李軍漢 王佳倩 李亞龍 蔣昌君

成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院（成都 610041）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)[1]。大多數(shù)NAFLD 患者有單純性脂肪肝（肝臟輕度脂肪性變），少數(shù)患者發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，并可逐步發(fā)展為肝硬化和肝癌[2]。在過(guò)去的幾十年里，NAFLD 是全球最常見的慢性肝病之一，也被認(rèn)為是肝酶異常的最常見原因[3]。隨著肥胖和糖尿病的日益流行，NAFLD 的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)逐漸上升[4]。目前，NAFLD 的治療方法主要包括服用減肥藥物、實(shí)施減肥手術(shù)以及采用胰島素增敏劑、降脂劑、抗氧化劑、益生菌、抗腫瘤壞死因子藥、細(xì)胞保護(hù)劑和其他新藥等[5]。 NAFLD 在臨床治療上尚無(wú)特效藥[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，NAFLD 的發(fā)生與久坐少動(dòng)呈正相關(guān)。近期文獻(xiàn)[7]報(bào)道，飲食調(diào)整和運(yùn)動(dòng)等包含在內(nèi)的生活方式改變?yōu)橹委烴AFLD 的首選方法。研究發(fā)現(xiàn)[8]，運(yùn)動(dòng)可有效改善NAFLD。但迄今為止，運(yùn)動(dòng)改善NAFLD 的分子作用機(jī)制不詳。

Canopy 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)調(diào)節(jié)因子2（Canopy FGF signaling regulator 2，CNPY2）是一種含有皂苷B-型域的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）調(diào)節(jié)蛋白。Hatta 等[9]首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，檢測(cè)了CNPY2蛋白和CNPY2 mRNA在小鼠體內(nèi)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNPY2在骨骼肌、心肌、平滑肌、血液、內(nèi)皮和上皮等不同器官和組織中廣泛分布，以心臟、肺、胰腺和肝臟中表達(dá)較高，在骨骼肌、腎臟、脾臟和胃中表達(dá)次之，在睪丸、大腦、大腸和小腸中表達(dá)最少；其次，在唾液腺、乳腺和甲狀腺管腔中，CNPY2 染色顯陽(yáng)性，提示CNPY2 作為內(nèi)分泌蛋白發(fā)揮細(xì)胞外泌體作用的可能性。目前，CNPY2 沒有得到廣泛的研究，其已知的生物學(xué)功能十分有限。有限的文獻(xiàn)研究報(bào)道，CNPY2 參與神經(jīng)突生長(zhǎng)、膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移過(guò)程[10]。在缺氧時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia inducible factor 1，HIF-1α）可引起血管平滑肌細(xì)胞CNPY2 表達(dá)增加[11]。CNPY2通過(guò)FGF21調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體和細(xì)胞脂蛋白代謝[12]。此外，在人類非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，CNPY2 通過(guò)激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制NSCLC 細(xì)胞凋亡[13]。由此可見，CNPY2 在細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、凋亡和脂質(zhì)代謝中扮演重要作用[14]。近期文獻(xiàn)[15]報(bào)道，CNPY2在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)。有學(xué)者[16]通過(guò)10周高脂膳食喂養(yǎng)成功誘導(dǎo)NAFLD 小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNPY2 調(diào)控PKR 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)狀激酶（protein kinase R-like ER ki?nase，PERK）/真核細(xì)胞翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）信 號(hào) 通 路 在NAFLD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。運(yùn)動(dòng)作為一種低成本治療手段，可有效預(yù)防和改善NAFLD，其深層機(jī)制被證實(shí)與運(yùn)動(dòng)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）水平相關(guān)[17]。然而，運(yùn)動(dòng)是否通過(guò)CNPY2調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 PERK/eIF2a 通路，從而發(fā)揮其對(duì)NAFLD 的改善作用，尚不得而知。

