王雨涵，程家耕，張 毅，韓千慧，周 敏，侯溫甫

（武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

鴨肉作為中國(guó)歷史悠久的肉類食材，深受消費(fèi)者青睞，但其品質(zhì)易受到微生物尤其是優(yōu)勢(shì)腐敗菌的影響[1-3]。白衛(wèi)東等[4]對(duì)鴨腿中的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)假單胞菌在冷藏末期成為了主要的腐敗菌。吳忌等[5]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)鴨腿中腐敗微生物組成復(fù)雜多樣，其中假單胞菌是優(yōu)勢(shì)腐敗菌，豐度高達(dá)93.69%。因?yàn)楦瘮∧芰?qiáng)，對(duì)鴨肉的品質(zhì)以及新鮮度會(huì)造成影響，所以假單胞菌是評(píng)價(jià)鴨肉品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）屬于革蘭氏陰性菌，在低溫條件下也能生長(zhǎng)，具有嗜冷特性，廣泛存在于自然環(huán)境中，具有條件致病性。在低溫貯存條件下，假單胞菌會(huì)在牛奶等高蛋白食物的食品原料中大量繁殖，迅速成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。假單胞菌不僅會(huì)導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，且有研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種溶血內(nèi)毒素，進(jìn)入人體血液中會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重休克。雖然由熒光假單胞菌導(dǎo)致的食品中毒事件還未見(jiàn)報(bào)道，但隨著人們飲食習(xí)慣的改變和冷鏈物流體系的快速發(fā)展，假單胞菌對(duì)人體健康的潛在危害不容忽視。

生鮮肉的腐敗主要起因于環(huán)境中的致腐微生物，而熒光假單胞菌是冷鮮鴨肉中重要的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)對(duì)保證冷鮮鴨肉的鮮度和安全性具有重要意義。本研究以冷鮮鴨肉中的熒光假單胞菌為研究對(duì)象，優(yōu)化了熒光假單胞菌的快速檢測(cè)方法，并對(duì)實(shí)際應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)估，以期以更加方便快捷的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)冷鮮鴨肉中熒光假單胞菌的快速檢測(cè)，及早掌握食品中腐敗菌的變化，進(jìn)而快速評(píng)估食品質(zhì)量與安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所涉及菌株中，4株假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株（銅綠假單胞菌ASI.1129、惡臭假單胞菌ATCC 14909、產(chǎn)堿假單胞菌ATCC 17485和熒光假單胞菌ATCC 17397）購(gòu)于廣東省微生物研究所，其余菌株均來(lái)源于武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生鮮食品加工與安全團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室，為實(shí)驗(yàn)室前期從鴨肉中分離所得。CFC假單胞菌選擇性培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、STAA培養(yǎng)基、氣單胞菌培養(yǎng)基和腸道菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；Probe qPCR Mix、MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（大連寶生物工程有限公司）；TaKara細(xì)菌DNA提取試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅公司）；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信公司）；CFX96Touch熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化公司）；HBM-400D系列樣品均質(zhì)器（天津恒奧公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熒光定量PCR引物和探針的設(shè)計(jì)

選擇gyrB基因?yàn)闄z測(cè)的基因靶點(diǎn)，參考楊一林[6]的相關(guān)研究設(shè)計(jì)合成了PCR引物及相應(yīng)的TaqMan探針。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)和DNA的提取

將熒光假單胞菌株ATCC 17397劃線接種于CFC假單胞菌選擇性培養(yǎng)基后置于30 ℃培養(yǎng)箱中，于30 ℃下培養(yǎng)36～48 h，將平板上的單菌落挑入10 mL LB液體培養(yǎng)液中，于30 ℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)16 h，獲得種子液，待用。參照TaKara細(xì)菌DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明對(duì)60株細(xì)菌的DNA進(jìn)行提取，-20 ℃保存待用。

變型式模塊創(chuàng)建模式充分利用現(xiàn)有的設(shè)計(jì)知識(shí)和設(shè)計(jì)成果,最大限度地利用現(xiàn)有的模塊進(jìn)行變型設(shè)計(jì),創(chuàng)建出符合要求的新模塊,基于實(shí)例的推理技術(shù)、基于變量參數(shù)的變型設(shè)計(jì)理論是該模式的理論基礎(chǔ)和根本依據(jù).核心環(huán)節(jié)為模塊推理、模塊特征參數(shù)檢索和模塊變型設(shè)計(jì).

