周 游，黃麗花，唐秀文，楊小兵

廣西壯族自治區(qū)胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣西柳州 545005

人類免疫缺陷病毒(HIV)感染人體后，主要攻擊的靶細胞是人體的CD4+T淋巴細胞，導(dǎo)致CD4+T淋巴細胞進行性減少，CD4+與CD8+T淋巴細胞比值倒置，細胞免疫功能受損[1]，進而發(fā)展為獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。AIDS患者缺乏CD4+T淋巴細胞，容易并發(fā)馬爾尼菲籃狀菌(TM)感染。TM感染是南亞和東南亞流行的一種新型真菌感染性疾病，是該地區(qū)HIV感染者的主要死亡原因[2]；我國TM感染主要分布在南方，有研究報道AIDS患者合并TM感染發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢[3]；廣西地區(qū)住院的HIV/AIDS患者中TM感染率為15.60%，發(fā)病以中壯年為主[4]。該病發(fā)病隱匿，誤診率和病死率高[5]。目前TM培養(yǎng)仍然是TM感染診斷的金標準，但耗時較長，血培養(yǎng)平均報告時間為5.6 d[6]，且容易漏檢。在目前的TM感染診斷中，一種特異性高的血清學(xué)方法對潛伏感染的快速診斷是必不可少的；然而，在血清學(xué)中經(jīng)常觀察到假陰性結(jié)果，而且目前還沒有合適的快速血清學(xué)試驗來診斷TM感染[7]。本研究旨在探討血漿腺苷脫氨酶(ADA)聯(lián)合(1-3)-β-D葡聚糖檢測對AIDS合并TM感染的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2019年1月至2020年12月在本院住院的456例AIDS患者的臨床資料，將其分為AIDS合并TM感染組(TM組)、AIDS無或合并其他感染組(非TM組)。TM組患者211例，其中男169例，女42例；年齡35～83歲，平均(48.89±13.70)歲。非TM組患者245例，其中男186例，女59例；年齡19～88歲，平均(51.49±13.49)歲。非TM組包括AIDS無感染(AIDS組)患者99例、AIDS合并結(jié)核感染(AIDS+結(jié)核組)患者63例、AIDS合并真菌感染(AIDS+真菌組)患者73例、AIDS合并結(jié)核和真菌感染(AIDS+結(jié)核+真菌組)患者10例。

1.2納入與排除標準 納入標準：(1)所有AIDS患者診斷均符合《中國艾滋病診療指南(2018版)》相關(guān)標準[1]，AIDS組為AIDS患者但無機會性感染；(2)TM感染以血、骨髓、灌洗液等標本培養(yǎng)出TM陽性為診斷金標準；(3)其他侵襲性真菌感染的診斷均符合相關(guān)的國家診斷標準，肺結(jié)核診斷均符合中華醫(yī)學(xué)分會結(jié)核病學(xué)會制訂的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[8]相關(guān)標準。排除標準：(1)患者相關(guān)病例資料不全；(2)AIDS合并肝炎、肝癌患者[9]。

1.3方法

1.3.1血漿ADA水平檢測 采用雅培C16000全自動化生化分析儀，配套寧波美康A(chǔ)DA檢測試劑盒(過氧化物酶法)，按試劑說明書操作上機檢測。

1.3.2血漿(1-3)-β-D葡聚糖水平檢測 采用北京金山科技發(fā)展有限公司的MB-80S微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)及配套試劑盒，檢測時按試劑說明書進行操作。取離心后的標本上層血清100 μL，加入到900 μL標本處理液中，輕輕搖勻后放入恒溫儀加熱區(qū)中進行70 ℃干熱10 min；干熱結(jié)束后，將前處理液冷卻5 min，至室溫后取出(取出時切忌振蕩)；取上述前處理液中上層200 μL加入到反應(yīng)主劑中，輕輕混勻(一般混勻7～8 s即可)，待完全溶解至透明后，全部移液至平底試管中(不要產(chǎn)生氣泡)，立即放入MB-80S微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)中進行檢測。