有關(guān)運(yùn)動(dòng)改善非酒精性脂肪性肝病的研究多為人體[18]和動(dòng)物[19]實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)未見文獻(xiàn)報(bào)道。研究表明，體內(nèi)能量代謝關(guān)鍵蛋白激酶—腺苷磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein ki?nase，AMPK）在不同運(yùn)動(dòng)時(shí)均可被激活，因此，AMPK激動(dòng)劑在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中常用來(lái)模擬運(yùn)動(dòng)刺激[20，21]。本研究聚焦于CNPY2 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2a 信號(hào)通路，通過(guò)高脂膳食誘導(dǎo)NAFLD 小鼠模型，并進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)；同時(shí)，通過(guò)棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)構(gòu)建HepG2 細(xì)胞NAFLD 體外模型[22]，采用AMPK 激動(dòng)劑（GSK621）、CNPY2 重組蛋白和 PERK 抑制劑（GSK2606414）干預(yù)，探討CNPY2 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α信號(hào)通路在有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)NAFLD 中的可能作用機(jī)制，以期為NAFLD 的運(yùn)動(dòng)康復(fù)和相關(guān)靶點(diǎn)篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：LEICARM2126 切片機(jī)、YT-6C 生物組織攤烤片機(jī)、勻漿機(jī)、蛋白定量?jī)x、Bio-Rad 水平電泳儀和轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像系統(tǒng)、BMII 型病理組織包埋機(jī)、Olympus BX51 光學(xué)顯微鏡、Nikon Eclipse55i 熒光顯微鏡等。

主要試劑：人肝癌HepG2 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；棕櫚酸（P5585）和油紅O（01391）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗體CNPY2（14635-1-AP）和PERK（20582-1-AP）購(gòu)自proteintech 公司；抗體血紅素加氧酶- 1（haem oxygenase- 1，HO- 1）（ET1604- 45），NADPH 氧 化 酶- 1（NADPH oxidase 1，NOX- 1）（ER1913-99）和p-eIF2α（ET1603-14）購(gòu)自華安生物；抗體核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）（ab92946）、IgG（ab6721）購(gòu)自abcam 公司；β-actin（AC026）購(gòu)自abclonal 公司；ELISA 檢測(cè)試劑盒白介素-1a（interleukin-1α，IL-1α）（ZC-32340）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）（ZC-32446）和 腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（ZC-35733）購(gòu)自上海茁彩。CNPY2 重組蛋白（13771-H08H）購(gòu)自Sino Bilogical 公司；AMPK 激動(dòng)劑（GSK621）（516535-5MC）購(gòu) 自MCE 公 司；PERK 抑 制 劑（GSK2606414）（B6020-1mg）購(gòu)自APEBIO公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型評(píng)價(jià)

1.2.1 動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

30只8周齡雄性C57/BL6J小鼠由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，SPF/VAF 級(jí)，許可證編號(hào)：JSNJ（蘇）2020-0003，按隨機(jī)數(shù)字表法分為普通飲食組（普飲組）、高脂飲食組（高脂組）和高脂飲食運(yùn)動(dòng)組（高脂運(yùn)動(dòng)組），每組10 只。所有小鼠在成都體育學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心小動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)，室溫18℃～22℃，相對(duì)濕度45 %～55 %，12 h陰暗交替，自由飲食飲水。普飲組給予普通飼料飼養(yǎng)，高脂組和高脂運(yùn)動(dòng)組給予高脂飼料飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)18周。在實(shí)驗(yàn)第9周，從各組中分別隨機(jī)抽取2 只小鼠，禁食12 h，以4 ml/kg 腹腔內(nèi)注射2 % 戊巴比妥鈉溶液麻醉，取肝臟左葉做油紅O病理形態(tài)檢測(cè)，結(jié)合血脂變化，以確認(rèn)模型制備成功[23]。從第10 周開始，高脂運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，取小鼠肝臟。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案[24]：高脂運(yùn)動(dòng)組小鼠先進(jìn)行1周跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練，初始速度為8 m/min×10 min，20 min/d，每天以0.5 m/min的速度和10 min/d的時(shí)間遞增，直至運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)到60 min/d，運(yùn)動(dòng)速度達(dá)到12 m/min，正式運(yùn)動(dòng)持續(xù)8 周，每周運(yùn)動(dòng)5 天，普飲組和高脂組小鼠靜置于沒有開機(jī)的跑步機(jī)上，持續(xù)時(shí)間和頻率與高脂運(yùn)動(dòng)組相同。

1.2.2 取材和模型評(píng)價(jià)

為避免運(yùn)動(dòng)應(yīng)激反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后48 h取材。取材前禁食12 h，以4 ml/kg 腹腔內(nèi)注射2 % 戊巴比妥鈉溶液麻醉，以腹部正中切口打開腹腔，迅速取出肝臟。用4%多聚甲醛將肝組織固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。采用NAS 評(píng)分[25]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肝組織脂肪性變進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。NAS 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：含脂肪滴肝細(xì)胞散在、稀少，0分；含脂肪滴肝細(xì)胞≤1/4，1分；含脂肪滴肝細(xì)胞≤1/2，2 分；含脂肪滴肝細(xì)胞≤3/4，3 分；肝組織幾乎被脂滴所代替，其面積>3/4，4分。

