◎ 張學(xué)玲，劉 霞，蔣 媛，葛 謙，董 川，牛 艷，王曉菁

（1.寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)研究院，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（枸杞和葡萄酒質(zhì)量安全），寧夏 銀川 750002；2.寧夏回族自治區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，寧夏 銀川 750002；3.寧夏回族自治區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750002）

葡萄產(chǎn)業(yè)是寧夏農(nóng)業(yè)發(fā)展的優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)和自治區(qū)六大支柱產(chǎn)業(yè)之一，已初步形成規(guī)模化。釀酒葡萄因皮厚、果肉少、汁多、糖分含量高、種子較大、單寧含量高而被用于葡萄酒的釀造。在葡萄酒中，單寧的數(shù)量、種類(lèi)對(duì)葡萄酒的口感、結(jié)構(gòu)、風(fēng)味以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值均具有重要的影響[1]。研究表明，單寧可以穩(wěn)定紅葡萄酒的色素，使其保持鮮活的顏色，也能使酒體更加堅(jiān)實(shí)飽滿、余味持久[2]。單寧不僅可以保護(hù)葡萄本身的天然花色苷，還可以防止花色苷被氧化，對(duì)pH、氧氣和二氧化硫更為穩(wěn)定[3]。單寧作為紅葡萄酒的骨架，能在感官上帶來(lái)苦味和澀味，欠缺單寧的葡萄酒往往瘦弱寡淡，風(fēng)味不足。

單寧酸又稱(chēng)鞣酸、單寧或丹寧酸，化學(xué)式為C76H52O46，是一種天然的多酚化合物。單寧酸含有的多酚基團(tuán)具有很強(qiáng)的生理活性功能，能夠抗氧化[4-8]、抗菌[9-13]、收斂[14-15]、抗腫瘤和抗癌變[16-17]等，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[18]。

分光光度法[19-20]是檢測(cè)單寧酸的主要方法，但該方法測(cè)定的是以沒(méi)食子酸為主的單寧類(lèi)化合物的總量，而非單寧酸含量。近年來(lái)，高效液相色譜法也逐漸被運(yùn)用于樣品中單寧酸含量的測(cè)定中[21-22]，但相應(yīng)報(bào)道較少，且關(guān)于釀酒葡萄中單寧酸含量的測(cè)定暫未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本文以寧夏產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄為主要原料，采用振蕩輔助提取釀酒葡萄中單寧酸成分，通過(guò)前處理（提取試劑、提取體積、振蕩時(shí)間等）和儀器條件優(yōu)化，建立了基于高效液相色譜法測(cè)定釀酒葡萄中單寧酸含量的方法，以期為完善寧夏地區(qū)釀酒葡萄質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系構(gòu)建提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2021年7—9月在賀蘭山東麓釀酒葡萄種植基地，采摘幼果期、收獲期釀酒葡萄。每次隨機(jī)于植株?yáng)|、西兩側(cè)分別采集果穗各1 穗，共6 穗，采集品種7 種，包括霞多麗、雷司令、赤霞珠、蛇龍珠、西拉、馬瑟蘭和美樂(lè)。所采樣品去除異常果粒后經(jīng)破壁料理機(jī)打漿，放置在-20 ℃冰箱中冷凍保存。

對(duì)照品單寧酸（CAS：1401-55-4，含量98%）；乙腈、甲醇、正己烷、丙酮（色譜純，美國(guó)默克公司）；磷酸(色譜純，美國(guó)天地公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀-UV 檢測(cè)器（Waters e2695-2487，美國(guó)沃特世公司）；低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（TDL-40B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；振蕩器（THZ-82A，金壇榮華儀器公司）；高速勻漿機(jī)（T18 basic 型，德國(guó)IKA 公司）；電子天平（PL202-L 型，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；渦旋混合器（IKA MS 3 basic型，德國(guó)IKA 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

