王楷，黃思輝，吳騰飛，邱振雄（通信作者）

深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院·廣東醫(yī)科大學(xué)附屬寶安中心醫(yī)院普外科 （廣東深圳 518000）

結(jié)腸癌是全球第三大常見癌癥，也是癌癥疾病中致死率排名第二的癌癥[1]。迄今為止，化療仍是治療結(jié)腸癌的主要手段，除此之外，缺乏更有效、更安全的治療方法，因此，亟需探索結(jié)腸癌治療的新方式[2-4]。飲食影響著人類健康的各個(gè)方面，有證據(jù)表明，飲食可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生表觀遺傳變化，從而改變某些調(diào)控細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的基因的表達(dá)水平，多項(xiàng)研究表明，飲食與多種癌癥（如胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等）存在著密切聯(lián)系[5-6]。通過低碳水化合物、平均蛋白質(zhì)和高脂肪飲食抑制腫瘤生長(zhǎng)的飲食方式被稱為生酮飲食（ketogenic diet，KD）。以往對(duì)KD 的研究主要集中于癲癇的治療方面[7-10]。近年來，KD 逐漸被用于腫瘤的治療，如胃癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，且治療過程中未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)[11-13]。本課題前期研究也發(fā)現(xiàn)KD 會(huì)抑制裸鼠結(jié)腸癌移植瘤的生長(zhǎng)，但具體的作用機(jī)制尚不明確，因此本研究將探討KD 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠（許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），10只，雄性，8周齡；飼養(yǎng)于溫度20～26℃，濕度 40%～70%的SPF 級(jí)環(huán)境中，自由飲食攝水。

1.2 主要試劑及儀器

生酮飼料，購(gòu)于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司；HCT116細(xì)胞，購(gòu)于北納生物技術(shù)有限公司；完全DMEM 培養(yǎng)基，購(gòu)于南京凱基生物技術(shù)有限公司；TUNEL 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；β-catenin，購(gòu)于abcam 公司；Wnt1，購(gòu)于affinity 公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L），購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB 顯色試劑盒、中性樹脂，購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit），購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 皮下注射及生酮飲食

本研究將裸鼠分為對(duì)照組和KD 組，每組5只，對(duì)裸鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將濃度為5×106個(gè)/ml的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116皮下注射到裸鼠體內(nèi)成瘤（0.1 ml/只，于成瘤5 mm 時(shí)開始生酮喂養(yǎng)）。成瘤前兩組裸鼠均自由進(jìn)食，之后成瘤對(duì)照組裸鼠自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，KD 組裸鼠于成瘤5 mm 時(shí)給予相等能量的生酮飼料，飼喂30 d 后處死裸鼠。

1.4 HE 染色

參照胡清泉等[14]的方法，腫瘤組織石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，用蘇木素染液染色3-5 min，流水沖洗后，用1%鹽酸酒精分化，反藍(lán)液反藍(lán)，伊紅染色3-5 min 后，切片脫水，封片，在顯微鏡（BX43，Olympus）下觀察。

1.5 TUNEL 染色

參照劉艷龍和徐國(guó)海[15]的方法，將組織切片放入二甲苯進(jìn)行脫蠟，接著加入梯度乙醇水化，加入抗原抗體修復(fù)后，滴加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）檢測(cè)液，孵育2 h 后，洗滌，封片鏡檢。

1.6 免疫組化

參照胡清泉等[14]的方法，將組織切片進(jìn)行脫蠟、水化和抗原修復(fù)后，利用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）進(jìn)行封閉，然后進(jìn)行一抗β-catenin（1‥200）和Wnt1（1‥300）、二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）孵育，DAB 顯色試劑盒顯色5～10 min，再用中性樹脂封片和鏡檢。

1.7 Western Blot 免疫印跡法檢測(cè)

取兩組瘤體組織經(jīng)液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，將組織勻漿吸入一EP 管中，冰上裂解30 min 收獲上清液；采用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，參照魏利超和吳旻[16]的方法檢測(cè)瘤體組織中活化的半胱氨酸蛋白酶3和9（Cleavedcaspase 3/9）、生存素（Survivin）、無翅和整合素1（Wnt1）和β-聯(lián)蛋白（β-catenin）表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較經(jīng)單因素分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KD 對(duì)裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤病理學(xué)的影響

對(duì)照組呈實(shí)體狀排列，部分癌細(xì)胞成腺管樣分布，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；KD 組結(jié)腸癌的病理特征改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見圖1。

圖1 HE染色觀察裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤的病理學(xué)變化（×200）

2.2 KD 對(duì)裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示可以看出，對(duì)照組凋亡細(xì)胞占比5%左右，KD 組凋亡細(xì)胞占比25%左右，且與對(duì)照組相比，KD 組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 TUNEL 染色檢測(cè)KD 對(duì)裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤細(xì)胞凋亡的影響

2.3 KD 對(duì)裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤中Wnt1和β-catenin 表達(dá)的影響

如圖3 所示可以看出，Wnt1、β-catenin 在瘤體組織中陽(yáng)性表達(dá)。且在對(duì)照組中，Wnt1、β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)率均為60%左右，而在KD 組中，Wnt1、β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)率分別在25%、30%左右，與對(duì)照組相比，KD 組Wnt1 和β-catenin 表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 免疫組化檢測(cè)KD 對(duì)裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤中Wnt1和β-catenin 表達(dá)的影響

