張業(yè)廷 付燕 李雪 袁瓊嘉

1 中國民用航空飛行學院（四川 廣漢 618307）

2 西南民族大學體育學院（成都 610041）

3 成都體育學院（成都 610041）

許多學者致力于探討運動干預對阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）有益影響的機制，并已有幾種機制被用來解釋體育活動對AD 的防治作用，包括：運動可減少β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）生成、促進Aβ清除、抑制Aβ斑塊沉積和磷酸化Tau的堆積；運動可增加海馬、大腦皮質等部位神經營養(yǎng)因子表達，促進血管生成，促進海馬神經和突觸的發(fā)生，加強神經網絡的聯(lián)系，提高突觸可塑性等[1-4]；運動可增強機體抗自由基能力，抑制其神經毒性等[5]。也有學者開展了運動對AD 小鼠成年海馬神經發(fā)生（adult hippocam?pal neurogenesis，AHN）的研究，AHN 是神經干細胞（neural stem cells，NSCs）通過前體細胞和成神經細胞的擴增，以及這些新生神經元與現(xiàn)有神經回路的整合，產生新的功能性成熟齒狀顆粒細胞（dentate gran?ule cells，DGCs）的過程。運動后齒狀回神經發(fā)生的增加與空間記憶的增強有關，而通過局部伽馬射線照射海馬區(qū)域抑制神經發(fā)生消除了運動刺激對空間學習記憶的改善作用[6，7]。但是這些研究并沒有完全闡明運動如何調控AHN及影響學習記憶的機制。

神經發(fā)生貫穿于人的一生，其主要存在的兩個腦區(qū)分別是海馬齒狀回（dentate granulosa，DG）的亞顆粒區(qū)（subgranular zone，SGZ）和側腦室的室下區(qū)（sub?ventricular zone，SVZ）[8]。神經發(fā)生是指成年NSCs通過成神經細胞和中間祖細胞的擴增，以及將新生神經元與固有的神經回路進行整合，產生新的功能性成熟DGCs 的過程[9]。與此同時，成年的神經發(fā)生會受到外部環(huán)境影響和內在遺傳因素的嚴格控制[10]。通過使用轉基因小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，Notch通路成分在出生后早期和成年大腦的神經生發(fā)區(qū)內表達，這也支持了Notch信號調節(jié)成年后NSCs 的可能性[11，12]。Notch 信號的抑制是一種已知的誘導神經元分化的條件，它會導致Hes1 的下調以及神經元素2（Neurogenin2，Ngn2）和Dll1的持續(xù)上調[13]。包括DNA甲基化在內的表觀遺傳修飾在干細胞功能中起著重要作用，已成為NSCs中外部環(huán)境影響和基因表達轉錄控制的重要環(huán)節(jié)[14]。DNA的甲基化是由DNA 甲基轉移酶（DNA methylation，DNMTs）催化的。DNMTs 的表達水平通常會隨著細胞的分化而降低；然而，DNMT1和DNMT3a即使在成年人的大腦中，包括海馬區(qū)，仍然表達[15]。有研究結果表明，盡管Notch 信號活躍，但其表觀遺傳沉默仍然導致了神經元分化[16]。與神經生成相關的基因Notch1、RG?MA和AKT1在基因體中獲得5-羥甲基胞嘧啶，并在分化過程中上調。目前，還沒有研究對胚胎期和成年期Notch 信號元件的DNA 甲基化水平進行檢測。Notch1的低活性降低了組織特異性基螺旋環(huán)螺旋（bHLH）基因活性，導致Ngn2等前神經bHLH因子的上調；這些因子會抑制神經祖細胞（neuro progenitor cells，NPCs）的維持，促進神經分化。Notch1、Hes1 和Ngn2 對NCSs的發(fā)展至關重要，因此可能是表觀遺傳修飾的候選基因。

