◎ 李宇棟，李守俊，王浩豪，馬 婷，李亞楠

（晉城市綜合檢驗檢測中心 山西 晉城 048000）

脫氫乙酸鈉是一種食品添加劑，具有抗菌譜廣、相對穩(wěn)定、安全性高等優(yōu)點，在我國被允許在一定范圍內(nèi)使用于黃油、腌漬蔬菜等12 類食品中[1]。楊德中等[2]對2020—2021年市售的18 個類別1 867 份食品中防腐劑使用情況調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，脫氫乙酸檢出率為9.69%。近幾年國家食品安全監(jiān)督抽檢任務(wù)中將食醋中的脫氫乙酸及其鈉鹽（以脫氫乙酸計）作為抽檢對象，而且國家市場監(jiān)管總局于2021年7月要求加強食醋質(zhì)量安全的監(jiān)督管理[3]，因此找出一種能夠準(zhǔn)確測定食醋中脫氫乙酸鈉含量的方法十分必要。

目前，脫氫乙酸多依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）進(jìn)行檢驗，該標(biāo)準(zhǔn)中有氣相色譜法和液相色譜法兩種方法[4]，其中液相色譜法前處理簡便，儀器配置普遍，許多實驗室選擇液相色譜法進(jìn)行樣品中脫氫乙酸的含量測定。然而此國家標(biāo)準(zhǔn)中的試樣制備與提取部分未對食醋的前處理作出明確規(guī)定，若按照復(fù)合調(diào)味料類別進(jìn)行操作，當(dāng)稱樣量接近5 g 時，由于液體樣品體積較大，再加入其他溶液，在調(diào)節(jié)pH 值時會出現(xiàn)體積超過定容體積的情況，導(dǎo)致實驗失敗。同時，本實驗室在按照此國家標(biāo)準(zhǔn)中的液相色譜參考條件上機時，脫氫乙酸經(jīng)常出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，影響定量。王峰[5]采用CAPCELL PAK MG-C18柱超高效液相色譜法對食品中的脫氫乙酸進(jìn)行測定，取得了良好的結(jié)果。于喆源等[6]通過對流動相pH 值、有機相比例、色譜柱填料等儀器條件進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)脫氫乙酸在中性或堿性環(huán)境下，烯醇互變后的-O-結(jié)構(gòu)次級保留是造成峰形不對稱和保留時間漂移的主要原因。因此通過使用封尾工藝色譜柱，采用酸性流動相并調(diào)節(jié)有機相比例能夠獲得理想的保留時間和峰形。目前，未有人對食醋中的脫氫乙酸含量的測定作出具體研究，因此本文通過優(yōu)化試驗條件，提出改進(jìn)方法，旨在找出適合食醋中脫氫乙酸含量測定的檢驗方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀：ThermoFisher U3000，配紫外檢測器；色譜柱：ThermoFisher Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm）；十萬分之一天平：梅特勒XPE205；pH 計：梅特勒FE20；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)，批號：220425，含量99.9%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.029 0 mg·mL-1）

精密稱取51.50 mg 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品至50 mL 量瓶中，用5 mL 氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）溶解并用水定容至50 mL，稀釋至刻度搖勻，濃度為1.029 0 mg·mL-1。4 ℃避光保存，有效期為3 個月。

1.2.2 較高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液

分別精確吸取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.01 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容，配制成濃度為1.03 μg·mL-1、10.29 μg·mL-1、51.45 μg·mL-1、102.90 μg·mL-1和205.79 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。4 ℃保存，有效期為1 個月。

1.2.3 較低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（該標(biāo)準(zhǔn)曲線目的為準(zhǔn)確測定低加標(biāo)水平回收率）

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL，用水定容至10 mL，得濃度為102.9 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。再分別精確吸取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.05 mL、0.10 mL、0.30 mL、0.50 mL 和1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用水稀釋并定容，配制成濃度為0.51 μg·mL-1、1.03 μg·mL-1、3.09 μg·mL-1、5.14 μg·mL-1、8.23 μg·mL-1和10.29 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 色譜條件

1.3.1 通用條件

檢測波長：293 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃。

1.3.2 對比考察條件

第1～2 組：流動相為0.02 mol·L-1乙酸銨+甲醇=90+10，色譜柱分別為C18未封尾色譜柱和C18封尾色譜柱。

第3～5 組：C18封尾色譜柱，流動相為0.02 mol·L-1乙酸銨（分別用乙酸調(diào)節(jié)pH 值為7.0、6.0、5.0）+甲醇=90+10。

第6～8 組：C18封尾色譜柱，流動相為0.02 mol·L-1乙酸銨（用乙酸調(diào)節(jié)pH=5）+甲醇分別為90+10、85+15、75+25。

1.4 樣品處理

1.4.1 第1 組

樣品置于50 mL 離心管中，加入約10 mL 水，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH 值至7.5，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，置于離心管中，4 000 r·min-1離心10 min。取20 mL 上清液用10%的甲酸溶液調(diào)pH 值至5，定容到25 mL，供高效液相色譜測定。

