(zhì)量為362.1；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：6.75（1H，d，J=2.8 Hz，H-4＇），6.74（1H，d，J=2.8 Hz，H-2＇），6.31（1H，br s，H-3），5.62（1H，br s，H-5），3.76（3H，s，H-8），3.69（3H，s，H-9＇），3.61（3H，s，H-8＇），2.06（3H，s，H-9＇）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：167.0（s，C-7），165.3（s，C-3＇），157.0（s，C-6），156.4（s，C-2），155.1（s，C-6＇），153.4（s，C-5＇），140.2（s，C-4），133.7（s，C-3＇），125.6（s，C-1＇），109.5（d，C-3），107.5（d，C-2＇），107.2（s，C-1），104.8（d，C-4＇），104.3（d，C-5），56.0（q，C-9＇），52.0（q，C-8＇），51.9（q，C-8），21.4（q，C-9）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的methyl asterric acid的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為methyl asterric acid。

化合物2：淡黃色粉末，分子式為C18H16Cl2O8，相對(duì)分子質(zhì)量為430.0；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：6.76（1H，d，J=2.8 Hz，H-2＇），6.66（1H，d，J=2.8 Hz，H-4＇），3.64（3H，s，H-8），3.60（3H，s，H-9＇），3.27（3H，s，H-8），2.45（3H，s，H-9）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：164.5（s，C-7＇），163.8（s，C-7），154.7（s，C-6＇），152.9（s，C-5＇），149.2（s，C-2），149.0（s，C-6），135.7（s，C-4），135.1（s，C-3＇），124.4（s，C-1＇），115.6（d，C-3），115.5（d，C-5），112.5（s，C-1），107.4（d，C-2＇），104.7（d，C-4＇），56.1（q，C-9＇），52.0（q，C-8），51.9（q，C-8＇），18.2（q，C-9）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的methyl 3，5-dichloroasterric acid的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為methyl 3，5-dichloroasterric acid。

化合物3：淡黃色針狀結(jié)晶，分子式為C17H16O7，ESI-MS（m/z）陰離子：331.1［M-H］-，相對(duì)分子質(zhì)量為332.1；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：11.43（2H，br s，2＇，6＇-OH），9.98（1H，br s，4-OH），6.90（1H，d，J=2.1 Hz，3-H），6.67（1H，d，J=2.2 Hz，5-H），6.08（2H，br s，3＇5＇-H），3.64（3H，s，7-OCH3），3.63（3H，s，9-OCH3），2.15（3H，s，7’-CH3）；13C NMR（DMSOd6，125 MHz）δ：199.6（s，C-10），165.6（s，C-8），161.6（s，C-2＇），161.6（s，C-6＇），158.1（s，C-4），156.8（s，C-6），147.2（s，C-4＇），127.9（s，C-2），126.2（s，C-1），109.1（s，C-1＇），107.6（d，C-5＇），107.2（d，C-3＇），107.2（d，C-3），103.4（d，C-5），56.0（q，C-7），52.1（q，C-9），21.6（q，C-7＇）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11，12］報(bào)道的sulochrin的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為sulochrin。

化合物4：淡黃色針狀結(jié)晶，分子式為C17H16ClO7，ESI-MS（m/z）：365.4/367.4［M-H］-，相對(duì)分子質(zhì)量為366.4；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：13.37（1H，s，OH-6＇），10.45（1H，s，OH-2＇），10.07（1H，s，OH-4），6.91（1H，d，J=2.1 Hz，H-3＇），6.69（1H，d，J=2.0 Hz，H-5），6.20（1H，s，H-5＇），3.65（3H，s，H-7），3.65（3H，s，H-9），2.24（3H，s，H-7＇）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：200.0（s，C-10），165.6（s，C-8），158.5（s，C-2＇），158.4（s，C-6＇），158.2（s，C-4），156.8（s，C-6），144.6（s，C-4＇），128.0（s，C-2），125.5（s，C-1），110.4（s，C-3＇），110.0（s，C-1＇），108.5（d，C-5＇），107.3（d，C-3＇），103.5（d，C-5），56.0（q，C-7），52.2（q，C-9），20.6（q，C-7＇）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道的monochlorsulochrin的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為monochlorsulochrin。

化合物5：黃色固體，分子式為C17H14Cl2O6，ESIMS（m/z）：399.0（［M-H］-），分子量為400.0；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：11.75（1H，br s，OH-2），11.75（1H，br s，OH-6），10.14（1H，s，OH-11），6.93（1H，d，J=2.1 Hz，H-10），6.72（1H，d，J=2.0 Hz，H-12），3.67（3H，s，H-17），3.66（3H，s，H-16），2.24（3H，s，H-14）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：200.3（s，C-7），165.7（s，C-15），158.7（s，C-11），156.8（s，C-13），155.2（s，C-6），141.8（s，C-4），128.0（s，C-9），125.4（s，C-8），112.3（s，C-3），112.3（s，C-5），107.5（d，C-10），103.6（d，C-12），56.1（q，C-17），52.3（q，C-16），18.9（q，C-14）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報(bào)道的dihydrogendin的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為dihydrogendin。

