盧亮，劉勇，東淳，李陽梅，馮霞，陳若曦，趙一丁

1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽712046；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003

瘙癢是一種可引發(fā)搔抓意愿和搔抓反射的特異性皮膚感覺，可由多種皮膚疾病和系統(tǒng)性疾病引起[1]，其中超過6周的瘙癢稱為慢性瘙癢。目前國內(nèi)外對癢覺的研究雖確定了相關(guān)受體和信號通路，但對癢覺信號的產(chǎn)生、傳導及調(diào)控的機制仍不清晰。有研究顯示，皮膚病患者瘙癢患病率為54.4%[2]。其發(fā)病機制不清，治療手段有限，長期慢性瘙癢嚴重影響患者生活質(zhì)量，甚至造成焦慮、抑郁、失眠等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]。

中醫(yī)治療慢性瘙癢具有獨特優(yōu)勢。既往研究表明，中藥內(nèi)服、外用及非藥物療法可通過抑制神經(jīng)活性物質(zhì)釋放，調(diào)節(jié)信號傳導通路及相關(guān)受體活性改善慢性瘙癢[4]。鎮(zhèn)心安神方是以《素問·至真要大論篇》“諸痛癢瘡，皆屬于心”為理論指導形成的治療方劑，由龍骨、煅牡蠣、骨碎補、茯苓、淡竹葉組成，具有重鎮(zhèn)安神、平肝潛陽、健脾補腎作用。課題組前期應(yīng)用本方治療慢性瘙癢性皮膚病取得可靠的臨床療效[5]，并通過實驗初步表明本方對慢性皮炎模型動物搔抓行為具有抑制作用[6]。本研究通過體外實驗，觀察鎮(zhèn)心安神方含藥血清對辣椒素誘導的小鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）細胞瞬時受體電位（TRP）通道蛋白TRPA1、TRPV1、TRPM8及自噬蛋白LC3表達的影響，為鎮(zhèn)心安神方治療慢性瘙癢性皮膚病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

6～8周齡雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量180～200 g，1～3日齡C57BL/6小鼠150只，購自湖北省實驗動物研究中心，動物許可證號SCXK（鄂）2015-0018。飼養(yǎng)于西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，溫度18～24℃，濕度50%～70%，12 h光照/黑暗循環(huán)，自由飲水進食。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d開始灌胃，新生小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)24 h分離原代DRG細胞。

1.2 藥物、試劑與儀器

鎮(zhèn)心安神方（龍骨30 g，煅牡蠣30 g，骨碎補10 g，茯苓20 g，淡竹葉30 g），免煎顆粒購自廣東一方制藥有限公司，將免煎顆粒以蒸餾水充分溶解，配制成原藥材濃度為1 g/mL混懸液，置于4℃保存?zhèn)溆?。辣椒素，上海阿拉丁生化科技有限公司，貨號C107193；辣椒平，美國Cayman公司，貨號10007518；TRPA1抗體，以色列Alomone Labs，貨號ACC-037-25；TRPV1抗體、TRPM8抗體，美國Gene Tex公司，貨號分別為GTX54762、GTX54886；LC3抗體，美國Affinity公司，貨號AF5402；Cy3標記羊抗小鼠IgG，武漢博士德公司，貨號BA1031；β-tubulin，美國CST公司，貨號4466；神經(jīng)元無血清培養(yǎng)基，武漢普諾賽公司，貨號CM-M166。XTL型體視顯微鏡（鳳凰光學集團），F(xiàn)V3000型激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司），MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），ECLIPSE Ts2型倒置顯微鏡（日本Nikon公司），5702R型低速離心機（德國Eppendorf公司），F(xiàn)lexstation?3型酶 標儀（美國MD公司），DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀、DYCZ-24DN型垂直電泳槽（北京六一儀器廠），JY300型水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.3 含藥血清制備

12只大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組和鎮(zhèn)心安神方組，每組6只。給藥劑量根據(jù)人與大鼠體表面積折算[7]，空白組予蒸餾水10 mL/（kg·d）灌胃，鎮(zhèn)心安神方組予鎮(zhèn)心安神方混懸液6.3 g/（g·d）灌胃，2次/d，連續(xù)7 d。末次給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥1 h后0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血，常溫靜置2 h以上，4℃、3 000 r/min離心15 min，血清56℃水浴30 min滅活，0.22μm濾膜過濾，即得空白血清和鎮(zhèn)心安神方含藥血清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞分離及培養(yǎng)