1.4.2 第2 組

樣品依據(jù)第1 組方法定容到25 mL 后。取5 mL過已活化的C18固相萃取柱，用5 mL 水淋洗，2 mL 70%的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液2 mL，渦旋混合，過0.45 μm 有機濾膜，供高效液相色譜測定。

1.5 精密度和準(zhǔn)確度

選用基質(zhì)空白食醋樣品5 g，分別加入0.25 mL、0.50 mL 濃度為102.9 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液、0.25 mL濃度為1.029 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，形成含量為0.005 g·kg-1、0.010 g·kg-1、0.050 g·kg-13 個加標(biāo)水平，按照優(yōu)化后的前處理方法及上機條件進(jìn)行測定，平行處理6 組，考察方法的準(zhǔn)確度、精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱對脫氫乙酸峰形的影響

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）規(guī)定，在檢驗食品中的脫氫乙酸時使用C18反相色譜柱，但在試驗過程中往往會出現(xiàn)拖尾峰。為考察色譜柱對脫氫乙酸峰形的影響，使用第1～2 組色譜條件，上機測定濃度為10.29 μg·mL-1的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，采用C18未封尾色譜柱，峰不對稱度2.08；采用C18封尾色譜柱，不對稱度0.56，未封尾的色譜柱由于其表面未鍵合的硅羥基與脫氫乙酸的C-O-結(jié)構(gòu)發(fā)生次級保留而出現(xiàn)峰形拖尾，而且拖尾因子還會隨著上機濃度的增加而增大。因此，在實驗室對脫氫乙酸進(jìn)行檢驗時，宜采用封尾工藝色譜柱以得到穩(wěn)定的色譜響應(yīng)。

圖1 色譜柱對脫氫乙酸峰形的影響圖

2.2 流動相對脫氫乙酸峰形及保留時間的影響

圖2為采用封尾工藝C18色譜柱，脫氫乙酸上機濃度為50 μg·mL-1時，不同pH 值流動相（第3～5 組色譜條件）對峰形和保留時間的影響。由圖2可知，隨著流動相pH 值變低，峰形的對稱性得到顯著改善，但同時脫氫乙酸的保留時間也逐漸增長。

圖2 流動相pH 值對峰形及保留時間的影響圖

圖3為采用封尾工藝C18柱，流動相中的0.02 mol·L-1乙酸銨溶液用乙酸調(diào)節(jié)pH=5.0，不同比例有機相（第6～8 組）對保留時間的影響，甲醇比例是10%、15%、25%分別對應(yīng)的保留時間為50.730 min、31.155 min、14.530 min。由圖3可知，隨著甲醇有機相比例的升高，保留時間逐漸縮短。因此為了得到良好的峰形并且縮短檢測時間，0.02 mol·L-1乙酸銨（pH=5）+甲酸=25+75 更適合脫氫乙酸的分析。

圖3 不同流動相比例對保留時間的影響圖

2.3 固相萃取對樣品中脫氫乙酸峰形的影響

圖4是同一市售食醋是否通過固相萃取凈化處理的色譜圖。由圖4可知，部分食醋在脫氫乙酸保留時間附近會出現(xiàn)雜質(zhì)峰，若出現(xiàn)雜質(zhì)峰不易分離的情況，可使用固相萃取柱凈化的方式除去雜峰。

圖4 固相萃取凈化對色譜峰的影響圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性、精密度、準(zhǔn)確度和方法檢出限、方法定量限

經(jīng)過上述實驗，確定高效液相色譜法測定食醋中脫氫乙酸含量的最佳色譜條件為0.02 mol·L-1乙酸銨（乙酸調(diào)節(jié)pH=5.0）+甲醇=75+25 為流動相，使用封尾工藝的C18色譜柱，在293 nm 下對經(jīng)過C18固相萃取小柱凈化處理后的樣品上機測定。

使用1.2 配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，采用上述色譜條件，以濃度為X軸、峰面積為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為0.51～10.29 μg·mL-1，Y=0.553 9X-0.089，r=0.999 5；1.03～205.79 μg·mL-1，Y=0.558X+0.128，r=0.999 9。在該條件下，取樣品5.0 g 兩份，分別加入10 μg 和25 μg 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品。按照樣品處理方法處理后上機，信噪比分別為9.3 和13.2，符合國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）對檢出限、定量限的規(guī)定。由表1可知，該方法的回收率及RSD 值均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的相關(guān)要求，說明該方法可在不同水平準(zhǔn)確測定食醋樣品中脫氫乙酸的含量。

表1 回收率及重復(fù)性考察結(jié)果表

續(xù)表1

3 結(jié)論

通過試驗分析證明，在測定食醋中脫氫乙酸含量過程中，采用封尾工藝C18色譜柱，0.02 mmol·L-1乙酸銨（乙酸調(diào)節(jié)pH=5）+甲醇=75+25 流動相體系，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為293 nm 的色譜條件，可以縮短脫氫乙酸的出峰時間，獲得穩(wěn)定的峰形，使用C18固相萃取小柱進(jìn)行前處理的方法，可以準(zhǔn)確檢驗食醋中的脫氫乙酸含量。