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        基于調(diào)控外泌體釋放的電針對慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織TRPM7-PI3K/Akt通路的影響

        2022-12-28 15:25:40匡泓俊楊臘媛袁楠袁楊陽楊鈺濤鐘峰
        中國中醫(yī)藥信息雜志 2022年12期
        關(guān)鍵詞:貨號外泌體大腸

        匡泓俊,楊臘媛,袁楠,袁楊陽,楊鈺濤,鐘峰

        湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007

        慢性便秘是以長期持續(xù)性排便困難為主要特征的腸道疾病,嚴(yán)重?fù)p害患者生活質(zhì)量。隨著生活習(xí)慣改變與社會結(jié)構(gòu)老齡化,慢性便秘的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,我國60歲以上人群患病率達(dá)22%[1]。便秘是結(jié)直腸腫瘤、結(jié)腸黑變病、痔瘡、肛門脫垂等各類結(jié)直腸病變的重要危險因素[2]。慢傳輸型便秘(STC)是慢性便秘的主要類型,主要病理機制是腸道傳輸延遲,且不伴有腸直徑改變、巨結(jié)腸、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞增生[3]。因此增強腸道傳輸功能是治療STC的核心。外泌體是一種細(xì)胞外囊泡,可運輸非編碼RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì),是細(xì)胞間物質(zhì)傳遞、信息交換的載體[4]?,F(xiàn)代研究表明,外泌體與便秘密切相關(guān)[5]。瞬時受體電位M7(TRPM7)是一種廣泛存在于腦、腸、腎、心等器官的雙功能膜蛋白,可轉(zhuǎn)運鎂離子、鋅離子等二價陽離子和調(diào)控蛋白激酶活性[6]。腸道傳輸依靠胃腸道慢波,Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)能產(chǎn)生慢波,是胃腸動力的起搏細(xì)胞[7]。TRPM7是ICC表面的通道蛋白之一,參與胃腸道慢波產(chǎn)生,TRPM7表達(dá)與胃腸運動關(guān)系密切[8]。PI3K/Akt信號通路是TRPM7的下游通路之一,TRPM7可通過激活PI3K/Akt信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖、自噬過程,對STC有重要作用[9]。

        大腸俞募穴是治療腸病的經(jīng)典選穴。研究表明,電針大腸俞募穴通過恢復(fù)結(jié)腸ICC結(jié)構(gòu),增加ICC數(shù)量,促進腸動力[10]。且電針可調(diào)控外泌體水平[11]。但電針能否通過調(diào)節(jié)外泌體釋放治療STC及具體機制目前尚不清楚。因此,本研究基于TRPM7-PI3K/Akt信號通路觀察抑制外泌體釋放后電針對STC大鼠的影響,探討其作用機制,為電針治療便秘提供實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動物

        40只SPF級SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,湖南斯萊克景達(dá)有限公司提供,動物許可證號SYXK(湘)2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,溫度(22±2)℃,相對濕度45%~55%,12 h/12 h明暗交替,自由攝食飲水。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(LL2021091502)。

        1.2 藥物

        枸櫞酸莫沙必利分散片,5 mg/片,成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司,批號10031。將藥片粉碎,用生理鹽水溶解,配制成0.2 mg/mL枸櫞酸莫沙必利混懸液。鹽酸洛哌丁胺膠囊,2 mg/粒,西安楊森制藥有限公司,批號LFJ8473。將膠囊內(nèi)容物溶于生理鹽水,配制成濃度2 mg/mL鹽酸洛哌丁胺混懸液。外泌體抑制劑GW4869,美國MCE公司,貨號HY-19363。將GW4869溶于DMSO,配制成2.5 mg/mL溶液,使用前用生理鹽水稀釋成濃度為0.25 mg/mL混懸液。