75%乙醇消毒小鼠全身，超凈臺內(nèi)斷頭處死，剪開背部皮膚，打開脊髓腔，用顯微鑷取出雙側(cè)DRG，置預冷DMEM培養(yǎng)基中，加入Ⅰ型膠原酶（3 mg/mL）2 mL，37℃消化30 min，吸去液體，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化15 min，待細胞脫壁后加入完全培養(yǎng)基（90%DMEM+10%胎牛血清）終止消化，將細胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用神經(jīng)元無血清培養(yǎng)基重懸細胞，接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日向培養(yǎng)基內(nèi)加入阿糖胞苷（5μmol/L）抑制非神經(jīng)細胞生長，48 h后更換正常神經(jīng)元專用培養(yǎng)基。

1.5 免疫熒光鑒定背根神經(jīng)節(jié)細胞

在培養(yǎng)皿中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次，0.5%Triton X-100室溫透明20 min；PBS浸洗3次，吸水紙吸干PBS，滴加山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸去封閉液，加β-tubulin一抗（1∶100），4℃濕盒孵育過夜；加Cy3標記羊抗小鼠IgG（1∶50），37℃濕盒孵育1 h，PBST浸洗3次，滴加DAPI，避光孵育5 min，對標本進行核染，PBST洗去多余DAPI，吸水紙吸干液體，封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 造模、分組及干預

將原代DRG細胞以1×104個/孔接種至6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細胞分為對照組、模型組、鎮(zhèn)心安神方含藥血清組和辣椒平組，每組3個復孔。對照組、模型組和辣椒平組用20%空白血清預處理4 h，辣椒平組同時加入終濃度為1μmol/L的辣椒平，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組用10%鎮(zhèn)心安神方含藥血清和10%空白血清預處理4 h，然后模型組、鎮(zhèn)心安神方含藥血清組和辣椒平組加入1μmol/L辣椒素，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h建立瘙癢模型[8]。

1.7 Western blot檢測

收集各組細胞，加入裂解液裂解，提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，依次加樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉，滴加TRPV1抗體（1∶200）、TRPA1抗體（1∶500）、TRPM8抗體（1∶500）、LC3抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次5 min；滴加HRP標記二抗（1∶50 000），37℃搖床孵育2 h；TBST洗膜，ECL發(fā)光液曝光，顯影液顯影，采用Bandscan 5.0軟件計算蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SAS6.12軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊用方差分析，方差不齊用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 背根神經(jīng)節(jié)細胞鑒定

接種的細胞大部分在4～6 h開始貼壁，呈圓形或橢圓形，胞體周圍出現(xiàn)一圈光暈。接種后24 h，大部分貼壁細胞長出突起，多數(shù)細胞為具有多個突起的多極神經(jīng)元，少數(shù)為雙極和假單極神經(jīng)元，隨著培養(yǎng)時間延長，神經(jīng)元突起的主干和分支明顯延長并增粗，神經(jīng)細胞呈圓形或橢圓形，胞體較大，折光性好，光暈強，交織成密集的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，突起細長，見圖1。DRG細胞幾乎不增殖，免疫熒光染色結(jié)果顯示，DRG神經(jīng)元胞體及突起表現(xiàn)為β-tubulin染色陽性，呈紅色熒光，細胞核表現(xiàn)為DAPI染色陽性，呈藍色熒光，見圖2。

圖1 DRG細胞形態(tài)

圖2 DRG細胞鑒定（免疫熒光染色，×400）

2.2 鎮(zhèn)心安神方含藥血清對細胞瞬時受體電位通道蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組細胞TRPV1、TRPA1蛋白表達降低，辣椒平組細胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與辣椒平組比較，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組細胞TRPA1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），TRPV1、TRPM8蛋白差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖3、表1。

表1 各組細胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達比較（±s）

表1 各組細胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與辣椒平組比較，△P＜0.05

組別對照組模型組鎮(zhèn)心安神方含藥血清組辣椒平組n 3 3 3 3 TRPV1 0.167±0.013 0.674±0.096*0.461±0.068#0.408±0.058#TRPA1 0.165±0.030 0.570±0.083**0.411±0.021#△0.317±0.051#TRPM8 0.160±0.017 0.545±0.095**0.386±0.030 0.293±0.062#