1.3 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)與分組

HepG2 細(xì)胞用含10% FBS 和1% 青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并放置在條件為37℃、5% CO2和95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，至細(xì)胞融合率達(dá)80%～90% 時(shí)加入0.25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1：3比例進(jìn)行傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

實(shí)驗(yàn)分為8 組：即空白對(duì)照組（C 組），模型組（M組），AMPK 激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621 組），CNPY2 重組蛋白干預(yù)組（CNPY2 組），CNPY2 重組蛋白+ AMPK激動(dòng)劑干預(yù)組（CNPY2+ GSK621 組），CNPY2 重組蛋白+ PERK 抑制劑干預(yù)組（CNPY2+GSK2606414 組），AMPK 激動(dòng)劑+PERK 抑制劑干預(yù)組（GSK621+GSK2606414 組），CNPY2 重組蛋白+AMPK 激動(dòng)劑+PERK 抑制劑干預(yù)組（CNPY2+ GSK621+ GSK2606414組）。

除空白對(duì)照組外，其余各組在加入棕櫚酸（palmit?ic acid，PA）（濃度250 μM）孵育肝細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)NAFLD 體外模型后[22]，采用AMPK 激動(dòng)劑（GSK621）（濃度1 μM）模擬細(xì)胞水平運(yùn)動(dòng)效應(yīng)[21]，以及CNPY2重組蛋白（CNPY2）（濃度2.5 ng/mL）和PERK 抑制劑（GSK2606414）（濃度0.5 μM）干預(yù)24 h。具體干預(yù)方案為：GSK621組加入AMPK 激動(dòng)劑干預(yù)24 h；CNPY2組加入CNPY2 重組蛋白干預(yù)24 h；CNPY2+ GSK621組加入AMPK 激動(dòng)劑和CNPY2 重組蛋白共同干預(yù)24 h；CNPY2+ GSK2606414 組加入CNPY2 重組蛋白和PERK 抑制劑共同干預(yù) 24 h；GSK621 +GSK2606414 組加入AMPK 激動(dòng)劑和PERK 抑制劑共同干預(yù) 24 h；CNPY2+ GSK621+ GSK2606414 加入AMPK 激動(dòng)劑、CNPY2 重組蛋白和PERK 抑制劑共同干預(yù)24 h。

1.4 蛋白提取和Western Blotting檢測(cè)

提取肝組織和肝細(xì)胞總蛋白，具體步驟如下：肌組織50 mg，加人預(yù)冷RIPA 裂解液500 μ1，電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，靜置10 min后，12 000 rpm低溫離心15 min，取上清；收集肝細(xì)胞蛋白，超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后靜置10 min，4℃離心，取上清，BCA法測(cè)肝組織和肝細(xì)胞總蛋白含量。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，室溫下5%BSA 封閉1 h，4℃過(guò)夜孵育一抗，CNPY2 稀釋濃度為1∶400，PERK、HO-1、Nrf2、NOX-1、p-eIF2α稀釋濃度均為1∶1000，β-actin 稀釋濃度為1∶100000。次日TBST 清洗，室溫孵育二抗1 h，再次TBST 清洗。ECL 發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像。βactin 作為內(nèi)參，使用 Gel-pro 圖像分析軟件，對(duì)Western Blot 結(jié)果進(jìn)行灰度掃描并量化分析，蛋白表達(dá)量用“目的蛋白/β-actin”計(jì)算。

1.5 HepG2細(xì)胞油紅O染色

用預(yù)冷PBS 清洗細(xì)胞3 次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。加入油紅O 染液于6 孔板內(nèi)，室溫反應(yīng)10 min，用60%的異丙醇進(jìn)行脫色，緊接著用蘇木素染核30 s，重新用60%的異丙醇清洗2～3 次，倒置顯微鏡下觀察，油紅O 染色結(jié)果進(jìn)行量化分析。同時(shí)將細(xì)胞種植于96 孔板，重復(fù)上述操作，最后使用100%異丙醇溶解已染色的細(xì)胞，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)600 nm 處檢測(cè)其吸光度值。