        1.3 主要試劑與儀器

        反轉(zhuǎn)錄試劑盒,上海翊圣生物公司,貨號11141ES60;BCA試劑盒,北京Solarbio公司,貨號PC0020;miRNA提取試劑盒,德國Qiagen公司,貨號217004;RIPA裂解液、ECL發(fā)光液、蛋白上樣緩沖液,上海Beyotime公司,貨號分別為P0013B、P0018S-2、P0015L;PVDF膜,美國Millipore公司,貨號IPVH00010;TRPM7抗體,北京Bioss公司,貨號BS-9044R;磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)抗體,江蘇Affinity公司,貨號分別為AF6241、AF6261;GAPDH抗體,美國Proteintech公司,貨號10494-1-AP;DMSO,上海麥克林公司,貨號D6258。華佗牌針灸針(0.25 mm×13 mm)、HANS-200A型電針儀,蘇州醫(yī)療用品有限公司;MA-6000型RT-PCR儀(蘇州Molarray公司),800TS型酶標(biāo)儀(美國Biotek公司),1645070電泳儀、BE6085電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司)。

        1.4 分組、造模及干預(yù)

        40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為對照組、模型組、電針組、藥物組和電針+GW4869組,每組10只。除對照組外,其余各組參照文獻[12]予鹽酸洛哌丁胺混懸液灌胃誘導(dǎo)STC大鼠模型,1次/d,連續(xù)7 d,第1日劑量30 mg/kg,其余6 d劑量減半,第7日將大鼠放入代謝籠,收集24 h糞便,若24 h排便量較對照組排便量均值減少則為造模成功。

        第8日開始干預(yù),取穴參照《實驗針灸學(xué)》[13],電針組、電針+GW4869組大鼠腹部和背部剃毛后,碘伏消毒,固定于自制固定板上,直刺雙側(cè)“天樞”“大腸俞”2 mm,左側(cè)“天樞”“大腸俞”接正極,右側(cè)“天樞”“大腸俞”接負(fù)極,電流強度0.5~1 mA,以肢體末端輕微抖動為度,頻率2/15 Hz,時間20 min,每日1次,連續(xù)14 d。電針+GW4869組在電針組基礎(chǔ)上腹腔注射GW4869混懸液1 mg/kg,從電針治療第1日開始,隔日1次,共7次。藥物組予枸櫞酸莫沙必利混懸液2 mg/kg灌胃,每日1次,共14 d。對照組和模型組每日同法固定20 min,不干預(yù)。

        1.5 24 h排便量檢測

        第7、14、21日,將大鼠放入代謝籠內(nèi),收集24 h糞便后稱重,評估排便情況。

        1.6 血清外泌體提取

        第22日3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈采血,室溫靜置1 h,4℃、3 000×g離心15 min,將血清轉(zhuǎn)移至新的離心管,4℃、2 000×g離心30 min,上清液再次轉(zhuǎn)移至新的離心管,4℃、10 000×g離心45 min。0.45μm濾膜過濾,濾液4℃、100 000×g離心70 min,去除上清液,預(yù)冷PBS重懸沉淀,4℃、100 000×g再次離心70 min,去除上清液,PBS重懸得到外泌體。

        1.7 透射電鏡觀察

        將提取的血清外泌體樣本和醋酸雙氧鈾滴入銅網(wǎng),干燥后,用透射電鏡觀察血清外泌體形態(tài)。

        1.8 Western blot檢測

        取結(jié)腸組織加入適量RIPA裂解液,4℃振蕩裂解20 min,4℃、12 000 r/min離心20 min,收集上清液,BCA試劑盒檢測蛋白濃度。制備電泳凝膠,蛋白上樣,電泳(80 V、30 min,120 V、30 min),4℃、200 mA轉(zhuǎn)膜90 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,分別加入TRPM7、PI3K、Akt、p-Ak一 抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶5 000),4℃孵育過夜,TBST洗膜3次。加入二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,滴加顯色液,曝光。再次TBST洗膜3次,加入膜再生液,室溫?fù)u床振蕩30 min,洗脫,封閉,曝光。采用Image J軟件測定蛋白灰度值,計算TRPM7、PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)量。

        1.9 RT-PCR檢測

        取結(jié)腸組織研磨,加入Trizol破碎,加入氯仿振蕩15 s,4℃、12 000 r/min離心10 min,取上層水相,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板進行PCR。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃、10 s,60℃、20 s,72℃、20 s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算各基因相對表達(dá)量。

