李國超，盧慧娟，姬生國（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006）

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的干燥果穗，以其夏季果穗呈棕紅色時(shí)采收，除去雜質(zhì)，曬干入藥，該藥材性寒、味辛、苦，歸肝、膽經(jīng)，具有清肝明目、消腫散結(jié)的功效[1]，臨床常用于治療甲狀腺腫大、淋巴結(jié)核、乳腺增生、肺結(jié)核、急性黃疸型傳染性肝炎、高血壓等癥[2-3]。夏枯草現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典》（一部），以迷迭香酸為指標(biāo)成分[1]?，F(xiàn)代研究表明，夏枯草主要含有黃酮類、酚酸類、三萜類、甾體類等化合物，具有降血壓、降血糖、抗菌、抗病毒、抗炎和抗腫瘤等活性[3-4]。其中黃酮類化合物為夏枯草的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及保護(hù)心血管等藥理作用[5]，與夏枯草藥理作用有較大關(guān)聯(lián)性。目前夏枯草的質(zhì)量研究主要為傳統(tǒng)生藥學(xué)鑒別[6]、指紋圖譜[7]等，但傳統(tǒng)生藥學(xué)鑒別的主觀影響較大，干擾因素較多；指紋圖譜只能從化學(xué)成分方面進(jìn)行考察，無法全面、綜合地評價(jià)夏枯草質(zhì)量。基于此，本研究以10個(gè)產(chǎn)地的117批夏枯草飲片為研究對象，以迷迭香酸、水分、水溶性浸出物及總黃酮含量為評價(jià)指標(biāo)，采用熵權(quán)法計(jì)算權(quán)重，同時(shí)結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析法計(jì)算關(guān)聯(lián)度，旨在為全面、客觀評價(jià)夏枯草的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1120型高效液相色譜儀、BIY211b型電子天平、AY120型十萬分之一天平（日本Shimadzu公司），LK-400型手提式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠），KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），UV-1800 型紫外分光光度計(jì)（北京北分瑞利分析儀器公司），SHB-Ⅲ型循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

迷迭香酸對照品（批號14020115，純度≥98%）、蘆丁對照品（批號12040302，純度≥98%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

117批夏枯草飲片于2019年6月購自江蘇南京、安徽亳州、河南新鄉(xiāng)等10個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院姬生國教授鑒定為唇形科植物夏枯草P. vulgarisL.的干燥果穗。樣品經(jīng)干燥后粉碎，過24 目篩，保存于自封袋中，置于干燥器中備用。夏枯草飲片的信息來源見表1。

表1 夏枯草飲片的信息來源

2 方法與結(jié)果

2.1 迷迭香酸的含量測定

2.1.1 色譜條件 以O(shè)DS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-0.1%三氟乙酸溶液（42∶58，V/V）為流動相；流速為0.6 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為330 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取迷迭香酸對照品5.09 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成迷迭香酸質(zhì)量濃度為0.509 0 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，超聲（功率90 W，頻率59 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對照品溶液、供試品溶液及空白溶液（稀乙醇），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖1，空白圖略）。結(jié)果顯示，迷迭香酸峰形穩(wěn)定，與供試品中的其他色譜峰達(dá)到基線分離，理論板數(shù)為17 718。

圖1 供試品溶液、迷迭香酸對照品溶液的HPLC圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液1.0、1.0、1.0、2.0、1.0、1.0、1.0 mL，分別置于2、5、10、25、25、50、100 mL容量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻，得系列線性溶液。取上述系列線性溶液及對照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，迷迭香酸的回歸方程為Y=2×107X-65 910（r=0.999 9），表明迷迭香酸的檢測質(zhì)量濃度在0.005 09～0.509 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)：取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，迷迭香酸峰面積的RSD為0.27%（n=6），表明儀器精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號S93），于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h時(shí)，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，迷迭香酸峰面積的RSD為2.6%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。（3）重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號S93）0.25 g，共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算迷迭香酸的含量。結(jié)果顯示，迷迭香酸含量的RSD為0.80%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。（4）加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品（編號S93，迷迭香酸含量為0.504 6%）0.1 g，共6份，分別精密加入對照品0.5 mg，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，迷迭香酸的平均加樣回收率為100.14%（RSD=0.48%，n=6），表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.1.7 樣品中迷迭香酸含量測定 取117批樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。每批樣品平行測定2次。結(jié)果見表2。