盡管AD 癥狀背后的確切神經生物學機制仍不清楚，但大腦中與學習和記憶有關的區(qū)域，如海馬和前額葉皮質，出現(xiàn)了嚴重的神經元丟失，這在AD 大腦中很明顯。AHN 對學習和記憶功能的影響表明它參與了AD 的病程發(fā)展，因為不良的記憶功能可以在AD 確診前15年出現(xiàn)[17]。轉基因AD小鼠模型顯示，海馬依賴的學習和記憶任務（如空間學習、物體識別和情境恐懼條件反射）存在缺陷[18]。然而，對AD 小鼠海馬神經發(fā)生的表觀遺傳學調控機制及Notch1、Hes1和Ngn2的潛在關系尚未完全了解。通過研究三個Notch 通路基因啟動子的DNA 甲基化，我們將探討運動調控海馬神經基因的表觀遺傳學機制。本研究的問題是運動是否會影響Notch 通路基因啟動子的DNA 甲基化，從而可能在AD引起的神經發(fā)生過程中參與調控Notch信號靶基因活性。因此，我們利用甲基化特異性PCR（Methylationspecific PCR，MSP），研究Notch1、Hes1 和Ngn2 在AD小鼠中的DNA甲基化水平。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康3 月齡APP/PS1 雙轉基因AD 小鼠，體重25～30 g，購于“南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院”，許可證號：蘇ICP備10073918號-3。動物的飼養(yǎng)條件：環(huán)境清潔安靜，室溫20℃～28℃，相對濕度為40%～60%，模擬自然光照條件，每日光照12 小時，自由攝取動物飼料和飲用純凈水，每周換經過紫外線嚴格消毒的墊料、食物及飲用水。將小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后隨機分為兩組：AD 對照組（ADC）、AD 運動組（ADE），每組20 只。對照組不進行運動，運動組進行為期5 個月的有氧運動干預。運動干預后，將所有AD小鼠取材進行相關指標的檢測。

1.2 有氧運動方案

在運動訓練開始前，所有的運動組小鼠適應跑步機環(huán)境10 min，連續(xù)兩天（第一天5 m/min，第二天8 m/min）。適應結束后，各運動組進行跑臺運動，每周5天，每天30 min，持續(xù)5 個月。在每次訓練過程中，以10 m/min 的速度開始跑5 min，然后以15 m/min 跑20 min，最后以10 m/min 的速度跑5 min 結束。在這種強度下，當小鼠停止不運動時，不對小鼠進行電刺激，只輕柔地觸摸尾巴讓小鼠繼續(xù)運動[19]。

1.3 腦組織取材和相關指標檢測

腦組織取材于運動干預結束后24 h～48 h 內進行。經心臟快速灌注生理鹽水及慢速灌注預冷至4℃的4%多聚甲醛后，用眼科剪、鑷子迅速剝開顱骨取出腦組織。每組隨機取6只腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后將腦組織依次放入10%、20%、30%的蔗糖溶液中進行梯度脫水5～7 d。在冰凍切片機中根據(jù)腦立體定位圖冠狀面切取海馬部位制作厚度為5 μm 的切片10 張，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于制作冰凍切片以備免疫熒光觀察分析。6 只用于提取蛋白（蛋白儲存于4℃冰箱）進行免疫蛋白印跡檢測。6只用于提取DNA（DNA儲存于－20℃冰箱）進行甲基化特異性PCR 檢測及提取mRNA（mRNA 儲存于－20℃冰箱）用于檢測海馬神經發(fā)生相關基因的mRNA表達。

1.4 免疫熒光染色觀察海馬蛋白表達

通過免疫熒光實驗檢測相關蛋白表達量。取出事先切好保存于－20℃冰箱的冰凍腦組織切片，在4°C環(huán)境下于4%多聚甲醛中固定10 min。用PBS 清洗兩次后，在組織切片上滴加3%的過氧化氫溶液封閉，避光室溫孵育25 min，于4°C 環(huán)境下孵育一抗（表1）過夜。第二天，PBS 清洗后，用熒光抗體（1︰100，R＆D Sys?tems USA）37°C環(huán)境下避光孵育1 h。采用DAPI染色劑進行核染色。利用OLYMPUS顯微鏡獲得熒光圖像，每張切片采取20×、40×放大倍數(shù)圖片，高倍視野均在低倍視野區(qū)域內選取，其中在400倍光鏡下選取5個互不重疊相同面積的視野進行采集，使用Image-ProPlus +6.0軟件分析熒光強度（AU/μm2）。

