劉巧靈，李培芬，孫細歡，仝瑩瑩，黃東紅△

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院：1.檢驗科；2.微生物實驗室，福建泉州 362000

隨著免疫治療發(fā)展，廣譜抗菌藥物的使用及介入治療增多，機會性真菌感染發(fā)生率越來越高，尤其是外陰念珠菌感染成為臨床的常見病和高發(fā)病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。傳統(tǒng)抗真菌藥物常常通過抑制細胞壁合成或破壞細胞膜功能而起到抑制真菌或殺滅真菌的作用。傳統(tǒng)抗真菌藥物抗念珠菌治療效果慢、療程長，且常存在著較嚴重的不良反應(yīng)及耐藥性，給臨床治療帶來極大的困難[3]。因此，研究新型抗菌藥物或?qū)ΜF(xiàn)有抗念珠菌藥物進行改造增強抗念珠菌效果成為臨床研究的熱點和重點。納米材料因表面積增大和晶格破損可產(chǎn)生特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，可以此構(gòu)建具有新型物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)的化學(xué)材料。其中，有研究表明納米銀和納米氧化鎂是具有較強抗菌作用的納米材料[4]。二硫化硒具有抗真菌、抗皮脂溢出的作用，可用于治療花斑癬、多色蛇皮癬等皮膚疾病[5-6]。本文通過探討復(fù)合納米二硫化硒對念珠菌的抑菌(殺菌)作用，以期發(fā)現(xiàn)復(fù)合納米二硫化硒在念珠菌感染治療中的價值。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2019年1-6月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床微生物實驗室來自于呼吸道、創(chuàng)面、泌尿生殖道、血液及無菌體液等的真菌培養(yǎng)標本，標本接種于沙保羅平板(廣州迪景工程有限公司)，采用YST鑒定卡(法國生物梅里埃公司)、VITEK2 Compact全自動細菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)鑒定。選擇10株白念珠菌、10株熱帶念珠菌、10株近平滑念珠菌共30株臨床常見念珠菌進行試驗。質(zhì)控菌株：近平滑念珠菌標準株ATCC22019、克柔念珠菌ATCC6258，購自中國菌種資源庫保藏中心，于-80 ℃保存。

1.2材料來源 本研究所用納米材料為復(fù)合納米二硫化硒，來自泉州師范學(xué)院楊大鵬團隊，其透射電鏡圖見圖1。

圖1 生物模板法合成復(fù)合納米二硫化硒的透射電鏡圖

1.3抗菌實驗

1.3.1平板擴散實驗 念珠菌培養(yǎng)：將臨床獲得的30株念珠菌(10株白念珠菌、10株熱帶念珠菌、10株近平滑念珠菌)在培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種2次，保證念珠菌的純度及活力，35 ℃孵育24 h后備用；涂板：挑選已分離純化的3個以上單個菌落配制成0.5麥氏濁度菌液，用無菌棉簽蘸取適量溶液，在MH瓊脂平板上均勻涂3次，35 ℃培養(yǎng)24 h，另設(shè)置無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)陰性對照培養(yǎng)板。打孔：利用一次性無菌槍頭打孔，在瓊脂平板上均勻打3個孔，直徑為0.7 cm；加樣：配制一系列濃度梯度納米二氧化硒溶液，注入已經(jīng)打好的孔中，每孔50 mL；觀察：將平板放入35 ℃微生物培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后用游標卡尺量抑菌圈大小。每孔重復(fù)實驗3次取平均值。

1.3.2微量肉湯稀釋法 最小抑菌濃度(MIC)板制備：將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，10 μL，第12孔不加藥作為生長對照，冰凍干燥后密封，-20 ℃以下保存?zhèn)溆?。菌懸液配制：挑選已分離純化的3個以上單個菌落配制成0.5麥氏濁度菌液備用，經(jīng)MH肉湯1∶1 000稀釋后，向96孔板中每孔加100 μL菌液，密封后置于35 ℃普通空氣孵箱中，孵育16～20 h判斷結(jié)果[7]，于Multiskan Sky全波長酶標儀(美國Thermo Fisher公司)上檢測波長570 nm處各孔的吸光度(A)值，以細菌生長明顯被抑制，且與第12孔生長對照光密度值相比，被抑制≥50%孔的最低濃度作為復(fù)合納米二硫化硒的MIC，每孔重復(fù)3次取平均值。

1.4細胞毒試驗 (1)選用人皮膚成纖維細胞進行皮膚細胞毒試驗：復(fù)蘇成纖維細胞FHH1，將細胞加至含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后換液處理。傳代兩次后胰蛋白酶消化細胞，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成細胞懸液，以0.4×105個/孔細胞接種于96孔板中，每孔100 μL，放置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃微生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h至細胞貼壁。將復(fù)合納米硫化銅材料配制成不同濃度，加至96孔板中，分別以培養(yǎng)基及溶劑作對照。(2)CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，加入CCK8試劑，每孔10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。選擇450 nm波長，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔A值，記錄結(jié)果，計算細胞存活率。