表2 迷迭香酸、總黃酮、水分和水溶性浸出物含量的測定結(jié)果（n＝2，%%）

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定蘆丁對照品4.970 0 mg，用50%乙醇溶解并定容，制得蘆丁質(zhì)量濃度為0.198 8 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定樣品粉末0.5 g，精密加入50%乙醇15 mL，超聲（功率300 W，40 KHz）提取75 min，濾過，即得。

2.2.3 檢測波長的選擇 精密移取上述對照品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1% AlCl3溶液3 mL、醋酸鈉-冰醋酸緩沖液1 mL，然后用50%乙醇定容，搖勻，于40 ℃恒溫水浴加熱10 min；取上述供試品溶液同法操作。以50% 乙醇為空白對照，在250～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，對照品和供試品溶液均在285 nm波長處有最大吸收，故選擇檢測波長為285 nm（圖略）。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取上述對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，于285 nm波長處測定吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、吸光度為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，蘆丁的回歸方程為Y=17.051 0X+0.041 4（r=0.999 8），表明蘆丁的檢測質(zhì)量濃度在0.009 9～0.079 5 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)：取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號S104），按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，于285 nm波長處連續(xù)測定6次吸光度。結(jié)果顯示，吸光度的RSD為0.05%（n=6），表明方法精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號S104），按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，在室溫下靜置0、30、60、90、120、180 min時(shí)，于285 nm波長處測定吸光度。結(jié)果顯示，吸光度的RSD為1.90%（n=6），表明樣品在室溫下放置180 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。（3）重復(fù)性試驗(yàn)：取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號S104），按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，于285 nm波長處測定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，總黃酮含量的RSD為2.38%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。（4）加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的樣品（編號S104，總黃酮含量為4.133 1%），共6份，每份1 g，精密稱定，加入蘆丁對照品4.1 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，于285 nm波長處測定吸光度并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，蘆丁的平均加樣回收率為99.49%（RSD=1.03%，n=6），表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.6 樣品中總黃酮含量測定 取117批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法顯色后，于285 nm波長處測定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。每批樣品平行測定2次。結(jié)果見表2。

2.3 水分含量測定

按2020年版《中國藥典》（四部）通則“0832水分測定法”項(xiàng)下第二法“烘干法”測定水分含量[8]。每批樣品平行測定2次。結(jié)果見表2。

2.4 水溶性浸出物含量測定

按2020年版《中國藥典》（四部）通則“2201浸出物測定法”項(xiàng)下水溶性浸出物測定法中的“熱浸法”測定水溶性浸出物含量[8]。每批樣品平行測定2次。結(jié)果見表2。

2.5 熵權(quán)法計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重

設(shè)有m個(gè)樣品，每個(gè)樣品有n項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)，由此組成單元序列{Xij}（i=1、2、3……m；j=1、2、3……n；本研究中n=4，m=117）。由于各指標(biāo)間量綱不統(tǒng)一，需對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。如果評價(jià)指標(biāo)為正向指標(biāo)，則采用公式（1）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；如果指標(biāo)為負(fù)向指標(biāo)，則采用公式（2）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。Yij為標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)，Xij為第i個(gè)樣品的第j個(gè)指標(biāo)值。

根據(jù)信息論中信息熵的定義，按公式（3）、（4）計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的信息熵（E），Ej為樣品第j個(gè)指標(biāo)的信息熵，若Pij=0，則定義lnPij=0；再按公式（5）計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重（W）j[9-10]。結(jié)果見表3。