1.3.3 熒光定量PCR體系的建立與條件優(yōu)化

采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即Probe q PCR Mix（2X）12.5 μL、Probe（10 μM）1 μL、dd H2O 6.2 μL、上下游引物各0.4 μL及模板DNA 2 μL。

在引物設(shè)計(jì)軟件推薦Tm值（56.6 ℃）附近設(shè)置10個(gè)溫度梯度（53～62 ℃），對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)，設(shè)置6個(gè)探針濃度，對(duì)添加的引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)上述設(shè)置的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定相應(yīng)的Cq值，每組樣品重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 熒光定量PCR特異性驗(yàn)證

選擇來(lái)源于鴨肉中的60株供試菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，將60株供試菌的DNA用優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。結(jié)果若擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cq值）小于35，則結(jié)果為假陽(yáng)性。

1.3.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建及擴(kuò)增效率

選用純培養(yǎng)和人工接種兩種方法測(cè)定熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用計(jì)數(shù)結(jié)果和熒光定量PCR輸出的Cq值分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，建立純培養(yǎng)和人工接種兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用E=10-1/Slope-1計(jì)算熒光PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率。

1.3.6 熒光定量PCR最低檢出限（LOD）的評(píng)估

將熒光假單胞菌培養(yǎng)到109CFU·mL-1，再用無(wú)菌生理鹽水按比例稀釋，獲得T1（10 CFU·g-1）、T2（102CFU·g-1）、T3（103CFU·g-1）和T4（104CFU·g-1）的菌液。在無(wú)菌操作臺(tái)中將生鮮鴨肉置于上述4種不同濃度的菌液浸泡30 min，瀝干水分，靜置20 min。取上述4組接種不同濃度假單胞菌的鴨肉樣品，用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得相應(yīng)的Cq值。同時(shí)，對(duì)鴨肉樣品的菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定。設(shè)置3個(gè)樣品平行，結(jié)果取平均值。

1.3.7 熒光定量PCR檢測(cè)體系在實(shí)際樣品中的應(yīng)用

取鴨胸肉，隨機(jī)分為兩組。減菌組用50 mg·L-1二氧化氯浸泡5 min，以冰水混合物清洗去除殘留后，瀝干。對(duì)照組鴨胸肉以冰水混合物清洗，瀝干。兩組樣品均在4 ℃貯藏條件下貯藏。從第0 d開(kāi)始，每3 d進(jìn)行一次取樣，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，測(cè)得相應(yīng)的Cq值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表達(dá)，使用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行方差分析并進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)，P＜0.05表示顯著差異，使用Origin 9.0繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)體系建立與優(yōu)化

本研究對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)體系中的退火溫度和探針濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)退火溫度為60 ℃時(shí)，Cq值顯著低于其他退火溫度(P＜0.05)。在PCR反應(yīng)中，退火溫度升高，可大大減少引物與模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性，但過(guò)高的退火溫度不能導(dǎo)致引物序列有效退火，造成假陽(yáng)性。由圖2可知，隨著添加的探針濃度的升高，Cq值整體呈減小的趨 勢(shì)，當(dāng) 探 針 濃 度 為600 nmol·L-1和500 nmol·L-1時(shí)，Cq值顯著低于其他探針濃度(P＜0.05)。綜上所述，優(yōu)化得到的退火溫度為60 ℃，探針濃度為500 nmol·L-1。

圖1 不同退火溫度對(duì)應(yīng)的Cq值

圖2 不同探針濃度對(duì)應(yīng)的Cq值

2.2 熒光定量PCR特異性驗(yàn)證

對(duì)60株供試菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，其中包含21個(gè)屬，有8株熒光假單胞菌，52株非熒光假單胞菌。結(jié)果表明，8株熒光假單胞菌檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，其他52株菌株中有9株出現(xiàn)了微弱的擴(kuò)增現(xiàn)象，其中葡萄球菌、布丘氏菌、水拉恩氏菌、沙雷氏菌和耶爾森氏菌有一定概率出現(xiàn)假陽(yáng)性，這可能是優(yōu)化后的條件對(duì)這些菌株而言不合適，不能導(dǎo)致引物序列有效退火，從而造成假陽(yáng)性。特異性驗(yàn)證結(jié)果表明，本研究設(shè)計(jì)的引物對(duì)熒光假單胞菌檢測(cè)具有良好的特異性，可用于對(duì)熒光假單胞菌的檢測(cè)。