表1 抗體信息

1.5 Real-time PCR 檢測海馬神經發(fā)生相關基因的mRNA表達

在通風櫥內提取海馬組織mRNA，加RNAzol 入EP管中處理勻漿后的海馬組織，再加入DEPC處理水，振蕩離心，取出上清液，加入75%濃度乙醇，在室溫環(huán)境下靜置離心，吸凈上清液，留下EP 管底部白色沉淀物；加入75%濃度的乙醇，離心后吸盡上清液，然后加入DEPC 處理水溶解mRNA。將提取的mRNA 于當天反轉錄為cDNA。在PCR 管中配置qPCR 反應體系，加入12.5 μl 的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix試劑，加入上下游引物（≤5 μM）（表2），DNA 模板（≈1000 ng），用不含核酸酶的ddH2O配至配至25 μl。完全混合預混液，分配至八聯(lián)管中。將八聯(lián)管放入CFX96 實時熒光定量儀中，按三步法循環(huán)方案進行反應。反應結束后，分析PCR 產物的融解曲線，確定反應特異性。數(shù)據(jù)處理采用2-△△CT（Livak）方法。

表2 PCR引物序列及擴增產物長度

1.6 Western Blot 檢測小鼠大腦海馬組織相關蛋白表達量

根據(jù)小鼠腦組織立體定位圖譜，可以用鑷子輕松將海馬組織剝離大腦，取出海馬組織，稱重后放入EP管中，加入RIPA裂解液，室溫環(huán)境下靜置30 min，然后將其放入離心機中離心，吸取EP 管中上清液，加入5×上樣緩沖液，于95℃金屬浴中加熱5 min～10 min 以使蛋白質充分的變性。用濕轉方法將蛋白質轉至PVDF 膜上（15～20 mA 電流轉膜30 min）。去脂牛奶封閉目的蛋白條帶1 h，之后用一抗（表1）分別將帶有相應目的蛋白的PVDF 膜在4°C 環(huán)境中孵育過夜。第二天，TBST液洗滌PVDF膜，然后用二抗室溫孵育1 h；洗滌后進行化學發(fā)光、顯影、定影，獲得蛋白印跡圖像。掃描膠片，利用Gel pro plus軟件對內參蛋白和目的蛋白進行光密度（OD）值的分析（蛋白表達量=目的蛋白OD值/內參蛋白OD值）。

1.7 甲基化檢測相關基因

將海馬組織用注射器反復吹打為細胞懸液，離心后倒除上清液，加緩沖液GA，振蕩放置后加入蛋白酶K，震蕩混勻再加入緩沖液GB，混勻，70℃放置后加入200 μl 無水乙醇，將溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中，離心后倒掉廢液，向CB3中加入緩沖液GD，離心后倒掉廢液，再向CB3 中加入漂洗液PW 離心，室溫放置以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，將CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間部位滴加TE洗脫緩沖液，離心后將溶液收集到離心管中。將提取的基因組DNA用重亞硫酸鹽處理。取0.2 ml PCR管，配制PCR反應體系（表3），PCR引物序列及擴增產物長度見表4（M：甲基化序列引物；U：非甲基化序列引物），PCR擴增條件見表5。反應終產物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳30 min（5V/cm 電壓，1×TAE Buffer），最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。甲基化百分比=甲基化條帶光密度值/（甲基化條帶光密度值+ 非甲基化條帶光密度值）×100%。

表3 PCR反應體系

表4 PCR引物序列及擴增產物長度

表5 PCR擴增條件

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠海馬Notch1檢測結果

由圖1 可知，ADE 組海馬Notch1 mRNA 表達顯著低于ADC 組（t=4.496，P＜0.01），ADE 組海馬Notch1 蛋白表達顯著低于ADC組（t=8.602，P＜0.01）。

圖1 各組小鼠海馬Notch1基因及蛋白表達比較

小鼠海馬Notch1表達熒光圖見圖2，圖中藍色代表DAPI標記的細胞核，紅色代表Notch1免疫陽性產物表達。如圖3所示，ADE組小鼠海馬DG區(qū)Notch1陽性細胞數(shù)量顯著低于ADC 組（t=4.193，P＜0.01）；ADE 組小鼠海馬DG區(qū)Notch1免疫陽性產物熒光強度與ADC組相比沒有顯著差異（t=1.668，P=0.126）。