2 結(jié) 果

2.1平板擴散試驗 30株念珠菌均顯示大小不同的抑菌圈，在復(fù)合納米二硫化硒濃度為25 mmol/L時，抑菌圈直徑為25～32 mm，見圖2。

注：A為濃度6.25 mmol/L；B為濃度12.5 mmol/L；C為濃度25 mmol/L；a、b、c為大小不同的抑菌圈。

2.2微量肉湯稀釋法 通過對30株念珠菌藥物敏感性分析，結(jié)果顯示，復(fù)合納米二硫化硒對臨床常見的念珠菌有較好的抗菌作用，3種念珠菌的MIC在6.25～25.00 mmol/L。復(fù)合納米二硫化硒對白念珠菌的MIC值為(17.50±6.45)mmol/L，熱帶念珠菌為(10.63±5.93)mmol/L，近平滑念珠菌為(14.38±7.82)mmol/L，復(fù)合納米二硫化硒對白念珠菌的MIC值高于熱帶念珠菌(t=2.480，P=0.023)，與近平滑念珠菌比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.973，P=0.343)；熱帶念珠菌和近平滑念珠菌的MIC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.208，P=0.243)。見表1。

表1 肉湯稀釋法對3種念珠菌的MIC(mmol/L)

2.3安全性分析 通過對復(fù)合納米二硫化硒作安全性分析，結(jié)果顯示，復(fù)合納米二硫化硒所產(chǎn)生的細胞毒性較小，細胞存活率可達85%以上，安全可靠。見圖3。

注：A為培養(yǎng)劑對照；B為溶劑對照；C為12.5 mmol/L的二硫化硒；D為6.25 mmol/L的二硫化硒；E為3.13 mmol/L的二硫化硒；F為1.57 mmol/L的二硫化硒。

3 討 論

隨著外科手術(shù)、介入性技術(shù)和器官移植手術(shù)的增加，外源性真菌進入人體的概率大大升高；腫瘤治療術(shù)后放療和化療的增多、免疫抑制劑和抗菌藥物的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致免疫功能低下的人群的比例升高，這使得人體內(nèi)的正常真菌菌群轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒哉婢?，從而?dǎo)致了侵襲性真菌感染的增多[8-9]。念珠菌是常見皮膚真菌感染類型，導(dǎo)致念珠菌感染嚴重的因素之一是迅速出現(xiàn)的耐藥性[10]。目前，臨床可用于治療念珠菌感染的藥物十分有限，主要有4類藥物：唑類、多烯類、棘球菌素類和核苷酸類似物[11-12]?？鼓钪榫幬锏姆N類少及念珠菌感染日益增多導(dǎo)致了臨床感染的情況日益嚴重，因此，尋求新型抗菌藥物和材料刻不容緩，目前納米技術(shù)取得了巨大的進展，跟傳統(tǒng)的抗菌藥物相比，納米材料不易導(dǎo)致細菌耐藥性的產(chǎn)生[13]。

納米抗菌藥物的抗菌機制主要是這些顆粒的納米尺寸使它們能夠附著在生物細胞的表面。由于納米顆粒尺寸小，可以很容易地與細胞表面和細胞內(nèi)的生物分子相互作用，納米抗菌藥物和生物分子之間的這種相互作用可以產(chǎn)生更好的信號，從而用于診斷和治療疾病。研究顯示，含硒物質(zhì)具有抗腫瘤增殖作用，經(jīng)結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)這種含硒物質(zhì)是一種硒-硫環(huán)狀物，以二硫化硒形式存在，具有良好的抗氧化、抗菌作用[14]。

復(fù)合納米抗菌藥物的抗菌機制比較明確，主要是與細菌內(nèi)的遺傳物質(zhì)相結(jié)合，抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，使細菌失活；與細菌細胞膜相互作用，催化細菌細胞膜裂解,使細菌死亡；與細菌菌體內(nèi)的化學(xué)基團結(jié)合，使蛋白酶喪失活性，導(dǎo)致細菌死亡；影響菌體內(nèi)環(huán)境pH值，破壞細菌的生存體系；產(chǎn)生活性氧自由基，進一步氧化菌體外膜從而抑制或殺死細菌[15-16]。納米抗菌藥物具有持久性、耐熱性、生物相容性和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，受到科研界的廣泛認可和高度重視。國內(nèi)外納米抗菌藥物的研究主要集中在抗菌性能方面。二硫化硒用于真菌性皮膚病的治療已有多年，治療效果不斷被證實[5-6]。但復(fù)合納米二硫化硒對念珠菌的抗菌作用報道較少。

本研究采用納米抗菌藥物二氧化硒對臨床分離的白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌進行抗菌試驗和細胞毒試驗，發(fā)現(xiàn)在復(fù)合納米二硫化硒濃度為25 mmol/L時，抑菌圈直徑為25～32 mm，MIC為6.25～25.00 mmol/L，其中熱帶念珠菌的MIC最低(10.63±5.93)mmol/L；此外，復(fù)合納米二硫化硒對念珠菌有很好的抑菌(殺菌)作用，并且對成纖維細胞的細胞毒性較小，成纖維細胞FHH1存活率可達85%以上。研究顯示，含二硫化硒的洗發(fā)水可有效抑制頭皮常見馬拉色菌屬繁殖，有助于重建頭皮微生態(tài)平衡，改善酮康唑治療后的溢脂性皮炎癥狀[17]。另有研究表明，單位立方厘米的念珠菌菌群表面積為(15～30)×103cm2[18]，而同體積的納米粒子體表面積是念珠菌的約2萬倍，納米材料巨大的表面張力在真菌外形成封閉膜，一方面有效增加二硫化硒滯留時間，在保證二硫化硒抗真菌藥效的同時可減少用藥量，有助于減輕藥物不良反應(yīng)[19]；另一方面可阻斷真菌汲取營養(yǎng)的途徑，促進二硫化硒的抗菌效果[20]。

綜上所述，復(fù)合納米二硫化硒有較好抗念珠菌作用且安全性好，有望成為新型抗念珠菌藥物，未來本課題組將進一步探討二硫化硒抗念珠菌的作用機制，有助于新型抗念珠菌藥物的研發(fā)。