2.3 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率評(píng)價(jià)

建立以純培養(yǎng)和人工接種為基礎(chǔ)的熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，以純培養(yǎng)方法建立的PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-3.135X+41.328，相關(guān)系數(shù)r2為0.994，以人工接種方法建立的PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-3.214X+42.406，相關(guān)系數(shù)r2為0.992。兩者均具有很好的線性關(guān)系，擬合結(jié)果很好。純培養(yǎng)和人工接種方法建立的曲線斜率分別為-3.135和-3.214。用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)擴(kuò)增效率進(jìn)行計(jì)算，分別為108%和105%，擴(kuò)增效率良好，與張昭寰等[7]的研究結(jié)果一致。

2.4 最低檢出限（LOD）值評(píng)估

采用4種不同污染水平的鴨胸肉，對(duì)其熒光定量PCR系統(tǒng)的最低檢出限進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示，T1未檢測(cè)到熒光假單胞菌，PCR檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陰性；T2、T3、T4測(cè)得的熒光假單胞菌菌落數(shù)分別為2.50 lg(CFU·g-1)、3.42 lg(CFU·g-1)、4.47 lg(CFU·g-1)，PCR結(jié)果均為陽(yáng)性。綜上，本研究建立的熒光定量PCR法最低檢出限為102CFU·g-1。

表1 生鮮鴨肉中熒光假單胞菌的最低檢出限（LOD）

2.5 快速檢測(cè)方法在生鮮鴨肉中的檢測(cè)效果評(píng)價(jià)

根據(jù)所構(gòu)建的熒光定量PCR方法對(duì)鴨肉冷藏期間的Cq值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。對(duì)照組鴨肉從第3 d開(kāi)始檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，Cq值先趨于穩(wěn)定后開(kāi)始逐漸減小。減菌組生鮮鴨肉在整個(gè)貯藏期間檢測(cè)始終呈陰性。兩組鴨肉中熒光定量PCR反應(yīng)輸出Cq值與實(shí)際檢測(cè)到的熒光假單胞菌的數(shù)量變化趨勢(shì)一致，當(dāng)熒光假單胞菌數(shù)量達(dá)到檢出限，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，且隨著假單胞菌數(shù)量的增加，Cq值逐漸減小。建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)于熒光假單胞菌污染程度不同的樣品具有良好的區(qū)分效果，可通過(guò)Cq值對(duì)生鮮鴨肉中熒光假單胞菌的數(shù)量進(jìn)行定量檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)從樣品處理到結(jié)果分析等整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，用時(shí)控制在5 h以內(nèi)。綜上，利用優(yōu)化后的方法，檢測(cè)效率高，可有效用于鴨肉中的熒光假單胞菌的快速檢測(cè)。

表2 貯藏期間生鮮鴨肉產(chǎn)品中熒光假單胞菌的檢測(cè)結(jié)果表

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)假單胞菌快速檢測(cè)條件的優(yōu)化，得到的最佳退火溫度為60 ℃和探針濃度最佳為500 nmol·L-1，所構(gòu)建的熒光定量PCR方法的特異性、最低檢出限以及在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果的評(píng)估結(jié)果表明，該方法對(duì)鴨肉中的熒光假單胞菌具有極高的特異性和良好的擴(kuò)增效率，最低檢出限低至102CFU·g-1。根據(jù)檢測(cè)出的Cq值，可對(duì)假單胞菌污染程度不同的樣品進(jìn)行良好的區(qū)分，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間控制在5 h以內(nèi)，檢測(cè)效率高。本文為熒光假單胞菌的快速檢測(cè)提供了一種可行的方法，有利于更加準(zhǔn)確快速地掌握假單胞菌的生長(zhǎng)或動(dòng)態(tài)變化，保障冷鮮鴨肉在生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)的質(zhì)量與安全性。