        表1 各基因PCR引物序列

        1.1 0統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示,符合正態(tài)分布用方差分析,組間比較方差齊用LSD法,方差不齊用T2檢驗,不符合正態(tài)分布用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 電針對模型大鼠24 h排便量的影響

        造模結(jié)束(第7日),與對照組比較,模型組、電針組、藥物組和電針+GW4869組大鼠24 h排便量明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。第14、21日,與對照組比較,模型組大鼠24 h排便量明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,電針組和藥物組大鼠24 h排便量明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與電針組比較,電針+GW4869組大鼠24 h排便量明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。電針組與藥物組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

        表2 各組大鼠第7、14、21日24 h排便量比較(±s,g)

        表2 各組大鼠第7、14、21日24 h排便量比較(±s,g)

        注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與電針組比較,&&P<0.01

        組別對照組模型組電針組藥物組電針+GW4869組只數(shù)8 8 8 8 8第7日4.81±0.59 2.07±0.39**2.00±0.39**2.04±0.64**1.96±0.35**第14日6.20±0.95 2.78±0.31**4.31±0.27##4.29±0.54##3.03±0.33&&第21日7.05±0.88 3.44±0.26**6.08±0.81##5.71±0.50##3.76±0.56&&

        2.2 血清外泌體提取與鑒定

        透射電鏡觀察顯示,模型組和電針組大鼠血清可見外泌體存在,為單層膜結(jié)構(gòu)的杯狀或茶托狀囊泡,符合外泌體形態(tài)特征,見圖1。

        圖1 大鼠血清外泌體形態(tài)

        2.3 電針對模型大鼠結(jié)腸組織瞬時受體電位M7、磷酸肌醇-3-激酶、蛋白激酶B蛋白表達(dá)的影響

        與對照組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt比值明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,電針組、藥物組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt比值明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與電針組比較,電針+GW4869組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt比值明顯降低(P<0.05,P<0.01)。電針組與藥物組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表3。

        圖2 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt、p-Akt蛋白免疫印跡

        表3 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)比較(±s)

        表3 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)比較(±s)

        組別對照組模型組電針組藥物組電針+GW4869組只數(shù)4 4 4 4 4 TRPM7 0.90±0.19 0.46±0.09**0.92±0.18##0.97±0.23##0.60±0.12&PI3K 1.09±0.31 0.26±0.08**0.81±0.11##0.84±0.12##0.29±0.16&&Akt 1.03±0.16 0.31±0.11**0.97±0.20##1.09±0.17##0.49±0.15&&p-Akt/Akt 1.04±0.08 0.45±0.07**0.95±0.17##0.89±0.11##0.56±0.05&&

        注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與電針組比較,&P<0.05,&&P<0.01

        2.4 電針對模型大鼠結(jié)腸組織瞬時受體電位M7、磷酸肌醇-3-激酶、蛋白激酶B mRNA表達(dá)的影響

        與對照組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,電針組、藥物組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與電針組比較,電針+GW4869組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。電針組與藥物組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

        表4 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達(dá)比較(±s)

        表4 各組大鼠結(jié)腸組織TRPM7、PI3K、Akt mRNA表達(dá)比較(±s)

        注:與對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與電針組比較,&&P<0.01

        組別對照組模型組電針組藥物組電針+GW4869組只數(shù)4 4 4 4 4 TRPM7 1.03±0.08 0.55±0.16**1.68±0.36##1.38±0.27##0.81±0.06&&PI3K 1.59±0.51 0.71±0.16**1.79±0.55##1.69±0.84##0.95±0.13&&Akt 0.83±0.23 0.43±0.11**1.36±0.46##1.49±0.51##0.55±0.11&&

