黃坤寧，申 鷹，楊久玲，周 亞，楊小燕

（1.貴州省檢測技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州貴陽 550000；2.貴州省分析測試研究院，貴州貴陽 550000）

香菇（Lentinus edodes）也稱冬菇、香菰、香信[1]，其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有很高的食用和藥用價值，素有“山珍”之稱[2]，是我國第一大類食用菌[3]。據(jù)統(tǒng)計，2019年我國香菇生產(chǎn)總量達(dá)1 115.94萬t，是全國食用菌生產(chǎn)總量的28.37%[4]。但香菇在菌種生產(chǎn)和栽培過程中，經(jīng)常會發(fā)生細(xì)菌性病害，其中，以假單胞菌屬和芽孢桿菌屬最為常見[5-6]，對香菇的生產(chǎn)造成巨大的損失。目前，普遍的做法是使用化學(xué)藥劑來防治，但化學(xué)藥劑的添加會帶來食品安全隱患，而且增加生產(chǎn)的成本。因此，研究天然抑菌物質(zhì)對香菇及其雜菌生長的影響，對香菇雜菌防治具有重要意義。

已有研究表明，洋蔥、大蒜、生姜、干紅椒和黃芪5種植物的提取液均對細(xì)菌有相應(yīng)的抑菌效果[7-10]。康美玲[7]研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥汁對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌都有抑制效果；國淑梅等[8]研究表明，大蒜、生姜提取液對枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌均有抑制作用，并且大蒜的抑制效果較好；張祖姣等[9]研究表明，辣椒提取液中的辣椒素可以抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌生長；姚淑敏等[10]研究表明，黃芪提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌以及變形桿菌具有抑制效果。

本試驗選用洋蔥、大蒜、生姜、干紅椒和黃芪5種植物提取液，研究其對香菇菌種生產(chǎn)中常見的3種細(xì)菌的抑制效果，以及對香菇菌絲生長的影響，旨在篩選出既能有效地控制細(xì)菌污染，又不影響香菇菌絲生長的抑菌物質(zhì)，以供生產(chǎn)使用，同時給香菇菌種培養(yǎng)基的配方改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物原料

洋蔥、大蒜、生姜、干紅椒和黃芪，從市場及藥店購買。

1.1.2 供試菌種

香 菇 菌 種：香 菇CICC14019、CICC14030、CICC14009菌株均來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；香菇808來源于網(wǎng)購；試驗菌株：枯草芽孢 桿 菌（Bacillus subtilis，CMCC（B）63501）、熒光假單胞菌（P.Fluorescens，ATCC13525）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，CMCC（B）63303）均來源于廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心食品安全菌種保藏中心。

1.1.3 試劑

95%乙醇為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；PDA培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

電子天平（LT2002，常熟市天量儀器有限責(zé)任公司）；恒溫培養(yǎng)箱（SPX-250，上海比朗儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器[LT-CPS，立德泰勀（上海）科學(xué)儀器有限公司]；生物安全柜[Ⅱ級A2，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司]；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；超聲波清洗器（SK250HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；臺式低速離心機(jī)（L550，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物提取液的制備

分別將洋蔥、大蒜、生姜、干紅椒和黃芪用食品加工機(jī)搗碎，40 ℃酶解30 min，加入質(zhì)量體積相同的75%乙醇（由95%乙醇經(jīng)稀釋后得到），充分混勻，35 ℃水浴超聲提取45 min，離心收集上清液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，制成濃度為2 g·mL-1的浸提液母液，過濾除菌，冷藏保存，備用。

1.3.2 菌懸液制備

將枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌3株菌種分別接種至營養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)活化后，用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，得到菌液濃度為106～107CFU·mL-1的菌懸液。置于4 ℃貯存，備用。

1.3.3 植物提取液對細(xì)菌的抑菌試驗

通過杯碟法來測定各植物提取液對枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果，取“1.3.2”中制備的各細(xì)菌懸液1 mL，加到100 mL營養(yǎng)瓊脂中，混勻，傾注平板，凝固后得到混菌平板，在混菌平板上放置4個滅菌牛津杯，每個菌設(shè)置3個重復(fù)，一個牛津杯加入無菌水作為對照（CK），取0.2 mL提取液加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，移去牛津杯，量取抑菌圈直徑，計算抑菌圈平均直徑，抑菌圈直徑越大表明提取液對該細(xì)菌的抗菌活性越強(qiáng)。