圖2 各組小鼠海馬DG區(qū)Notch1表達熒光圖

圖3 各組小鼠海馬Notch1熒光表達比較

2.2 小鼠海馬Hes1檢測結果

如圖4所示，ADE 組海馬Hes1 mRNA 表達顯著低于ADC 組（t=4.388，P＜0.01）。ADE 組海馬Hes1 蛋白表達顯著低于ADC組（t=7.906，P＜0.01）。

圖4 各組小鼠海馬Hes1基因及蛋白表達比較

小鼠海馬Hes1 表達熒光圖見圖5，圖中藍色代表DAPI 標記的細胞核，紅色代表Hes1 免疫陽性產物表達。如圖6所示，ADE組小鼠海馬DG區(qū)Hes1陽性細胞數(shù)量顯著低于ADC 組（t=5.524，P＜0.01）；ADE 組小鼠海馬DG區(qū)Hes1免疫陽性產物熒光強度顯著低于ADC組（t=2.308，P＜0.05）。

圖5 各組小鼠海馬Hes1表達熒光圖

圖6 各組小鼠海馬Hes1熒光表達比較

2.3 小鼠海馬Ngn2檢測結果

如圖7所示，ADE組海馬Ngn2 mRNA表達顯著高于ADC 組（t=－2.995，P＜0.05）。ADE 組海馬Ngn2 蛋白顯著高于ADC組（t=－5.934，P＜0.01）。

圖7 各組小鼠海馬Ngn2基因及蛋白表達比較

各組小鼠海馬Ngn2 表達熒光圖見圖8，圖中藍色代表DAPI 標記的細胞核，紅色代表Ngn2 免疫陽性產物表達。如圖9 所示，ADE 組小鼠海馬DG 區(qū)Ngn2 陽性細胞數(shù)量顯著高于ADC組（t=－5.176，P＜0.01）；ADE組小鼠海馬DG區(qū)Ngn2免疫陽性產物熒光強度顯著高于ADC組（t=－2.373，P＜0.05）。

圖8 各組小鼠海馬Ngn2表達熒光圖

圖9 各組小鼠海馬Ngn2熒光表達

2.4 小鼠海馬Notch1、Hes1和Ngn2的甲基化檢測

ADE 組小鼠海馬Notch1 及Hes1 的甲基化率顯著高于ADC 組（t=－5.679，P＜0.01；t=－21.720，P＜0.01；圖10A、B、C）；ADE 組小鼠海馬Ngn2 的甲基化率顯著少于ADC組（t=4.989，P＜0.01；圖10A、D）。

圖10 各組小鼠海馬Notch1、Hes1和Ngn2甲基化檢測

3 討論

Notch 信號在海馬齒狀回顆粒下層的神經發(fā)生控制中也起著重要作用[20，21]?；虺聊瑢嶒灡砻?，Notch和Notch信號通路組分在調控成年DG神經發(fā)生過程中起重要作用。Notch1條件性缺失或激活Notch1過表達對成年DG 的神經發(fā)生有顯著影響[22]。通過激活Notch1 表達會使其胞內活性形式NICD 增加，NICD 復合物形成則激活Notch 信號通路增加NSCs，促進干細胞的增殖，并可能導致神經膠質細胞的生成[23]。而NICD 復合物會提高Hes1、Hes5 等轉錄抑制基因的表達，進而抑制神經分化發(fā)育相關基因（Mammalian achaete-scute homologue-1，Mash1）、Ngn2 等促神經元發(fā)生相關基因以及Dll1 的轉錄，從而維持NSCs 的增殖活力與多能性[24]。抑制Notch 信號能夠導致Hes1 的下調和Ngn2的持續(xù)上調，這將不足以刺激神經元分化[13]。例如非二噁英樣聯(lián)苯多氯化物、Notch 信號通路抑制劑DAPT 等則可以通過抑制Notch1 的表達來減少NSCs的增殖并導致其向神經元方向分化[25]。

在AHN中，NSCs是選擇繼續(xù)增殖還是向神經元分化，Notch 信號通路則起到了關鍵的作用。通過調節(jié)Notch 信號通路可以阻止受損腦區(qū)膠質細胞迅速填充以及成年動物腦內NPCs向膠質細胞分化，從而為神經網絡的恢復提供有利條件。在體外通過對Notch 信號通路的調控可以精確影響NSCs 向神經功能細胞分化的過程和比例[26]。而在體內，通過抑制Notch1 形成NICD 復合物可以降低Notch 信號通路轉導，進而減少細胞的增殖，并間接促進NSCs 向神經元方向分化[27]。Pierre 等發(fā)現(xiàn)通過提高BCL6 表達，增加其與SIRT1 的相互作用可以抑制Notch 信號通路，從而導致大量的NSCs向神經元細胞分化[16]。

