劉文雄，高 敏

陜西省西安市西電集團醫(yī)院麻醉科，陜西西安710077

丙泊酚是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的快速、強效全身麻醉劑，具有藥效快速、麻醉平穩(wěn)、蘇醒快速等優(yōu)點[1]。在臨床上，丙泊酚以首次相對較高的劑量給藥使患者失去意識，然后以較小的劑量連續(xù)輸注，以保持患者無反應(yīng)的鎮(zhèn)靜狀態(tài)。但是丙泊酚具有一些藥物不良反應(yīng)，尤其是對神經(jīng)系統(tǒng)的認(rèn)知功能損傷最為突出[2]。研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚注射能夠引起患者產(chǎn)生不同程度的認(rèn)知功能損傷，其中以對兒童和老年人的認(rèn)知功能損傷更為明顯[3-4]。但是，目前臨床上尚缺乏應(yīng)對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷的安全、有效的防治方法。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是一種抗炎和抗氧化劑多酚，主要存在于綠茶中。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG對癌癥、肥胖、高血糖、動脈粥樣硬化和神經(jīng)退行性疾病具有積極的治療作用[5-6]。流行病學(xué)調(diào)查也證實了長期服用低劑量EGCG的生物安全性[7]。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷的影響及機制報道較少。本研究通過構(gòu)建丙泊酚誘發(fā)的老年認(rèn)知功能損傷大鼠模型，研究EGCG對該大鼠模型認(rèn)知功能損傷的潛在治療效果并探討相關(guān)的作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 Morris水迷宮購自上海移數(shù)信息科技有限公司；病理切片機(型號RM2016)購自德國徠卡公司；激光掃描共聚焦顯微鏡(型號FV1200)購自日本奧林巴斯公司；雙垂直電泳儀(型號DYCZ-24DN)購自北京六一儀器廠；酶標(biāo)檢測儀(型號Rt2100c)購自美國Rayto公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；半干轉(zhuǎn)膜儀(型號Trans-Blot SD System)購自美國Bio-Rad公司；丙泊酚注射液購自西安立邦制藥有限公司；EGCG購自美國Apexbio公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、核因子κB(NF-κB)p65、磷酸化p65(p-p65)和GAPDH抗體購自美國Abcam公司；原位末端標(biāo)記(TUNEL)凋亡熒光檢測試劑盒購自美國Abcam公司。

1.2分組處理 36只雄性20月齡SPF級Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量405～430 g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。全部實驗動物隨機等分為對照組、丙泊酚組和丙泊酚+EGCG組，每組12只。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水(5 mL/d)，丙泊酚組和丙泊酚+EGCG組腹腔注射丙泊酚60 mg/kg，每小時注射1次丙泊酚(注射劑量為首次劑量的一半)，維持麻醉6 h。每次麻醉后立即躺在自制的吸氧箱上，以5 L/min的流量持續(xù)供氧，待翻正反射恢復(fù)后，將大鼠從吸氧箱中取出。除實驗時間外，大鼠可以自由進食和飲水。丙泊酚+EGCG組大鼠每天進行50 mg/kg的EGCG灌胃處理，連續(xù)治療7 d。對照組和丙泊酚組的大鼠每天給予相同體積的生理鹽水灌胃處理。

1.3Morris水迷宮實驗 7 d的治療結(jié)束后，采用Morris水迷宮實驗評價3組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。測試前，將平臺放置在水迷宮東北象限的中心，高度在水面以下2 cm處。在池子里加入適量的墨水，使動物無法分辨平臺。游泳池的墻上掛著幾個物體作為參考。將水溫加熱至24～26 ℃，進行定位導(dǎo)航試驗5 d。每天分為2個時段，每時段4次訓(xùn)練。在4次訓(xùn)練中，將大鼠分別置于不同象限的水中，用秒表記錄大鼠找到平臺前的持續(xù)時間(逃逸潛伏期)。兩次訓(xùn)練間隔1 min。第5日下午進行探索實驗。平臺被移走，動物們被從西南象限放入水中，使用攝像機記錄大鼠在迷宮里2 min內(nèi)的游泳距離和穿越平臺次數(shù)。

