吳光燕，陸海燕，楊 娟，王梓喬，王 鵬，鞠耿越

（南京市江北新區(qū)農村工作管理服務中心，江蘇南京 211899）

0 引言

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是一種常見的人畜共患病原菌[1]，致病性大腸桿菌依據(jù)感染致病類型大致可分為5種，包括腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、產腸毒性大腸桿菌（ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）和腸聚集性大腸桿菌（EAggEC）。其中，某些血清型的大腸桿菌具有致病性，可導致仔豬黃痢、白痢和豬水腫等病[2]，較容易與沙門氏菌等交叉感染，嚴重時可導致仔豬死亡。通常通過PCR檢測大腸桿菌各致病型特有的毒力因子，以確定致病性大腸桿菌分離株為何種致病類型，主要PCR檢測基因包括大腸桿菌腸毒素、黏菌素菌毛和LEE毒力島攜帶的毒力基因[3]。

2021年12月16日，南京某規(guī)模化豬場發(fā)生了仔豬腹瀉感染，筆者對該豬場仔豬腹瀉發(fā)病情況進行診治，診斷發(fā)現(xiàn)患病仔豬呈現(xiàn)的典型癥狀為腹瀉、拉稀、食欲不振、精神狀態(tài)萎靡等。針對上述情況，該豬場采集相關病料，對送檢的病料進行細菌通過鑒別培養(yǎng)基進行分離鑒定，對分離的細菌通過PCR擴增其16SrDNA序列，進行測序鑒定，并對其耐藥譜進行鑒定，相關研究旨在為該養(yǎng)豬場防治細菌性仔豬腹瀉提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集。無菌采集來自南京市某規(guī)?；B(yǎng)豬場死亡仔豬的組織病料，包括小腸段、大腸內容物、肝臟等。

1.1.2 主要試驗材料。氯化鈉、酵母粉、麥康凱平板、伊紅美藍瓊脂平板和LB瓊脂。PCR Mix和核酸電泳Marker購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司，MHB等瓊脂平板購自南京鼎思生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離。取病死仔豬的小腸、大腸內容物，以及腸段和肝臟組織，用接種環(huán)挑取內容物或組織接種于麥康凱瓊脂平板。將接種后的瓊脂平板放置于37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜，第二天，觀察麥康凱瓊脂平板上細菌菌落，再用接種環(huán)無菌挑取形態(tài)特征明顯的細菌單菌落，接種至伊紅美藍培養(yǎng)基。將細菌劃線傳代培養(yǎng)后，然后通過革蘭氏染色對挑取的單菌落進行鑒定，將染色后的細菌于顯微鏡下進行觀察。

1.2.2 細菌形態(tài)學鑒定。對菌株進行分離培養(yǎng)，并對培養(yǎng)基中菌株生長情況進行觀察，同時進行涂片以及染色鏡檢。

1.2.3 藥敏試驗。采用K-B紙片擴散法鑒定致病相關細菌分離株的藥敏譜，將培養(yǎng)過夜的分離株菌液（100μl）均勻涂布于MHB瓊脂平板，逐一貼上藥敏片，培養(yǎng)16 h后分別檢測細菌對阿莫西林、環(huán)丙沙星、卡那霉素、阿莫西林克拉維酸鉀、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、復方新諾明、青霉素、頭孢拉定、頭孢噻呋、鏈霉素、阿米卡星和多黏菌素B等14種抗生素的耐藥性。

1.2.4 細菌16 S r D N A 鑒定。參考文獻報道的細菌16 S r D N A 基因擴增引物序列[5]，合成細菌16 S 擴增基因，P C R 通用引物序列如下：16 S-F（A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G）和16 S-R（TACGGCTACCTTGTTACGACTT）。參照文獻設定16S擴增的PCR程序：設置35個循環(huán)，首先95℃預變性5 min，接著95℃變性45 s，然后55℃退火45 s，72℃進行DNA延伸90 s，最后72℃延伸10 min[5]。完成RCP擴增后，運用1.5%瓊脂電泳進行核酸電泳，對核酸電泳后16S的DNA片段進行回收，最后將該PCR擴增產物送至公司進行測序，將16S測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已知細菌16S rDNA序列進行比對分析。