圖3 各組細胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白免疫印跡

2.3 鎮(zhèn)心安神方含藥血清對細胞LC3蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組和辣椒平組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與辣椒平組比較，鎮(zhèn)心安神方含藥血清組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P＜0.05）。見圖4、表2。

圖4 各組細胞LC3蛋白免疫印跡

表2 各組細胞LC3蛋白表達比較（±s）

表2 各組細胞LC3蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與辣椒平組比較，△P＜0.05

組別對照組模型組鎮(zhèn)心安神方含藥血清組辣椒平組n 3 3 3 3 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.178±0.026 0.776±0.102**0.551±0.061#△0.341±0.083##

3 討論

瘙癢發(fā)作依賴于皮膚組織中細胞與神經(jīng)纖維相互作用，這一過程涉及眾多細胞、介質(zhì)、受體及通路，常表現(xiàn)為癢覺敏感、癢覺異常及自發(fā)性瘙癢，其核心機制為癢覺神經(jīng)通路敏化和調(diào)節(jié)功能失調(diào)[9]。TRP通道是存在于細胞膜或胞內(nèi)細胞器膜上的一類非選擇性陽離子通道蛋白，對Ca2+具有高通透性，易被生理性或亞生理性刺激（如溫度變化、化學及機械壓力）激活，導致Ca2+內(nèi)流增加，細胞膜去極化，神經(jīng)元活化閾值降低，是發(fā)生癢覺神經(jīng)敏化的重要基礎(chǔ)[10]。在慢性瘙癢性皮膚病患者中，普遍存在神經(jīng)生長因子、內(nèi)皮素1、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素等瘙癢介質(zhì)釋放增加[11]，這些介質(zhì)可促進末梢神經(jīng)生長和數(shù)量增加，上調(diào)神經(jīng)肽類遞質(zhì)表達，激活TRP家族成員TRPV1和TRPA1[12]，通過組胺依賴性神經(jīng)通路和組胺非依賴性神經(jīng)通路傳遞瘙癢信號。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)游離Ca濃度對自噬和誘導自噬有重要調(diào)節(jié)作用[13]，但Ca2+對自噬的調(diào)控機制尚存在爭議。有研究顯示，Ca2+對自噬有抑制作用[14]。也有文獻報道Ca2+對自噬過程有促進作用[15]。TRP通道是重要的Ca2+調(diào)控通道，對細胞內(nèi)Ca2+濃度變化有“門控”作用。有研究表明，TRP通道可作為細胞自噬的調(diào)節(jié)器[16]，TRPV1通過AMPK信號通路抑制自噬，減輕心肌細胞缺氧損傷[17]，辣椒素能增加自噬標志物LC3Ⅱ和Atg5表達，進而誘導自噬[18]。TRPM型相關(guān)蛋白可通過增加細胞內(nèi)游離Ca2+濃度，激活自噬并促進細胞生長[13]。

《素問·至真要大論篇》有“諸痛癢瘡，皆屬于心”，王冰注曰：“心寂則痛癢微，心燥則痛癢甚，百端之起，皆自心生，痛癢瘡瘍生于心也?！薄鹅`樞·邪客》亦有“心者，五臟六腑之大主也，精神之所舍也”，指出皮膚疾病與心神的關(guān)系。鎮(zhèn)心安神方臨床用于特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹等瘙癢性皮膚病治療，選用具有鎮(zhèn)心安神、清心除煩、健脾補腎作用的藥物，損有余，補不足，從整體上改善患者瘙癢和睡眠，打破瘙癢-搔抓惡性循環(huán)，提高患者生活質(zhì)量。方中重用龍骨、煅牡蠣，龍骨主要成分為碳酸鈣、磷酸鈣[19]，煅牡蠣主要成分為碳酸鈣、微量元素和氨基酸[20]，骨碎補主要成分骨碎補總黃酮可調(diào)節(jié)體內(nèi)Ca2+水平[21]，推測以上藥物配伍對體內(nèi)Ca2+代謝和功能具有調(diào)控作用。

綜上，本研究結(jié)果表明，鎮(zhèn)心安神方對辣椒素誘導的DRG細胞TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表達具有抑制作用，可能通過對細胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)，下調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3表達，從而保護神經(jīng)細胞，降低其興奮性，阻斷癢覺信號傳導。