1.4大鼠海馬組織炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子水平檢測 Morris水迷宮實驗結(jié)束后，立即使用過量戊巴比妥鈉腹腔注射處死各組大鼠。隨后，對大鼠開顱提取海馬組織，將海馬組織等分為3份，分別用于ELISA、組織切片染色和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測。使用生理鹽水(1∶10)快速制備勻漿，3 000 r/min離心10 min，獲得上清液。采用ELISA試劑盒檢測海馬組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平。全過程嚴(yán)格按照試劑盒中說明書操作步驟執(zhí)行。

1.5大鼠海馬組織TUNEL熒光染色 對提取的大鼠海馬組織進行4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，病理切片機下進行組織切片，二甲苯和梯度酒精中脫蠟。采用TUNEL工作液將組織切片進行孵育，37 ℃避光1 h，隨后采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染，37 ℃避光1 h，封片后在激光共聚焦顯微鏡下進行圖像采集和數(shù)據(jù)分析。

1.6大鼠海馬組織蛋白的Western blot檢測 將大鼠海馬組織在玻璃研磨機中充分研磨，隨后加入1 mL細(xì)胞裂解液裂解30 min，然后以2 000 r/min離心5 min，獲取上清液，使用BCA法對蛋白水平進行測定。隨后以4∶1比例上樣，煮沸后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別使用Caspase-3、NF-κB p65、NF-κB p-p65的一抗進行過夜孵育，充分漂洗后孵育二抗，進行顯影和蛋白水平的半定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與對照組比較，丙泊酚組大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離增加，穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離減少(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)；對照組與丙泊酚+EGCG組大鼠在逃逸潛伏期、游泳距離和穿越平臺次數(shù)上比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.2EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織炎癥因子水平的影響 與對照組比較，丙泊酚組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)；對照組與丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織炎癥因子水平的影響

2.3EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織神經(jīng)營養(yǎng)因子水平的影響 與對照組比較，丙泊酚組大鼠海馬組織中NGF、BDGF水平降低(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中NGF、BDGF水平升高(P<0.05)；對照組與丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中NGF、BDGF水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織神經(jīng)營養(yǎng)因子水平的影響

2.4EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，丙泊酚組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡比例升高(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡比例降低(P<0.05)。見表4。與對照組比較，丙泊酚組大鼠海馬組織中凋亡因子Caspase-3水平、NF-κB p-p65/p65升高(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中Caspase-3水平、NF-κB p-p65/p65降低(P<0.05)；丙泊酚組與丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織Caspase-3水平、NF-κB p-p65/p65比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表5。

表4 EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響

圖1 EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織細(xì)胞Caspase-3和NF-κB通路蛋白表達(dá)的影響

表5 EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織細(xì)胞Caspase-3和NF-κB通路蛋白的影響

3 討 論

由于EGCG具有抗氧化和抗炎反應(yīng)特性，因此近年來它廣泛被用于疾病的防治。EGCG的抗癌作用已在多種腫瘤細(xì)胞中得到證實[8]。EGCG已被證實能抑制癌變的諸多過程，如啟動、促進和進展。此外EGCG還被證實能調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞信號通路，如增殖、凋亡、血管生成和遷移等[9]。EGCG也被證實能產(chǎn)生抗肥胖和抗高血糖效應(yīng)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)EGCG能抑制脂肪細(xì)胞生長和誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞凋亡[10-11]。研究也發(fā)現(xiàn)EGCG能夠?qū)Π柶澓Ｄ〉壬窠?jīng)退行性疾病產(chǎn)生積極影響[12]。

丙泊酚是臨床手術(shù)常見的麻醉藥物，故它的藥物不良反應(yīng)也備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚麻醉后會產(chǎn)生不同程度的認(rèn)知功能損傷，而其損傷程度與年齡相關(guān)[13]。本研究通過Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)一次性注射丙泊酚7 d后大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離增加，而穿越平臺次數(shù)減少，提示丙泊酚可誘發(fā)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，表明大鼠認(rèn)知功能損傷模型構(gòu)建成功。本研究進一步發(fā)現(xiàn)連續(xù)7 d EGCG治療可減少丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離，并增加其穿越平臺次數(shù)，提示短期的EGCG治療即可對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生顯著的改善效果。