AQ-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm ）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.1% 磷酸水溶液- 乙腈（95∶5，V∶V）；流速：0.8 mL·min-1；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取單寧酸對(duì)照品適量（精確至0.01 mg），置棕色小瓶中，用刻度吸管移10 mL 甲醇充分溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，避光-18 ℃保存。每次取用時(shí)，準(zhǔn)確移取適量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇定容，配制成所需系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 樣品提取

稱(chēng)取釀酒葡萄樣品3.0 g 于50 mL 的離心管中，加入25 mL 8∶2（V∶V）甲醇溶液，振蕩20 min，于4 000 r·min-1離心3 min，經(jīng)0.22 μm 的濾膜過(guò)濾后用于高效液相色譜儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

研究表明[22]，單寧酸的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，故選擇該波長(zhǎng)為液相紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)。選擇Ultimate AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，采用Ultimate AQ-C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，可實(shí)現(xiàn)與干擾組的有效分離。該條件下單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品為單一峰，且峰型對(duì)稱(chēng)，相對(duì)保留時(shí)為11.910 min 左右，重現(xiàn)性好，單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1，釀酒葡萄中單寧酸色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 釀酒葡萄中單寧酸色譜圖

2.2 釀酒葡萄中單寧酸前處理方法的建立

2.2.1 提取試劑的優(yōu)化

單寧酸具有較強(qiáng)的極性，極易溶于水和一些有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈、乙酸、乙酸乙酯等，而在三氯甲烷、正己烷中均不溶，本文選取丙酮、乙酸乙酯、甲醇3 種有機(jī)試劑對(duì)釀酒葡萄中單寧酸進(jìn)行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種試劑均能提取出釀酒葡萄中單寧酸成分，結(jié)合儀器色譜條件、試劑安全性使用及實(shí)驗(yàn)操作方便性，選取甲醇作為提取劑。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以甲醇為提取劑時(shí)，單寧酸回收率較低，故進(jìn)一步通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對(duì)甲醇-水（體積比）進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著提取體系中甲醇比例的增大，單寧酸回收率呈先上升后下降趨勢(shì)，甲醇-水的體積比為8∶2 時(shí)，單寧酸回收率最高，達(dá)92%。

圖3 不同比例甲醇-水（體積比）提取條件下釀酒葡萄中單寧酸的回收率圖

2.2.2 提取劑體積及振蕩時(shí)間的優(yōu)化

釀酒葡萄稱(chēng)樣量不變，考察提取劑體積、振蕩時(shí)間變化對(duì)單寧酸回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。提取劑體積增大可以有效提高單寧酸的回收率，當(dāng)提取劑體積≥25 mL 時(shí)，單寧酸的回收率均可以達(dá)到97%以上，考慮到有機(jī)試劑的有效合理使用，確定提取劑體積為25 mL。在前面優(yōu)化的基礎(chǔ)上，改變振蕩提取時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)振蕩時(shí)間≥20 min 時(shí)，單寧酸的回收率均能符合檢測(cè)方法要求，考慮到節(jié)能減耗，振蕩時(shí)間選取20 min。

圖4 不同提取體積下釀酒葡萄中單寧酸回收率圖

圖5 不同振蕩時(shí)間下釀酒葡萄中單寧酸回收率圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限

分別配制0.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1、60.0 mg·L-1、80.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照已優(yōu)化的色譜條件分別進(jìn)樣，以單寧酸的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，繪制單寧酸線性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。曲線方程為y=2 736.9x-1 931.8，R為0.999 8，說(shuō)明單寧酸濃度為0.5～100.0 mg·L-1時(shí)其線性關(guān)系良好。