化合物6：橙紅色無定型固體，分子式為C18H16O6，ESI-MS（m/z）：329.1［M+H］+，相對(duì)分子質(zhì)量 為328.1；1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：13.23（1H，s，OH-1），7.49（1H，d，J=1.1 Hz，H-4），7.22（1H，d，J=1.7 Hz，H-5），7.15（1H，d，J=1.1 Hz，H-2），6.86（1H，d，J=1.7 Hz，H-7），4.69（1H，d，J=3.6 Hz，OH-2＇），3.91（3H，s，8-OCH3），2.74（1H，dd，J=9.5，3.6 Hz，H-1＇），2.69（1H，dd，J=9.5，5.3 Hz，H-1＇），1.09（3H，d，J=4.4 H-3＇）；13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：186.4（s，C-9），182.5（s，C-10），164.5（s，C-6），163.5（s，C-8），161.5（s，C-1），148.6（s，C-6），136.9（s，C-10a），131.8（s，C-4a），124.9（d，C-2），119.7（d，C-4），114.7（s，C-9a），112.7（s，C-8a），107.0（d，C-5），105.0（d，C-7），66.6（q，C-2＇），56.4（q，8-OCH3），45.0（t，C-16），23.5（q，C-3＇）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道的penipurdin A的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為penipurdin A。

2.2 抗菌活性

采用微量肉湯稀釋法測(cè)試化合物1至化合物6對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌、豬丹毒的活性。結(jié)果（表1）表明，化合物1和化合物6對(duì)這4種細(xì)菌無抑制活性；化合物2僅對(duì)金黃色葡萄球菌有微弱的抑制活性，其MIC為200 μg/mL；化合物3、化合物4對(duì)豬鏈球菌的MIC均為200 μg/mL；化合物5對(duì)金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌均具有微弱的抑制活性，MIC均為200 μg/mL。

表1 化合物的抑菌活性結(jié)果 （單位：μg/mL）

2.3 抗真菌及殺蟲活性

96孔盤法抗真菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1至化合物6在濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)所測(cè)試的6種植物病原真菌并無明顯抑制活性。浸葉法殺蚜蟲活性測(cè)試結(jié)果表明，化合物1至化合物6在96 h內(nèi)均無殺蚜蟲活性。

3 討論

本研究從青霉菌屬真菌Penicilliumsp.1502的發(fā)酵提取物中分離到methyl asterric acid（1）、methyl 3，5-dichloroasterric acid（2）、sulochrin（3）、monochlorsulochrin（4）、dihydrogendin（5）和penipurdin A（6）共6個(gè)化合物?；衔?、化合物2是擁有二苯醚結(jié)構(gòu)asterric acid的衍生物，Lee等［11］研究表明在濃度為3～10 μg/mL時(shí)，這些化合物均能顯著抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的毛細(xì)血管形成，asterric acid衍生物可作為抗血管生成藥物用于進(jìn)一步研究?；衔?、化合物4、化合物5是二苯酮類化合物，來源于曲霉屬或者青霉屬的發(fā)酵液中，表現(xiàn)出廣泛的生物活性，如微弱的抗真菌、抗細(xì)菌和細(xì)胞毒活性［12，16］。此外，Ohashi等［17］研究發(fā)現(xiàn)化合物3和化合物4對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒具有較強(qiáng)的抑制活性，其IC50分別為0.1、0.3 μmol/L；尤其是化合物3有望成為抗過敏藥物的良好先導(dǎo)化合物。化合物5在cyclophilin A異構(gòu)酶上的對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬試驗(yàn)顯示了其作為抗病毒和免疫抑制劑的重要潛在活性［14］。化合物6屬于蒽醌類化合物，與penipurdin B同時(shí)分離自土壤源的紫青霉菌Penicillium purpurogenumSC0070、penipurdin B對(duì)A549、HepG2和Hela 3種癌細(xì)胞系展現(xiàn)出一定的活性，然而化合物6（penipurdin A）對(duì)這3種細(xì)胞系并無細(xì)胞毒活性［15］。

在篩選菌時(shí)，菌株NH-1502顯示了較好的抗菌活性，但是活性測(cè)試結(jié)果表明僅化合物3、化合物4和化合物5對(duì)豬鏈球菌有微弱的抑菌活性；這有可能是活性化合物未被分離得到，亦可能存在協(xié)同增效作用。分析結(jié)構(gòu)特征可以發(fā)現(xiàn)，化合物1至化合物5都擁有二苯基，化合物1和化合物2是二苯基直接連在一個(gè)氧原子上，屬于二苯醚類；化合物3、化合物4、化合物5是二苯基連接在1個(gè)酮羰基上，這些結(jié)構(gòu)上的差異可能導(dǎo)致了化合物的活性差異?；衔?至化合物6對(duì)被測(cè)試的6種病原真菌均無抑制活性；此外其對(duì)所測(cè)試的豆蚜也無毒殺活性。后期將繼續(xù)對(duì)青霉屬真菌Penicilliumsp.1502產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物活性進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期為青霉屬來源的次級(jí)代謝產(chǎn)物在農(nóng)用方面的研究提供依據(jù)。