匡泓俊，楊臘媛，袁楠，袁楊陽，楊鈺濤，鐘峰

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

慢性便秘是以長期持續(xù)性排便困難為主要特征的腸道疾病，嚴重損害患者生活質(zhì)量。隨著生活習(xí)慣改變與社會結(jié)構(gòu)老齡化，慢性便秘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，我國60歲以上人群患病率達22%[1]。便秘是結(jié)直腸腫瘤、結(jié)腸黑變病、痔瘡、肛門脫垂等各類結(jié)直腸病變的重要危險因素[2]。慢傳輸型便秘（STC）是慢性便秘的主要類型，主要病理機制是腸道傳輸延遲，且不伴有腸直徑改變、巨結(jié)腸、神經(jīng)節(jié)細胞增生[3]。因此增強腸道傳輸功能是治療STC的核心。外泌體是一種細胞外囊泡，可運輸非編碼RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，是細胞間物質(zhì)傳遞、信息交換的載體[4]。現(xiàn)代研究表明，外泌體與便秘密切相關(guān)[5]。瞬時受體電位M7（TRPM7）是一種廣泛存在于腦、腸、腎、心等器官的雙功能膜蛋白，可轉(zhuǎn)運鎂離子、鋅離子等二價陽離子和調(diào)控蛋白激酶活性[6]。腸道傳輸依靠胃腸道慢波，Cajal間質(zhì)細胞（ICC）能產(chǎn)生慢波，是胃腸動力的起搏細胞[7]。TRPM7是ICC表面的通道蛋白之一，參與胃腸道慢波產(chǎn)生，TRPM7表達與胃腸運動關(guān)系密切[8]。PI3K/Akt信號通路是TRPM7的下游通路之一，TRPM7可通過激活PI3K/Akt信號通路調(diào)控細胞增殖、自噬過程，對STC有重要作用[9]。

大腸俞募穴是治療腸病的經(jīng)典選穴。研究表明，電針大腸俞募穴通過恢復(fù)結(jié)腸ICC結(jié)構(gòu)，增加ICC數(shù)量，促進腸動力[10]。且電針可調(diào)控外泌體水平[11]。但電針能否通過調(diào)節(jié)外泌體釋放治療STC及具體機制目前尚不清楚。因此，本研究基于TRPM7-PI3K/Akt信號通路觀察抑制外泌體釋放后電針對STC大鼠的影響，探討其作用機制，為電針治療便秘提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

40只SPF級SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，湖南斯萊克景達有限公司提供，動物許可證號SYXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度（22±2）℃，相對濕度45%～55%，12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準（LL2021091502）。

1.2 藥物

枸櫞酸莫沙必利分散片，5 mg/片，成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司，批號10031。將藥片粉碎，用生理鹽水溶解，配制成0.2 mg/mL枸櫞酸莫沙必利混懸液。鹽酸洛哌丁胺膠囊，2 mg/粒，西安楊森制藥有限公司，批號LFJ8473。將膠囊內(nèi)容物溶于生理鹽水，配制成濃度2 mg/mL鹽酸洛哌丁胺混懸液。外泌體抑制劑GW4869，美國MCE公司，貨號HY-19363。將GW4869溶于DMSO，配制成2.5 mg/mL溶液，使用前用生理鹽水稀釋成濃度為0.25 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒，上海翊圣生物公司，貨號11141ES60；BCA試劑盒，北京Solarbio公司，貨號PC0020；miRNA提取試劑盒，德國Qiagen公司，貨號217004；RIPA裂解液、ECL發(fā)光液、蛋白上樣緩沖液，上海Beyotime公司，貨號分別為P0013B、P0018S-2、P0015L；PVDF膜，美國Millipore公司，貨號IPVH00010；TRPM7抗體，北京Bioss公司，貨號BS-9044R；磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）抗體，江蘇Affinity公司，貨號分別為AF6241、AF6261；GAPDH抗體，美國Proteintech公司，貨號10494-1-AP；DMSO，上海麥克林公司，貨號D6258。華佗牌針灸針（0.25 mm×13 mm）、HANS-200A型電針儀，蘇州醫(yī)療用品有限公司；MA-6000型RT-PCR儀（蘇州Molarray公司），800TS型酶標儀（美國Biotek公司），1645070電泳儀、BE6085電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 分組、造模及干預(yù)

40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、電針組、藥物組和電針+GW4869組，每組10只。除對照組外，其余各組參照文獻[12]予鹽酸洛哌丁胺混懸液灌胃誘導(dǎo)STC大鼠模型，1次/d，連續(xù)7 d，第1日劑量30 mg/kg，其余6 d劑量減半，第7日將大鼠放入代謝籠，收集24 h糞便，若24 h排便量較對照組排便量均值減少則為造模成功。