1.3.4 植物提取液對香菇菌絲的生長試驗

分別將5種植物提取液進(jìn)行二倍稀釋，每個稀

釋度分別取0.2 mL接種至無菌平皿，加入PDA培養(yǎng)基（121 ℃滅菌15 min，冷卻至45 ℃）混勻，制成提取液含量分別為400.00 mg、200.00 mg、100.00 mg、50.00 mg、25.00 mg、12.50 mg、6.25 mg的PDA平板備用，無菌水為對照（CK）。接種直徑0.5 cm的香菇菌絲塊，置于25 ℃培養(yǎng)，待空白對照菌落直徑達(dá)培養(yǎng)皿的2/3時，測量菌落直徑。參照牛世全等[11]的方法計算相對抑制率。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種植物提取液對香菇上3種細(xì)菌的抑制效果

從表1可以看出，提取液對枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制效果均表現(xiàn)為大蒜＞洋蔥＞紅椒，而生姜和黃芪提取液對枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌均無抑制作用；提取液對熒光假單胞菌的抑制效果表現(xiàn)為大蒜＞紅椒，洋蔥、生姜和黃芪提取液對熒光假單胞菌均無抑制作用。大蒜提取液和紅椒提取液對香菇上3種細(xì)菌均有抑制效果，抑制效果表現(xiàn)為蠟樣芽孢桿菌＞枯草芽孢桿菌＞熒光假單胞菌。

表1 5種提取液對香菇上3種細(xì)菌的抑制作用

2.2 5種植物提取液對不同品種香菇菌絲生長的影響

從圖1～圖4可以看出，5種植物提取液對香菇菌絲的生長均有影響，該影響與提取液含量關(guān)系較大，并且因香菇品種不同而有所差異。5種植物提取液中，大蒜和黃芪對4種香菇菌絲生長的抑制效果表現(xiàn)最為突出，并且當(dāng)大蒜提取液含量達(dá)到50.00 mg或者100.00 mg后抑制率達(dá)到100%以上。

圖1 5種植物提取液對香菇808的抑制效果

圖4 5種植物提取液對CICC14030的抑制效果

從對香菇808菌絲生長的抑制效果看，只有洋蔥提取液表現(xiàn)為負(fù)抑制，即洋蔥提取液對香菇808菌絲具有促生長效果；而生姜和紅椒提取液對香菇808菌絲生長的抑制率均在20%以下。從對香菇CICC14009菌絲生長的抑制效果看，洋蔥、生姜、紅椒提取液均對其有負(fù)抑制，提取液含量為50.00 mg時，紅椒提取液對其促生長效果最明顯。從對香菇CICC14019菌絲生長的抑制效果看，生姜、紅椒提取液均對其有負(fù)抑制，并且促生長效果表現(xiàn)為紅椒提取液＞生姜提取液。從對香菇CICC14030菌絲生長的抑制效果看，大蒜和洋蔥提取液均對其有負(fù)抑制，并且大蒜提取液對香菇CICC14030菌絲的促生長效果隨著含量的增高而降低。

圖2 5種植物提取液對CICC14009的抑制效果

注：CK為用無菌水做的空白對照組；抑菌圈直徑為0.78 cm表示沒有抑菌效果。

圖3 5種植物提取液對CICC14019的抑制效果

2.2.1 大蒜提取液對4種香菇菌絲生長的影響

從表2可以看出，大蒜提取液對4種香菇的菌絲生長的抑制效果隨著大蒜提取液含量的增大而增強(qiáng)，最后趨于穩(wěn)定。當(dāng)大蒜提取液為50.00 mg、100.00 mg、200.00 mg、400.00 mg時，對4種香菇的菌絲生長的均有抑制效果；大蒜提取液的含量為6.25 mg、12.50 mg、25.00 mg時，對香菇808、CICC14019、CICC14009仍具有抑制效果，而對香菇CICC14030則具有促生長效果，并且大蒜提取液的含量越低，其促生長效果越明顯。