1.3.3CD4+T淋巴細胞計數(shù)檢測 采用美國BD公司FACSC clibur流式細胞儀及配套試劑；取一支BD Trucount管(注意使用前，確認BD Trucount管微球完好無損并處于管底部金屬網(wǎng)下；否則丟棄該管，并用另一支完好的代替)；加入20 μL試劑抗體，移液位置剛好高于不銹網(wǎng)(建議使用反向移液技術(shù)將標本移取到試管壁上)，不要觸碰微球。加入50 μL充分混勻的抗凝全血，旋渦混勻，在室溫(20～25 ℃)下避光孵育15 min，加入450 μL(1∶10)稀釋的FACS溶血素，輕輕渦旋振蕩混合，避光放置10 min，即可在流式細胞儀上進行分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和處理。不呈正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示，組間比較采用秩和檢驗；采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血漿ADA、(1-3)-β-D葡聚糖單獨和聯(lián)合檢測的診斷效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組ADA、(1-3)-β-D葡聚糖水平和CD4+T淋巴細胞數(shù)比較 TM組血漿中的ADA、(1-3)-β-D葡聚糖水平均明顯高于非TM組、AIDS組、AIDS+結(jié)核組、AIDS+真菌組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CD4+T淋巴細胞數(shù)明顯低于非TM組、AIDS組、AIDS+結(jié)核組、AIDS+真菌組、AIDS+結(jié)核+真菌組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TM組CD4+T淋巴細胞數(shù)<50個/微升的患者占比為95.73%(202/211)，CD4+T淋巴細胞數(shù)平均值為20.7個/微升；TM組與AIDS+結(jié)核+真菌組ADA、(1-3)-β-D葡聚糖水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組ADA、(1-3)-β-D葡聚糖水平和CD4+T淋巴細胞數(shù)比較[M(P25,P75)]

2.2血漿ADA、(1-3)-β-D葡聚糖單獨和聯(lián)合檢測的診斷效能 ROC曲線分析結(jié)果表明，ADA聯(lián)合(1-3)-β-D葡聚糖檢測的曲線下面積(AUC)、特異度、約登指數(shù)均高于ADA、(1-3)-β-D葡聚糖單獨檢測(P<0.001)，見表2。

表2 血漿ADA、(1-3)-β-D葡聚糖單獨和聯(lián)合檢測的診斷效能

3 討 論

TM主要寄生于細胞內(nèi)，對非特異性吞噬作用有很強的抵抗力，多感染細胞免疫功能缺陷的患者[5]。TM感染發(fā)病較隱匿，常累及多個系統(tǒng)，臨床癥狀多樣、不典型。TM感染在廣西地區(qū)HIV/AIDS患者中很常見，患病率(16.1%)在所有AIDS相關(guān)并發(fā)癥中排名第4，僅次于肺炎、肺結(jié)核和口腔念珠菌感染[7]；TM感染是所有并發(fā)癥中病死率最高的疾病之一，TM感染使HIV/AIDS患者的住院病死率風(fēng)險增加1.8～4.5倍，病死率可達17.5%[7]。因此，早期、快速診斷TM感染，是臨床規(guī)范治療急需解決的問題。

ADA是淋巴細胞產(chǎn)生的與機體細胞免疫活性有重要關(guān)系的并參與嘌呤代謝的一種酶，在人體內(nèi)分布較廣。鄭芳等[10]研究表明，AIDS合并TM感染患者血清ADA水平升高，死亡組血清ADA水平高于存活組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ADA水平越高，則患者死亡風(fēng)險越大；ADA是評價AIDS合并TM感染預(yù)后的重要指標之一。陳鐘等[11]研究顯示，ADA對AIDS合并TM感染的最佳臨界值、靈敏度、特異度分別為28.5 U/L、80%、80%；周國強等[12]研究指出AIDS合并TM感染患者血清ADA水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ADA檢測可以作為AIDS合并TM感染的輔助診斷方法之一。本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果基本一致，根據(jù)ROC曲線確定ADA診斷AIDS合并TM感染的最佳臨界值為36.8 U/L，靈敏度為64.5%，特異度為84.1%，約登指數(shù)為0.486；TM組中ADA水平明顯高于非TM組、AIDS組、AIDS+結(jié)核組、AIDS+真菌組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。可能是由于TM感染人體后，T淋巴細胞、巨噬細胞介導(dǎo)一系列細胞免疫炎癥反應(yīng)，從而引起ADA水平升高。