1.6 HepG2 細(xì)胞qRT-PCR 檢測(cè)

按照Trizol 法提取HepG2 細(xì)胞總RNA，用Nano?drop ND-1000 分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的純度及濃度，選取OD 值在1.80～2.0 間的樣品按照TAKARA Prime Script TM RTMaster Mix 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL。RT-PCR 反應(yīng)體系為10 μL，按照TAKARASYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TliR?NaseH Plus）試劑盒說(shuō)明書，采用LightCycler480 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。所有引物設(shè)計(jì)與合成委托由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并以ULTRAPAGE 純化，引物設(shè)計(jì)見表1。以β-actin 作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算相對(duì)量，采用2－ΔΔCT法分析。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.7 HepG2 細(xì)胞上清液ELISA 檢測(cè)

將各組細(xì)胞培養(yǎng)基移取至離心管中，在4℃下以1500 rpm 的速度離心10 min，收集各組細(xì)胞上清液，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)各組上清液中IL-6、IL-1α、TNF-α細(xì)胞因子水平。每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝組織病理形態(tài)變化

各組小鼠肝臟病理形態(tài)結(jié)果（圖1A）顯示：高脂組肝細(xì)胞可見明顯脂肪性變，肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂肪空泡充填；高脂運(yùn)動(dòng)組肝細(xì)胞脂肪性變程度顯著減輕。肝細(xì)胞脂肪性變積分結(jié)果（圖1B）顯示：高脂組肝細(xì)胞脂肪性變積分較普飲組顯著升高（P＜0.05），高脂運(yùn)動(dòng)組肝細(xì)胞脂肪性變積分較高脂組顯著降低（P＜0.05），提示有氧運(yùn)動(dòng)顯著改善小鼠肝組織病理形態(tài)。

圖1 各組肝臟病理形態(tài)變化（×400）

2.2 各組小鼠肝組織CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化

各組小鼠肝組織Western Blotting 結(jié)果（見圖2）顯示，與普飲組比較，高脂組CNPY2、PERK、p-eIF2α蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與高脂組比較，高脂運(yùn)動(dòng)組以上指標(biāo)顯著降低（P＜0.05），提示有氧運(yùn)動(dòng)下調(diào)小鼠肝組織CNPY2 表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α信號(hào)通路。

圖2 各組小鼠肝組織CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化

2.3 各組HepG2 細(xì)胞油紅O染色變化

各組HepG2 細(xì)胞油紅O 染色結(jié)果（見圖3 A）顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞呈不規(guī)則多角形或卵圓形生長(zhǎng)，胞質(zhì)染色淺淡或無(wú)明顯著色；與對(duì)照組比較，模型組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多；與模型組比較，CNPY2 重組蛋白干預(yù)組紅染顆粒增加，其余干預(yù)組脂滴數(shù)量較模型組不同程度減少。各組肝細(xì)胞脂滴光密度結(jié)果（見圖3 B）顯示：模型組（M組）肝細(xì)胞脂滴光密度較對(duì)照組（C組）顯著增加（P＜0.01）；與模型組（M 組）比較，CNPY2 重組蛋白干預(yù)組（CNPY2組）肝細(xì)胞脂滴光密度顯著增加（P＜0.05），AMPK 激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621組）肝細(xì)胞脂滴光密度顯著下降（P＜0.05）；與CNPY2 組比較，CNPY2+GSK2606414 組和CNPY2+GSK621 組肝細(xì)胞脂滴光密度均顯著下降（P＜0.05）；與 GSK621+ GSK2606414 組比較，GSK621+GSK2606414+CNPY2 組肝細(xì)胞脂滴光密度顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組HepG2細(xì)胞脂滴變化（×400）

2.4 各組HepG2 細(xì)胞CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化

各組HepG2 細(xì)胞CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化結(jié)果（見圖4）顯示：與對(duì)照組（C 組）比較，模型組（M 組）肝細(xì)胞CNPY2、PERK 和p-eIF2α、CNPY2 mRNA 和PERK mRNA 表 達(dá) 顯 著 增 加（P＜0.05）；與M 組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2）以上分子表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），AMPK激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621）以上分子表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與CNPY2 組 比 較，CNPY2+ GSK621 組 和CNPY2+GSK2606414 組以上分子表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；與GSK2606414 + GSK621 組比較，GSK2606414 +GSK621+CNPY2組以上分子表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