表2 大蒜提取液對香菇菌絲生長的影響

2.2.2 洋蔥提取液對4種香菇菌絲生長的影響

從表3可以看出，洋蔥提取液的含量在一定值時對香菇808、CICC14009、CICC14030的菌絲具有促生長效果。洋蔥提取液的含量為50.00 mg、100.00 mg、200.00 mg時，對香菇808、CICC14009的菌絲生長具有促進(jìn)作用，并且隨著含量的增大而增強(qiáng)；洋蔥提取液的含量為25.00 mg、50.00 mg、100.00 mg、200.00 mg時，對香菇CICC14009的菌絲生長具有促進(jìn)作用，含量為25.00 mg時促生長作用最強(qiáng)；洋蔥提取液的含量為6.25 mg和200.00 mg時對香菇CICC14030的菌絲生長具有促進(jìn)作用。

表3 洋蔥提取液對香菇菌絲生長的影響

2.2.3 生姜提取液對4種香菇菌絲生長的影響

從表4可以看出，不同含量的生姜提取液對香菇808的菌絲生長均有抑制作用；生姜提取液的含量為50.00 mg、400.00 mg時，對香菇CICC14009的菌絲生長具有促進(jìn)作用，含量為50.00 mg時的促生長作用更明顯；生姜提取液的含量為50.00 mg時，對香菇CICC14019的菌絲生長具有促進(jìn)作用。

表4 生姜提取液對香菇菌絲生長的影響

2.2.4 紅椒提取液對4種香菇菌絲生長的影響

從表5可以看出，不同含量的紅椒提取液對香菇808和CICC14030的菌絲生長均有抑制作用；紅椒提取液的含量為50.00 mg、400.00 mg時，對香菇CICC14009的菌絲生長具有促進(jìn)作用，含量為50.00 mg時的促生長作用更明顯；紅椒提取液的含量為6.25 mg時對其菌絲生長無影響；紅椒提取液的含量為6.25 mg、12.50 mg、25.00 mg時，對香菇CICC14019的菌絲生長具有促進(jìn)作用，含量為12.50 mg時的促生長作用最強(qiáng)。

表5 紅椒提取液對香菇菌絲生長的影響

2.2.5 黃芪提取液對4種香菇菌絲生長的影響

從表6可以看出，黃芪提取液對4種香菇的菌絲生長具有抑制作用，并且隨著黃芪提取液含量的增大而增強(qiáng)。

表6 黃芪提取液對香菇菌絲生長的影響

3 結(jié)論與討論

5種植物提取液中只有大蒜和紅椒的提取液對枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌表現(xiàn)出抑制效果，并且因植物種類不同，各提取液對3種細(xì)菌的抑制效果各有不同；洋蔥提取液對2種芽孢桿菌具有抑制效果。該結(jié)果與國淑梅等[8]生姜對枯草芽孢桿菌有抑制效果的研究結(jié)果不一致，這可能與本試驗中生姜提取液的濃度和提取方式有關(guān)。

5種植物提取液對香菇菌絲的生長均有影響，該影響與提取液含量關(guān)系較大，并且因香菇品種不同而有所差異。大蒜提取液僅對香菇CICC14030的菌絲生長具有促進(jìn)作用，洋蔥提取液對香菇808、CICC14009、CICC14030的菌絲生長具有促進(jìn)作用；生姜提取液和紅椒提取液對香菇CICC14009、CICC14019的菌絲生長具有促進(jìn)作用；黃芪提取液對4種香菇的菌絲生長均無促進(jìn)作用。本試驗只研究了提取液對香菇菌絲生長的影響，而對香菇子實體生長的影響還需要進(jìn)一步研究。

本試驗研究表明，大蒜、紅椒提取液對 3 種細(xì)菌具有抑制效果，洋蔥提取液對2種芽孢桿菌具有抑制效果，并且3種提取液對不同品種的香菇具有促進(jìn)菌絲生長的作用。后期可以深入研究大蒜、洋蔥、紅椒提取液對香菇各生長階段的影響，以及在香菇菌種生產(chǎn)中的應(yīng)用。在香菇菌種生產(chǎn)中加入大蒜提取液、洋蔥提取液、紅椒提取液，在降低化學(xué)藥劑帶來的農(nóng)藥殘留及提高產(chǎn)量的同時，也為香菇菌種培養(yǎng)基的配方改良提供參考，為選用植物提取液制備適用于香菇的生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。