海馬區(qū)炎癥反應(yīng)是認(rèn)知功能損傷的重要因素，降低海馬區(qū)炎癥因子水平也是改善認(rèn)知功能的重要手段[14]。研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能誘導(dǎo)海馬組織處于高炎癥反應(yīng)狀態(tài)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-6是兩個最常見的促炎因子，其在丙泊酚注射后的老年大鼠海馬組織中處于高水平狀態(tài)。而經(jīng)EGCG治療的丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織中TNF-α和IL-6水平接近對照組水平，提示EGCG能抑制丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織高炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改善與其對海馬組織的抗炎癥反應(yīng)有關(guān)。

NGF是中樞和外周神經(jīng)細(xì)胞生長和發(fā)育不可或缺的因子，而NGF既可對海馬組織的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，且NGF也被認(rèn)為是認(rèn)知功能損傷的重要標(biāo)志物[16]。BDGF也是神經(jīng)營養(yǎng)素家族的關(guān)鍵成員。與NGF相比，BDGF主要局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，它支持來自神經(jīng)嵴和外胚層基板的初級感覺神經(jīng)元的存活，這些神經(jīng)元對NGF沒有反應(yīng)[17]。研究也發(fā)現(xiàn)，海馬組織中NGF和BDGF水平與認(rèn)知功能呈高度線性正相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚注射的老年大鼠海馬組織中NGF和BDGF水平降低，進一步證實了丙泊酚通過誘導(dǎo)海馬組織損傷引發(fā)老年大鼠認(rèn)知功能損傷。而丙泊酚+EGCG組大鼠海馬組織中NGF和BDGF水平高于丙泊酚組，提示EGCG治療后丙泊酚對海馬組織的損傷效應(yīng)顯著減弱。

海馬組織中凋亡細(xì)胞的進行性增多是認(rèn)知功能損傷的關(guān)鍵誘因[19]。本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚組海馬組織凋亡細(xì)胞比例高于對照組，而Western blott結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Caspase-3作為凋亡誘導(dǎo)因子和細(xì)胞凋亡標(biāo)志物，在丙泊酚組大鼠海馬組織中水平升高，進一步證實了丙泊酚能夠誘發(fā)海馬組織細(xì)胞凋亡。EGCG治療不僅可降低大鼠海馬組織中凋亡的細(xì)胞數(shù)量，并且可降低海馬組織中Caspase-3水平，提示EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷的治療效果與其對海馬組織細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。

研究表明所有促炎因子的基因都包含NF-κB結(jié)合位點，并受其轉(zhuǎn)錄調(diào)控[20]。NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子Rel家族的一員，是由p50和p65亞基組成的異二聚體。不活躍的NF-κB復(fù)合物通過與抑制亞單位IκB結(jié)合而被隔離在細(xì)胞質(zhì)中。在外界刺激下，IκB蛋白被磷酸化、泛素化和降解，使NF-κB轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核，在核內(nèi)結(jié)合位于靶基因啟動子區(qū)的特定DNA序列并激活基因轉(zhuǎn)錄。研究表明NF-κB的激活伴隨著促炎癥細(xì)胞因子的分泌，與阿爾茨海默病等諸多神經(jīng)退行性病變有關(guān)，而通過藥物抑制NF-κB水平可以有效緩解神經(jīng)炎癥從而改善認(rèn)知功能[21]。本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚會誘發(fā)老年大鼠海馬組織中NF-κB p-p65/p65升高，而EGCG治療后丙泊酚誘發(fā)的NF-κB p-p65/p65被明顯抑制，提示EGCG對丙泊酚誘發(fā)的認(rèn)知功能損傷大鼠海馬組織細(xì)胞的抗炎效應(yīng)與其對NF-κB水平抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究揭示了EGCG可有效緩解丙泊酚誘發(fā)老年大鼠認(rèn)知功能損傷，而該效應(yīng)與NF-κB介導(dǎo)的海馬組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的抑制及神經(jīng)營養(yǎng)因子活化有關(guān)。