圖4 各組HepG2 細(xì)胞CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路表達(dá)變化

2.5 各組HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激分子表達(dá)變化

各組HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激分子表達(dá)變化結(jié)果（見圖5）顯示：與對(duì)照組（C組）比較，模型組（M組）肝細(xì)胞Nrf2、HO-1、NOX-1 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與M 組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2）以上分子表達(dá)顯著升高（P＜0.05），AMPK 激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621）以上分子表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與CNPY2組 比 較 ，CNPY2 + GSK621 組 和 CNPY2 +GSK2606414 組以上分子表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；與GSK2606414 + GSK621 組比較，GSK2606414 +GSK621+CNPY2組以上分子表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

圖5 各組HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激分子表達(dá)變化

2.6 各組HepG2 細(xì)胞炎癥因子濃度變化

各組HepG2 細(xì)胞炎癥因子濃度變化結(jié)果（見圖6）顯示：與對(duì)照組（C 組）比較，模型組（M 組）肝細(xì)胞上清液IL-1a、IL-6 和TNF-a 濃度顯著增加（P＜0.05）；與M 組比較，CNPY2重組蛋白干預(yù)組（CNPY2）以上分子濃度顯著升高（P＜0.05），AMPK 激動(dòng)劑干預(yù)組（GSK621）以上分子濃度顯著降低（P＜0.05）；與CNPY2組比較，CNPY2+GSK621 組和CNPY2+GSK2606414組以上分子濃度顯著降低（P＜0.05）；與GSK2606414+GSK621 組比較，GSK2606414 + GSK621+CNPY2組以上分子濃度顯著升高（P＜0.05）。

圖6 各組HepG2 細(xì)胞炎癥因子濃度變化

3 討論與分析

NAFLD 是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，其主要病理學(xué)特征為肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，早期病理僅為單純性肝細(xì)胞脂肪樣變，而中晚期會(huì)繼發(fā)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞凋亡和壞死[26]。動(dòng)物模型和細(xì)胞模型是NAFLD 研究的常用手段。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、能模擬體內(nèi)環(huán)境，但個(gè)體差異較大[27]；細(xì)胞模型簡(jiǎn)便、高效，能克服個(gè)體差異的影響，更適于開展機(jī)制研究[28]。病理形態(tài)組織學(xué)是NAFLD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[29]。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD 小鼠動(dòng)物模型，肝組織病理形態(tài)結(jié)果顯示，高脂組肝細(xì)胞脂肪性變較普飲組顯著增加，提示NAFLD 動(dòng)物模型復(fù)制成功。NAFLD 體外模型的構(gòu)建常采用棕櫚酸誘導(dǎo)、油酸誘導(dǎo)、游離脂肪酸誘導(dǎo)、油酸與棕櫚酸按一定比例混合誘導(dǎo)等方法[30]。棕櫚酸（PA）容易引發(fā)肝臟的脂肪變性，是飲食和血清中最豐富的游離脂肪酸[31]。PA 常用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞HepG2 體外模擬非酒精性脂肪肝的損傷及脂質(zhì)沉積[32].。研究報(bào)道[22]，棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞24 h，肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累顯著增多，提示棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞24 h 可成功建立NAFLD 體外模型。本研究結(jié)果顯示：模型組在棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞24 h 后，油紅O 染色可見其肝細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著增加，提示本研究成功誘導(dǎo)肝細(xì)胞NAFLD 體外模型。

研究報(bào)道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）是NAFLD 發(fā)展進(jìn)程中重要的病理基礎(chǔ)[33]。ERS 的信號(hào)通路由PERK、ATF6 和IRE1α三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78（BiP）組成。在非應(yīng)激狀態(tài)下，BiP 的腔域抑制著PERK、ATF6和IRE1α的活性，并與這些跨膜蛋白結(jié)合。然而，當(dāng)未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累時(shí)，BiP 與PERK、IRE1α和ATF6α解離，優(yōu)先與未折疊蛋白結(jié)合，從而激活ERS信號(hào)通路[34]。 CNPY2是CNPY蛋白家族（CNPY1、CNPY2、CNPY3 和CNPY4）之一，它是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可溶性蛋白[15]。有研究[16]報(bào)道，CNPY2參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CNPY2 可激活PERK/eIF2α通路，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要分子組成之一。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α通路參與高脂膳食誘導(dǎo)小鼠NAFLD 形成，有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制CNPY2/PERKeIF2α通路活性，降低CNPY2/PERK-eIF2α通路相關(guān)分子表達(dá)，從而有效改善NAFLD。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，棕櫚酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞NAFLD 體外模型，與對(duì)照組比較，模型組CNPY2/PERK-eIF2α通路相關(guān)分子表達(dá)顯著升高。與模型組比較，CNPY2 重組蛋白干預(yù)組上述通路相關(guān)分子表達(dá)顯著升高，AMPK 激動(dòng)劑干預(yù)組上述通路相關(guān)分子表達(dá)顯著降低，提示CNPY2 重組蛋白干預(yù)可激活CNPY2/PERK-eIF2α信號(hào)通路，促進(jìn)棕櫚酸作用效應(yīng)，而AMPK 激動(dòng)劑有效抑制CNPY2/PERKeIF2α信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)棕櫚酸作用效應(yīng)。研究結(jié)果還顯示，AMPK激動(dòng)劑和PERK 抑制劑均可逆轉(zhuǎn)CNPY2 重組蛋白干預(yù)效應(yīng)，提示AMPK 激動(dòng)劑（模擬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)效應(yīng)）通過(guò)CNPY2 有效抑制PERK/eIF2α信號(hào)通路活性，從而逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞NAFLD。以上研究結(jié)果共同表明，CNPY2介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路在有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)NAFLD 中發(fā)揮重要作用。有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)下調(diào)CNPY2 表達(dá)，抑制PERK/eIF2α信號(hào)通路活性，降低PERK/eIF2α信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)，從而改善NAFLD。