第8日開始干預(yù)，取穴參照《實驗針灸學(xué)》[13]，電針組、電針+GW4869組大鼠腹部和背部剃毛后，碘伏消毒，固定于自制固定板上，直刺雙側(cè)“天樞”“大腸俞”2 mm，左側(cè)“天樞”“大腸俞”接正極，右側(cè)“天樞”“大腸俞”接負極，電流強度0.5～1 mA，以肢體末端輕微抖動為度，頻率2/15 Hz，時間20 min，每日1次，連續(xù)14 d。電針+GW4869組在電針組基礎(chǔ)上腹腔注射GW4869混懸液1 mg/kg，從電針治療第1日開始，隔日1次，共7次。藥物組予枸櫞酸莫沙必利混懸液2 mg/kg灌胃，每日1次，共14 d。對照組和模型組每日同法固定20 min，不干預(yù)。

1.5 24 h排便量檢測

第7、14、21日，將大鼠放入代謝籠內(nèi)，收集24 h糞便后稱重，評估排便情況。

1.6 血清外泌體提取

第22日3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血，室溫靜置1 h，4℃、3 000×g離心15 min，將血清轉(zhuǎn)移至新的離心管，4℃、2 000×g離心30 min，上清液再次轉(zhuǎn)移至新的離心管，4℃、10 000×g離心45 min。0.45μm濾膜過濾，濾液4℃、100 000×g離心70 min，去除上清液，預(yù)冷PBS重懸沉淀，4℃、100 000×g再次離心70 min，去除上清液，PBS重懸得到外泌體。

1.7 透射電鏡觀察

將提取的血清外泌體樣本和醋酸雙氧鈾滴入銅網(wǎng)，干燥后，用透射電鏡觀察血清外泌體形態(tài)。

1.8 Western blot檢測

取結(jié)腸組織加入適量RIPA裂解液，4℃振蕩裂解20 min，4℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。制備電泳凝膠，蛋白上樣，電泳（80 V、30 min，120 V、30 min），4℃、200 mA轉(zhuǎn)膜90 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入TRPM7、PI3K、Akt、p-Ak一 抗（1∶1 000）和GAPDH一抗（1∶5 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次。加入二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，滴加顯色液，曝光。再次TBST洗膜3次，加入膜再生液，室溫搖床振蕩30 min，洗脫，封閉，曝光。采用Image J軟件測定蛋白灰度值，計算TRPM7、PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達量。

1.9 RT-PCR檢測

取結(jié)腸組織研磨，加入Trizol破碎，加入氯仿振蕩15 s，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上層水相，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進行PCR。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃、10 s，60℃、20 s，72℃、20 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

1.1 0統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布用方差分析，組間比較方差齊用LSD法，方差不齊用T2檢驗，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對模型大鼠24 h排便量的影響

造模結(jié)束（第7日），與對照組比較，模型組、電針組、藥物組和電針+GW4869組大鼠24 h排便量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。第14、21日，與對照組比較，模型組大鼠24 h排便量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，電針組和藥物組大鼠24 h排便量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與電針組比較，電針+GW4869組大鼠24 h排便量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。電針組與藥物組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠第7、14、21日24 h排便量比較（±s，g）

表2 各組大鼠第7、14、21日24 h排便量比較（±s，g）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與電針組比較，&&P＜0.01

組別對照組模型組電針組藥物組電針+GW4869組只數(shù)8 8 8 8 8第7日4.81±0.59 2.07±0.39**2.00±0.39**2.04±0.64**1.96±0.35**第14日6.20±0.95 2.78±0.31**4.31±0.27##4.29±0.54##3.03±0.33&&第21日7.05±0.88 3.44±0.26**6.08±0.81##5.71±0.50##3.76±0.56&&

2.2 血清外泌體提取與鑒定

透射電鏡觀察顯示，模型組和電針組大鼠血清可見外泌體存在，為單層膜結(jié)構(gòu)的杯狀或茶托狀囊泡，符合外泌體形態(tài)特征，見圖1。

圖1 大鼠血清外泌體形態(tài)

2.3 電針對模型大鼠結(jié)腸組織瞬時受體電位M7、磷酸肌醇-3-激酶、蛋白激酶B蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt蛋白表達及p-Akt/Akt比值明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，電針組、藥物組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt蛋白表達及p-Akt/Akt比值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與電針組比較，電針+GW4869組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt蛋白表達及p-Akt/Akt比值明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。電針組與藥物組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt、p-Akt蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt、p-Akt/Akt蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt、p-Akt/Akt蛋白表達比較（±s）

組別對照組模型組電針組藥物組電針+GW4869組只數(shù)4 4 4 4 4 TRPM7 0.90±0.19 0.46±0.09**0.92±0.18##0.97±0.23##0.60±0.12&PI3K 1.09±0.31 0.26±0.08**0.81±0.11##0.84±0.12##0.29±0.16&&Akt 1.03±0.16 0.31±0.11**0.97±0.20##1.09±0.17##0.49±0.15&&p-Akt/Akt 1.04±0.08 0.45±0.07**0.95±0.17##0.89±0.11##0.56±0.05&&

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與電針組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01

2.4 電針對模型大鼠結(jié)腸組織瞬時受體電位M7、磷酸肌醇-3-激酶、蛋白激酶B mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，電針組、藥物組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與電針組比較，電針+GW4869組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達明顯降低（P＜0.01）。電針組與藥物組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達比較（±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與電針組比較，&&P＜0.01