稱(chēng)樣量為1 g，定容體積為50 mL，以3 倍信噪比計(jì)算儀器檢出限，單寧酸的檢出限為0.2 mg·kg-1；采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)確定本方法中定量限為0.5 mg·kg-1。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一釀酒葡萄樣品提取液，將樣品在室溫下分別放置0 h、2 h、5 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h 后，按已建立的色譜條件，采用高效液相對(duì)不同放置時(shí)間下的釀酒葡萄樣品提取液進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)單寧酸峰面積計(jì)算RSD 值。結(jié)果顯示RSD 值為2.6，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.5 準(zhǔn)確度與精密度

分別在釀酒葡萄基質(zhì)中添加0.5 mg·kg-1、5.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1和20.0 mg·kg-14 個(gè)濃度水平的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)5次，測(cè)定其回收率。由表1可知，在4 個(gè)濃度添加水平下，釀酒葡萄中單寧酸的平均回收率在88%～96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%～6.0%，符合檢測(cè)要求。

表1 釀酒葡萄中單寧酸的添加回收率和精密度結(jié)果表（n=5）

2.6 釀酒葡萄樣品中單寧酸含量的測(cè)定及差異性分析

采用已建立的釀酒葡萄中單寧酸檢測(cè)分析方法，對(duì)同一天采集的不同品種釀酒葡萄幼果和成熟果中單寧酸含量進(jìn)行測(cè)定，并采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同品種釀酒葡萄幼果和成熟果中單寧酸含量圖

因品種差異，7 個(gè)品種釀酒葡萄幼果和成熟果中的單寧酸含量有極顯著差異性（P＜0.01）。幼果期，白葡萄中雷司令的單寧酸含量高于霞多麗；紅葡萄中西拉的單寧酸含量最高，表現(xiàn)為西拉（17.9 mg·kg-1）>馬瑟蘭（9.2 mg·kg-1）>美樂(lè)（7.2 mg·kg-1）>蛇龍珠（5.0 mg·kg-1）>赤霞珠（4.5 mg·kg-1）。經(jīng)生育期變化，成熟果中單寧酸的含量累計(jì)增加遠(yuǎn)高于幼果，白葡萄中雷司令單寧酸含量高于霞多麗，紅葡萄中西拉（164.2 mg·kg-1）>蛇龍珠（131.1 mg·kg-1）>赤霞珠（95.1 mg·kg-1）>馬瑟蘭（92.4 mg·kg-1）>美樂(lè)（72.3 mg·kg-1），與幼果相比存在差異。幼果到成熟果，單寧酸累計(jì)增長(zhǎng)量表現(xiàn)為西拉（146.3 mg·kg-1）>蛇龍珠（126.1 mg·kg-1）>赤霞珠（90.6 mg·kg-1）>馬瑟蘭（83.2 mg·kg-1）> 美 樂(lè)（65.1 mg·kg-1）> 雷 司 令（33 mg·kg-1）>霞多麗（27.6 mg·kg-1）。白葡萄品種較紅葡萄品種，幼果果實(shí)中單寧酸含量差異不大，但經(jīng)生育期變化至成熟果，單寧酸含量遠(yuǎn)低于紅葡萄品種。

3 結(jié)論

通過(guò)前處理及儀器條件優(yōu)化，建立了釀酒葡萄中單寧酸高效液相色譜分析法。結(jié)果表明單寧酸在濃度為 0.5～100 mg·L-1時(shí)，與響應(yīng)值呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.999 8；單寧酸回收率在88%～96%，RSD值為0.7%～6.0%，定量限為0.5 mg·L-1，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，滿足分析檢測(cè)要求，可用于釀酒葡萄中單寧酸含量的測(cè)定。因品種差異，7 個(gè)品種釀酒葡萄幼果和成熟果中單寧酸含量均存在極顯著差異（P＜0.01）。經(jīng)生育期變化，各品種成熟果中單寧酸含量與幼果相比存在差異。幼果果實(shí)中白葡萄與紅葡萄單寧酸含量差異不大，但經(jīng)生育期變化至成熟果，白葡萄中單寧酸含量遠(yuǎn)低于紅葡萄品種。