2 結果

2.1 細菌分離及形態(tài)學觀察

將病死仔豬的器官組織或腸內容物劃線接種到麥康凱培養(yǎng)基上進行分離，對單菌落進一步進行平板劃線培養(yǎng)，接種伊紅美藍培養(yǎng)基，從而純化細菌分離純化的細菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出邊緣整齊的紅色菌落，在伊紅美藍培養(yǎng)基上呈現(xiàn)金屬光澤的黑色菌落，依據(jù)菌落形態(tài)初步判斷分離的細菌為大腸桿菌。

圖1 分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上菌落形態(tài)（A）和伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落形態(tài)（B）

2.2 菌液PCR鑒定結果

挑取伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上的疑似大腸桿菌的單菌落進行搖菌培養(yǎng)，將菌液進行16S rDNA的PCR擴增，將PCR擴增產物進行凝膠電泳（圖2），對凝膠顯色發(fā)現(xiàn)在1500 bp附近有一條明顯DNA帶，其大小符合PCR擴增預期。對PCR擴增產物進行回收，測序結果與已知細菌16S序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該菌株的16S序列與大腸桿菌16S高度相似，確定該分離菌株為大腸桿菌。

圖2 大腸桿菌16S rDNA基因PCR產物電泳結果

2.3 大腸桿菌的藥敏譜

K-B紙片擴散法鑒定大腸桿菌分離株的藥敏情況，藥敏結果顯示該菌對10種抗生素（阿莫西林、環(huán)丙沙星、卡那霉素、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、復方新諾明、青霉素、頭孢拉定、鏈霉素）具有明顯耐藥性，說明該大腸桿菌分離株具有多重耐藥性。

3 結論

綜上所述，本研究通過采集本地區(qū)豬場病死仔豬的器官，對病原的分離、藥敏試驗、和耐藥性進行鑒定，并用PCR擴增16S rDNA，來確定該病原及其特性，為該豬場免疫防控提供基礎依據(jù)。大腸桿菌是一種常見病原菌，對家畜、家禽等動物高度易感。本文對病死仔豬的器官進行病原菌分離操作，在麥康凱培養(yǎng)基上獲得典型的圓形、邊緣光滑、中央隆起、紅色菌落，革蘭氏染色結果顯示該菌為革蘭氏陰性菌。結合病死豬腹瀉等癥狀，初步判斷其病原為大腸桿菌。進一步采用細菌16S rDNA通用引物對致病菌分離菌株進行PCR擴增，測序結果與已知細菌16S基因序列進行同源性比較分析，與大腸桿菌同源性高于99%。

大腸桿菌發(fā)生的原因很多，也很復雜，廣泛分布于自然界的各種土壤與水體中。該菌能引起多種動物食欲不振、排水樣糞便、腹痛，尤其在冬春交替、梅雨季節(jié)時多發(fā)。目前，致瀉性大腸桿菌對仔豬的感染發(fā)病具有散發(fā)和地方性流行的特點，對患有腹瀉的仔豬進行診斷時通常采用實驗室分子診斷方法，如16S rDNA的PCR測序比對，能夠準確鑒定引起仔豬腹瀉的病原菌類型，分子診斷方法有助于病原菌致病類型的理解和認識。

本文通過分離鑒定引起仔豬腹瀉的大腸桿菌，為仔豬致瀉疾病的防控及大腸桿菌的有效檢驗診斷提供了一定的參考，對大腸桿菌分離株的耐藥譜鑒定和豬場仔豬腹瀉的藥物治療防控有一定的指導意義，并為后續(xù)臨床發(fā)病仔豬治療提供參考依據(jù)。