組別對照組模型組電針組藥物組電針+GW4869組只數(shù)4 4 4 4 4 TRPM7 1.03±0.08 0.55±0.16**1.68±0.36##1.38±0.27##0.81±0.06&&PI3K 1.59±0.51 0.71±0.16**1.79±0.55##1.69±0.84##0.95±0.13&&Akt 0.83±0.23 0.43±0.11**1.36±0.46##1.49±0.51##0.55±0.11&&

3 討論

STC屬中醫(yī)學(xué)“便秘”范疇，其本質(zhì)為大腸傳化糟粕失職，病因與氣血、津液關(guān)系密切，受大腸、脾胃、肝、肺等多臟腑影響[14]。誘發(fā)便秘的因素較多，包括情志、飲食、環(huán)境等[15]。俞募配穴屬于前后配穴的典型，天樞為大腸募穴，大腸俞是大腸俞穴。《針灸大成》云：“大腸俞，主脊強不得俯仰……大小便不利。”說明大腸俞有順氣止痛、通降大便功效。《難經(jīng)·六十七難》云：“陰病行陽，陽病行陰，故令募在陰。”說明募穴主治腑病。大腸為腑，屬陰為陰病，故大腸之募穴天樞對腸病有調(diào)控作用。神經(jīng)節(jié)段學(xué)說認為，穴位效應(yīng)與其所屬神經(jīng)節(jié)段支配的內(nèi)臟有關(guān)，天樞、大腸俞與支配大腸的交感神經(jīng)均受同一節(jié)段支配，所以針刺兩穴會作用于相應(yīng)神經(jīng)節(jié)[16]。臨床研究表明，在治療慢性便秘方面，電針優(yōu)于假針刺，具有較好的安全性，持續(xù)效應(yīng)較長[17-18]。電針天樞、大腸俞對腸運動、大便性狀有調(diào)節(jié)作用，治療腸病選取大腸俞募穴有一定優(yōu)勢[19]。

外泌體是運輸核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的載體，參與非編碼RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)運輸，在細胞、器官間通訊中發(fā)揮重要作用[20]。外泌體攜帶通訊信息靶向輸送至靶細胞，從而調(diào)控靶細胞的活動狀態(tài)，如細胞自噬、炎癥、免疫、凋亡、增殖等[21-23]。由于外泌體特殊的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，使其成為闡釋針刺治病機制的特定載體[24]。外泌體對STC有調(diào)控作用，外泌體內(nèi)的miR-128、miR-19a等分別通過靶向調(diào)控炎癥信號、胃動素分泌參與STC發(fā)病過程[5，25-26]。因此，外泌體在針灸治療便秘機制研究中具有較高研究價值。GW4869是非競爭性鞘磷脂酶抑制劑，能抑制外泌體分泌 。通過腹腔注射GW4869可抑制血清循環(huán)的外泌體，此外其本身的藥物作用較弱，無副作用[28]。

STC與ICC數(shù)量減少、形態(tài)異常、功能失職有關(guān)[29]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針大腸俞募穴緩解便秘與恢復(fù)ICC結(jié)構(gòu)有關(guān)[10]。TRPM7是一種廣泛分布的非選擇性陽離子通道，分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、骨骼、腸道、脂肪等處，能介導(dǎo)胃腸道ICC起搏器活性電流傳導(dǎo)[30]。存在于ICC表面的TRPM7參與慢波產(chǎn)生，是ICC起搏電位的潛在發(fā)射器之一[8，31]。采用TRPM7通道抑制劑抑制其活性，ICC起搏活動的電流信號減弱，發(fā)送的起搏電位振幅相應(yīng)減弱，導(dǎo)致胃腸動力障礙[31]。因此，TRPM7被認為是治療胃腸運動障礙的潛在靶點之一[32-33]。PI3K/Akt信號通路參與細胞自噬、凋亡、增殖，有促進神經(jīng)系統(tǒng)再生[34]、抑制氧化應(yīng)激[35]、抑制凋亡[36]等作用，與調(diào)節(jié)ICC自噬和增殖密切相關(guān)[37]。本研究結(jié)果表明，與模型組相比，電針組和藥物組可促進大鼠腸動力恢復(fù)，激活TRPM7離子通道，進而激活PI3K/Akt信號通路。與電針組相比，腹腔注射GW4869能抑制血清外泌體分泌，削弱電針對腸動力的恢復(fù)作用，抑制TRPM7離子通道和PI3K/Akt信號通路激活。結(jié)合已有研究[11，38]穴位注射或腹腔注射GW4869能削弱電針恢復(fù)神經(jīng)功能效應(yīng)，抑制電針鎮(zhèn)痛作用，說明電針可通過調(diào)控外泌體分泌恢復(fù)STC大鼠腸動力。

綜上所述，電針可通過調(diào)節(jié)外泌體釋放作用于TRPM7離子通道，激活PI3K/Akt信號通路，發(fā)揮促進腸動力作用。外泌體作為載體運輸其內(nèi)容物介導(dǎo)針刺效應(yīng)為本課題組今后的研究方向。