        3 討論

        STC屬中醫(yī)學(xué)“便秘”范疇,其本質(zhì)為大腸傳化糟粕失職,病因與氣血、津液關(guān)系密切,受大腸、脾胃、肝、肺等多臟腑影響[14]。誘發(fā)便秘的因素較多,包括情志、飲食、環(huán)境等[15]。俞募配穴屬于前后配穴的典型,天樞為大腸募穴,大腸俞是大腸俞穴?!夺樉拇蟪伞吩疲骸按竽c俞,主脊強不得俯仰……大小便不利?!闭f明大腸俞有順氣止痛、通降大便功效?!峨y經(jīng)·六十七難》云:“陰病行陽,陽病行陰,故令募在陰?!闭f明募穴主治腑病。大腸為腑,屬陰為陰病,故大腸之募穴天樞對腸病有調(diào)控作用。神經(jīng)節(jié)段學(xué)說認(rèn)為,穴位效應(yīng)與其所屬神經(jīng)節(jié)段支配的內(nèi)臟有關(guān),天樞、大腸俞與支配大腸的交感神經(jīng)均受同一節(jié)段支配,所以針刺兩穴會作用于相應(yīng)神經(jīng)節(jié)[16]。臨床研究表明,在治療慢性便秘方面,電針優(yōu)于假針刺,具有較好的安全性,持續(xù)效應(yīng)較長[17-18]。電針天樞、大腸俞對腸運動、大便性狀有調(diào)節(jié)作用,治療腸病選取大腸俞募穴有一定優(yōu)勢[19]。

        外泌體是運輸核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的載體,參與非編碼RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)運輸,在細(xì)胞、器官間通訊中發(fā)揮重要作用[20]。外泌體攜帶通訊信息靶向輸送至靶細(xì)胞,從而調(diào)控靶細(xì)胞的活動狀態(tài),如細(xì)胞自噬、炎癥、免疫、凋亡、增殖等[21-23]。由于外泌體特殊的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,使其成為闡釋針刺治病機制的特定載體[24]。外泌體對STC有調(diào)控作用,外泌體內(nèi)的miR-128、miR-19a等分別通過靶向調(diào)控炎癥信號、胃動素分泌參與STC發(fā)病過程[5,25-26]。因此,外泌體在針灸治療便秘機制研究中具有較高研究價值。GW4869是非競爭性鞘磷脂酶抑制劑,能抑制外泌體分泌 。通過腹腔注射GW4869可抑制血清循環(huán)的外泌體,此外其本身的藥物作用較弱,無副作用[28]。

        STC與ICC數(shù)量減少、形態(tài)異常、功能失職有關(guān)[29]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),電針大腸俞募穴緩解便秘與恢復(fù)ICC結(jié)構(gòu)有關(guān)[10]。TRPM7是一種廣泛分布的非選擇性陽離子通道,分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、骨骼、腸道、脂肪等處,能介導(dǎo)胃腸道ICC起搏器活性電流傳導(dǎo)[30]。存在于ICC表面的TRPM7參與慢波產(chǎn)生,是ICC起搏電位的潛在發(fā)射器之一[8,31]。采用TRPM7通道抑制劑抑制其活性,ICC起搏活動的電流信號減弱,發(fā)送的起搏電位振幅相應(yīng)減弱,導(dǎo)致胃腸動力障礙[31]。因此,TRPM7被認(rèn)為是治療胃腸運動障礙的潛在靶點之一[32-33]。PI3K/Akt信號通路參與細(xì)胞自噬、凋亡、增殖,有促進神經(jīng)系統(tǒng)再生[34]、抑制氧化應(yīng)激[35]、抑制凋亡[36]等作用,與調(diào)節(jié)ICC自噬和增殖密切相關(guān)[37]。本研究結(jié)果表明,與模型組相比,電針組和藥物組可促進大鼠腸動力恢復(fù),激活TRPM7離子通道,進而激活PI3K/Akt信號通路。與電針組相比,腹腔注射GW4869能抑制血清外泌體分泌,削弱電針對腸動力的恢復(fù)作用,抑制TRPM7離子通道和PI3K/Akt信號通路激活。結(jié)合已有研究[11,38]穴位注射或腹腔注射GW4869能削弱電針恢復(fù)神經(jīng)功能效應(yīng),抑制電針鎮(zhèn)痛作用,說明電針可通過調(diào)控外泌體分泌恢復(fù)STC大鼠腸動力。

        綜上所述,電針可通過調(diào)節(jié)外泌體釋放作用于TRPM7離子通道,激活PI3K/Akt信號通路,發(fā)揮促進腸動力作用。外泌體作為載體運輸其內(nèi)容物介導(dǎo)針刺效應(yīng)為本課題組今后的研究方向。

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