2.4 KD 對(duì)裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤中Cleaved-caspase 3/9、Wnt1和β-catenin 表達(dá)的影響

由Western Blot 檢測(cè)腫瘤組織中Cleaved-caspase 3/9、Wnt1和β-catenin 的表達(dá)情況可以看出，與對(duì)照組相比，KD 組中Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9表達(dá)顯著升高，Survivin 表達(dá)顯著下降，且差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步探究Wnt1/β-catenin 信號(hào)通路是否參與這一過程，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，KD 組Wnt1和β-catenin 表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

圖4 Western Blot 免疫印跡法檢測(cè)KD 對(duì)裸鼠結(jié)腸癌皮下成瘤中Cleaved-caspase 3/9、Wnt1和β-catenin 表達(dá)的影響

3 討論

“Warburg 效應(yīng)”是腫瘤細(xì)胞在有氧的情況下通過一系列分子機(jī)制來削弱有氧呼吸，進(jìn)行高效糖酵解反應(yīng)，進(jìn)而獲得大量三磷酸腺苷（ATP），以及制造適合腫瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞具有增殖優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體血糖與腫瘤生長(zhǎng)速度相關(guān)，血糖濃度與腫瘤生長(zhǎng)呈正相關(guān)，血糖濃度下降后可使腫瘤體積減小且生長(zhǎng)速率降低[17]，因此可通過減少碳水化合物的攝入、切斷腫瘤的能量供應(yīng)來破壞腫瘤微環(huán)境，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。研究發(fā)現(xiàn)，KD 可調(diào)節(jié)患者代謝，明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高患者生命質(zhì)量，增強(qiáng)患者化療敏感性[18]，因此，目前KD 已在多種動(dòng)物腫瘤模型及臨床病例的治療及輔助治療中被廣泛使用[19-21]?；谝陨涎芯?，本研究認(rèn)為KD 飲食對(duì)結(jié)腸癌增殖的抑制及潛在機(jī)制值得進(jìn)一步探索。

本研究通過皮下注射HCT116細(xì)胞建立結(jié)腸癌模型，并于成瘤后調(diào)整飲食，即分別給予正常飲食和生酮飲食，通過HE 染色檢測(cè)對(duì)照組及KD 組瘤體的病理變化，結(jié)果顯示，對(duì)照組呈實(shí)體狀排列，部分癌細(xì)胞成腺管樣分布，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；KD組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病理特征有所改善。進(jìn)一步行TUNEL 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，KD 可促進(jìn)瘤體凋亡。由此說明，KD 干預(yù)可延緩結(jié)腸癌細(xì)胞皮下移植瘤瘤體的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)瘤體凋亡，改善瘤體病理變化。

Wnt/β-catenin 是經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路，在多種疾病中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)Wnt /β-catenin 在腫瘤中過度激活，抑制 Wnt /β-catenin 可阻礙腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，對(duì)干細(xì)胞更新、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化都至關(guān)重要[22]。另有研究表明，Wnt/β-catenin 信號(hào)參與結(jié)直腸癌的進(jìn)展，激活Wnt/β-catenin 信號(hào)可促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[23]。細(xì)胞質(zhì)后期分裂復(fù)合體（anaphase-promoting complex，APC）/軸蛋白破壞復(fù)合物（destruction complex，DC）在保持β-catenin 的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。APC 蛋白包含3 個(gè)Axin 結(jié)合基序，這些基序散布在一系列與β-catenin 結(jié)合的15 和20 氨基酸重復(fù)序列之間。在結(jié)直腸癌中，APC 對(duì)DC 的功能至關(guān)重要；APC缺乏可導(dǎo)致β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)中聚集并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，激活原癌基因蛋白（transcriptional regulator Myc-like，c-Myc）、細(xì)胞周期素D1（Cyclin D1）和基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metallopeptidase 7，MMP7）等靶基因，這些基因與癌細(xì)胞的周期、增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌的發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞內(nèi)β-catenin 的積累水平失控有關(guān)[20-21，24]。此外，腸道的形成過程需要Wnt 信號(hào)通路的激活，但該通路過度激活后會(huì)導(dǎo)致腸道病變，約有90%的結(jié)腸癌患者存在Wnt 信號(hào)通路異常激活[25-28]。因此，KD 對(duì)結(jié)腸癌的抑制作用可能是通過Wnt 通路發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，KD 可顯著降低瘤體中Wnt1、β-catenin 陽(yáng)性表達(dá)率，Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，KD 可顯著下調(diào)Wnt1、β-catenin 表達(dá)，且Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)，KD 可顯著下調(diào)Survivin 表 達(dá)，上 調(diào)Cleaved-caspase 3/9 表 達(dá)。Survivin 不僅是Wnt1/β-catenin 通路靶基因，還是目前已知最強(qiáng)的凋亡抑制因子，可顯著抑制caspase 3的凋亡誘導(dǎo)作用。因此，調(diào)控上述蛋白的表達(dá)，將明顯影響腫瘤細(xì)胞的存活。本研究結(jié)果恰好證實(shí)了KD可調(diào)控Survivin、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9 表達(dá)，繼而促進(jìn)結(jié)腸癌瘤體的凋亡。

綜上所述，KD 可有效促進(jìn)裸鼠人結(jié)腸癌皮下瘤細(xì)胞的凋亡，與下調(diào)Survivin 表達(dá)和上調(diào)Cleaved-caspase 3/9表達(dá)有關(guān)，此過程可能是通過阻斷Wnt1/β-catenin 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，但需要結(jié)合Wnt1/β-catenin 通路抑制劑或相關(guān)成分抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。