(1-3)-β-D葡聚糖廣泛存在于真菌細胞壁中。TMD感染傳播途徑最常見的是經(jīng)呼吸道吸入TM孢子導(dǎo)致感染，TM屬胞內(nèi)寄生真菌，其宿主細胞主要為巨噬細胞，易侵犯免疫系統(tǒng)受損患者的單核-巨噬細胞系統(tǒng)[13]。當(dāng)真菌進入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細胞處理，持續(xù)釋放(1-3)-β-D葡聚糖，使血液或其他體液中(1-3)-β-D葡聚糖水平升高；(1-3)-β-D葡聚糖對除隱球菌外的侵襲性真菌感染診斷的靈敏度、特異度分別為92.9%、59.0%[14]。本研究中TM組(1-3)-β-D葡聚糖水平明顯高于非TM組、AIDS組、AIDS+結(jié)核組、AIDS+真菌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？梢?1-3)-β-D葡聚糖對AIDS合并TM感染有一定的診斷價值。根據(jù)ROC曲線確定(1-3)-β-D葡聚糖診斷AIDS合并TM感染的最佳臨界值為77.0 pg/mL，靈敏度為73.5%，特異度為77.1%，約登指數(shù)為0.506。

AIDS合并TM感染可引起CD4+T淋巴細胞數(shù)減少，研究報道AIDS合并TM黃疸組患者CD4+T淋巴細胞水平低于AIDS合并乙型肝炎病毒黃疸組和AIDS合并丙型肝炎病毒黃疸組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)TM感染好發(fā)于CD4+T淋巴細胞數(shù)<50個/微升的AIDS患者[3]；陳鐘等[11]研究結(jié)果提示HIV-TM組患者的CD4+T淋巴細胞數(shù)平均值為21.84個/微升；本研究數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，TM組CD4+T淋巴細胞數(shù)<50個/微升的患者占比為95.73%(202/211)，CD4+T淋巴細胞數(shù)平均值為20.7個/微升，與上述報道基本一致。TM組CD4+T淋巴細胞數(shù)明顯低于非TM組、AIDS組、AIDS+結(jié)核組、AIDS+真菌組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TM組與AIDS+結(jié)核+真菌組比較，ADA、(1-3)-β-D葡聚糖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但TM組CD4+T淋巴細胞數(shù)明顯低于AIDS+結(jié)核+真菌組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，由于AIDS患者常發(fā)生多種機會性感染，在運用血漿ADA聯(lián)合(1-3)-β-D葡聚糖檢測對AIDS合并TM感染的診斷時，應(yīng)查看患者CD4+T淋巴細胞數(shù)結(jié)果，以排除AIDS合并結(jié)核和真菌感染。

血漿ADA、(1-3)-β-D葡聚糖檢測簡單、經(jīng)濟、高效；相比傳統(tǒng)方法，診斷時效更短，當(dāng)血漿ADA、(1-3)-β-D葡聚糖水平升高，CD4+T淋巴細胞數(shù)<50個/微升時，應(yīng)高度懷疑AIDS患者感染TM；ADA和(1-3)-β-D葡聚糖聯(lián)合檢測的AUC、靈敏度、特異度分別為0.848、65.4%、90.6%，聯(lián)合檢測的AUC增大、特異度較ADA、(1-3)-β-D葡聚糖單獨檢測的特異度高，其診斷價值高于ADA、(1-3)-β-D葡聚糖單獨檢測。ADA和(1-3)-β-D葡聚糖聯(lián)合檢測對于診斷AIDS患者是否合并TM感染具有一定的參考價值，也應(yīng)密切觀察患者的臨床表現(xiàn)及病原菌檢測結(jié)果等，為臨床的早期診斷提供依據(jù)，降低AIDS合并TM感染患者病死率，改善預(yù)后。

有研究顯示，AIDS合并TM感染患者血清ADA水平升高主要以ADA2水平升高為主[11]，本研究僅探索ADA聯(lián)合(1-3)-β-D葡聚糖檢測在AIDS合并TM感染中的潛在診斷價值，而且AIDS+結(jié)核+真菌組收集到的病例數(shù)較少，有一定的局限性；(1-3)-β-D葡聚糖對AIDS合并TM感染的診斷特異度不高；AIDS患者合并其他疾病種類較多，本研究尚難完全排除其他因素的干擾，今后仍需加大樣本量繼續(xù)深入研究。