AD 患者腦部多存在Notch 信號通路異常，但這些信號通路在成熟神經系統(tǒng)中的功能和阿爾茲海默病發(fā)病中的作用尚未完全明確[28]。淀粉樣前體蛋白（Amy?loid precursor protein，APP）被γ分泌酶（γ-secretase）裂解，產生Aβ，被認為與AD 患者的神經變性有關[29]。早老素（PS）是γ分泌酶蛋白水解復合物的催化分子，它的突變是早發(fā)型家族性AD的主要原因。除了APP外，γ分泌酶底物還包括Notch1同源物、Notch配體Delta和Jagged 以及其他I 型膜蛋白，這引起了人們對于抑制γ分泌酶而產生的毒性機制的關注[30]。γ分泌酶對Notch蛋白水解的改變可能參與AD的發(fā)病機制[29]。因此，研究AD 中Notch 信號通路對闡明AD 的多種發(fā)病機制以及治療和預防AD 具有重要意義。而目前缺乏相應的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，運動能夠降低AD 小鼠海馬Notch1、Hes1的表達，而增加Ngn2的表達，但是運動通過怎樣的機制引起這一變化并不清楚。

表觀遺傳修飾，包括DNA 甲基化，已被證明參與干細胞的中心功能，并作為NSCs細胞外環(huán)境影響與基因表達的轉錄調控之間的重要環(huán)節(jié)[31]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA 的甲基化是由DNA 甲基轉移酶（DNMTs）催化的。DNMTs 的表達水平通常隨著細胞的分化而降低；然而，DNMT1 和DNMT3a 即使在有絲分裂為主的成年大腦中仍然表達，包括海馬區(qū)[32]。神經發(fā)生相關基因Notch1 在基因體中獲得5-羥甲基胞嘧啶，并在分化過程中上調[33]。Notch1 的低活性降低了組織特異性堿性螺旋-環(huán)-螺旋（helix–loop–helix，bHLH）基因活性，導致Ngn2 等前神經bHLH 因子的上調；這些因子抑制神經祖細胞的維持，促進神經元分化。Notch1、Hes1 和Ngn2對于NCSs的發(fā)展至關重要，可能是表觀遺傳修飾的候選基因。有研究表明，DNA 甲基化可能參與調控成年神經發(fā)生中的Notch 信號活性，Notch1、Hes1 和Ngn2 啟動子的DNA 甲基化與海馬神經發(fā)生中的基因抑制有關[34]。出生后改變DNA 甲基化，被認為有助于一些復雜疾病的晚發(fā)[35]。不同的環(huán)境，尤其是應激反應似乎能夠改變整個基因組的DNA甲基化過程[36]。然而，Notch1、Hes1和Ngn2在運動對AD小鼠海馬神經發(fā)生中的表觀遺傳學調控機制和潛在關系尚不完全清楚。目前，還沒有關于運動對AD 小鼠海馬Notch 信號元件的DNA 甲基化水平所進行的檢測。本研究發(fā)現(xiàn)，長期有氧運動后AD小鼠海馬Notch1及Hes1的甲基化率顯著增加，而其Ngn2 的甲基化率則顯著減少。因此，長期有氧運動可能通過提高Notch1及Hes1的甲基化率，降低Ngn2 的甲基化率，從而降低Notch1 及Hes1的表達、提高Ngn2的表達。而這可能是長期有氧運動顯著促進AD小鼠海馬AHN的增殖及分化過程的重要原因之一。但是，運動對Notch 信號元件DNA 甲基化水平的改變是如何影響AD 小鼠海馬AHN 過程的，還需要進一步的研究。

4 結論

長期有氧運動可能通過提高AD 小鼠海馬Notch1及Hes1 的甲基化率，降低海馬Ngn2 的甲基化率，從而降低海馬Notch1 及Hes1 的表達，以及提高海馬Ngn2的表達。