表3 各指標(biāo)的信息熵及權(quán)重結(jié)果

2.6 灰色關(guān)聯(lián)度分析法計(jì)算各指標(biāo)的相對關(guān)聯(lián)度

2.6.1 無量綱化處理 在灰色關(guān)聯(lián)度分析中，首先確定評價(jià)單元序列：設(shè)有m個(gè)樣品，每個(gè)樣品有n項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)，由此組成單元序列{Xik}（i=1、2、3……m；k=1、2、3……n）。多指標(biāo)評價(jià)中因各指標(biāo)單位、量級不同，無法進(jìn)行直接評價(jià)，故需對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理，計(jì)算公式為Yik=Xik/Xk，Yik為處理后的數(shù)據(jù)，{Xik}為原始數(shù)據(jù)，{Xk}為樣品第k個(gè)指標(biāo)的平均值[10]。

2.6.2 相對關(guān)聯(lián)度的計(jì)算 迷迭香酸、總黃酮、水溶性浸出物含量為正向指標(biāo)，關(guān)聯(lián)系數(shù)按公式（6）計(jì)算（n=3，m=117，ρ為“2.5”中熵權(quán)法計(jì)算所得的權(quán)重）；水分含量為負(fù)向指標(biāo)，關(guān)聯(lián)系數(shù)按公式（7）計(jì)算（n=1，m=117，ρ為“2.5”中熵權(quán)法計(jì)算所得的權(quán)重）；再按公式（8）計(jì)算相對關(guān)聯(lián)度（r）i[11]。結(jié)果見表4。

表4 117批夏枯草的相對關(guān)聯(lián)度及排序結(jié)果

續(xù)表4

3 討論

2020年版《中國藥典》僅以迷迭香酸為夏枯草質(zhì)量控制的唯一活性指標(biāo)[1]。但由于中藥成分復(fù)雜，其藥效的發(fā)揮往往是多個(gè)成分協(xié)同作用的結(jié)果，因此采用多指標(biāo)評價(jià)的方法能更加全面表征藥材的質(zhì)量[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草中所含有的總黃酮具有抗腫瘤、抑菌、降血脂等活性[5]，與夏枯草的藥理作用關(guān)聯(lián)度大，此外藥材中的水分與水溶性浸出物含量可從藥材儲藏期、霉變、蟲蛀等方面影響藥材的質(zhì)量[13-14]，因此本研究選擇迷迭香酸、總黃酮、水分及水溶性浸出物作為夏枯草的指標(biāo)成分。含量測定結(jié)果顯示，從迷迭香酸、總黃酮和水溶性浸出物含量來看，以江蘇南京（S16～S25）、安徽亳州（S63～S88）等產(chǎn)地藥材的含量較高（質(zhì)量較優(yōu)）；從水分含量來看，以湖北隨州（S89～S97）、河南南陽（S54～S62）等產(chǎn)地藥材的含量較低（質(zhì)量較優(yōu)）。不同指標(biāo)的含量測定結(jié)果存在差異，因此多指標(biāo)綜合評價(jià)夏枯草質(zhì)量更加科學(xué)。

本研究通過熵權(quán)法對迷迭香酸等4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行客觀賦權(quán)，再根據(jù)各指標(biāo)的權(quán)重計(jì)算相對關(guān)聯(lián)度，有效避免了因主觀判斷誤差對權(quán)重分配的影響。熵權(quán)法分析結(jié)果顯示，迷迭香酸、總黃酮、水分、水溶性浸出物含量的權(quán)重分別為0.297 1、0.277 5、0.163 7、0.261 6，以迷迭香酸含量的權(quán)重最大，表明其對夏枯草藥材的質(zhì)量影響最大?？傸S酮含量權(quán)重排名第2位，提示總黃酮含量也是影響夏枯草藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。相對關(guān)聯(lián)度結(jié)果顯示，最大值為0.616 3，最小值為0.159 3，表明不同批次的藥材質(zhì)量存在差異，其中S16～S24批藥材質(zhì)量排名靠前，提示江蘇南京產(chǎn)夏枯草質(zhì)量較優(yōu)。

綜上所述，以迷迭香酸、總黃酮、水分及水溶性浸出物含量為評價(jià)指標(biāo)，采用熵權(quán)法和灰色關(guān)聯(lián)度分析法可用于夏枯草的質(zhì)量評價(jià)；不同批次夏枯草質(zhì)量存在差異，以江蘇南京產(chǎn)夏枯草質(zhì)量最優(yōu)。