研究報(bào)道，NAFLD 中肝細(xì)胞ERS 與肝細(xì)胞脂質(zhì)異常積聚、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[35]。血紅素加氧酶-1（haem oxygenase-1，HO-1）是一種廣泛存在的抗氧化防御酶，幾乎分布于所有的組織和器官，對(duì)氧化損傷具有良好的保護(hù)效應(yīng)，成為研究抗氧化損傷的首選靶基因之一[36]。在炎性反應(yīng)中，HO系統(tǒng)被認(rèn)為是細(xì)胞最重要的保護(hù)通路之一，參與抗炎與多種急慢性氧化應(yīng)激損傷[37]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear fac?tor E2-related factor 2，Nrf2），在機(jī)體抗氧化應(yīng)激中起著重要作用。Nrf2 感受氧化應(yīng)激，使抗氧化酶（包括HO-1）分子表達(dá)升高，減輕自由基損傷，是調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子[38]。有研究表明，Nrf2抑制脂質(zhì)沉積和氧化應(yīng)激[39]。NADPH 氧化酶（NADPH oxi?dase，NOX）是細(xì)胞內(nèi)氧自由基的主要來(lái)源[40]。NOX-1可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)自由基的生成，是NOX 蛋白家族成員之一[41]。IL-1α、IL-6 和TNF-α是重要的炎癥因子，在炎癥反應(yīng)啟動(dòng)中具有重要作用，其濃度與炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)[42]。我們推測(cè)，CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α通路在棕櫚酸誘導(dǎo)NAFLD 中發(fā)揮作用，其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激和炎癥有關(guān)。本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組肝細(xì)胞HO-1、Nrf2、NOX-1蛋白表達(dá)及肝細(xì)胞上清液IL-1α、IL-6 和TNF-α濃度均顯著增加，提示棕櫚酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞NAFLD 體外模型形成，導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞炎癥增加。與模型組比較，CNPY2 重組蛋白干預(yù)組以上分子表達(dá)顯著升高，AMPK 激動(dòng)劑干預(yù)組上述分子表達(dá)顯著降低，提示CNPY2 重組蛋白增加肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥因子水平，對(duì)棕櫚酸干預(yù)效應(yīng)具有促進(jìn)作用，而AMPK激動(dòng)劑減少肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥因子水平，抑制棕櫚酸干預(yù)效應(yīng)，提示AMPK 激動(dòng)劑（模擬細(xì)胞運(yùn)動(dòng)效應(yīng)）可有效抑制和逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞NAFLD，其機(jī)制可能與AMPK 激動(dòng)劑減少肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥水平有關(guān)。以上研究結(jié)果表明，有氧運(yùn)動(dòng)可有效改善NAFLD，其機(jī)制可能與其抑制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞炎癥有關(guān)。

4 結(jié)論

CNPY2 介導(dǎo)PERK/eIF2α信號(hào)通路參與NAFLD形成。有氧運(yùn)動(dòng)可有效改善NAFLD，其機(jī)制可能與其下調(diào)CNPY2 表達(dá)，通過(guò)抑制PERK/eIF2α通路活性，降低PERK/eIF2α信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)，從而減少肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞炎癥有關(guān)。