管卓龍，彭 超

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北武漢 430040）

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都屬于酰胺醇類抗生素[1]。它們的化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，在使用過該藥物的動(dòng)物組織中極易形成殘留，曾廣泛應(yīng)用于食品性動(dòng)物的疾病預(yù)防與治療，但是它們對(duì)人、畜有一定的毒副作用，如對(duì)骨髓造血機(jī)能有抑制作用，產(chǎn)生血液系統(tǒng)毒性誘發(fā)可逆性的血細(xì)胞減少、不可逆的再生障礙性貧血等[2-4]，尤其以致命的“灰嬰綜合癥”對(duì)嬰幼兒生命健康造成嚴(yán)重的威脅[5]。因此，許多國(guó)家已禁止將其應(yīng)用于食品動(dòng)物中，我國(guó)獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 31650—2019[6]規(guī)定氯霉素為禁止使用的藥物，在動(dòng)物源性食品中不得檢出；甲砜霉素、氟苯尼考在牛和羊等動(dòng)物性食品中的限量分別為50 μg·kg-1、200～3 000 μg·kg-1，但規(guī)定泌乳期禁用。嬰幼兒配方乳粉的主要原料為牛奶或羊奶，導(dǎo)致乳粉中酰胺醇類抗生素存在安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，建立嬰幼兒配方乳粉中酰胺醇類藥物殘留的快速準(zhǔn)確定量分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、二級(jí)質(zhì)譜可有效排除假陽性、分析通量高等優(yōu)勢(shì)，在食品領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛。目前現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[7-11]中用于酰胺醇類藥物殘留檢測(cè)的液相色譜-質(zhì)譜法主要針對(duì)水產(chǎn)品、禽畜及其副產(chǎn)品和牛奶，檢測(cè)范圍有限，且有的只能檢測(cè)一種藥物，主要采用固相萃取技術(shù)凈化，試劑消耗大、檢測(cè)周期長(zhǎng)，不適用于大批量樣品的快速檢測(cè)。QuEChERS前處理技術(shù)因快速、簡(jiǎn)單、價(jià)廉、高效、耐用和安全已廣泛應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域，主要有C18、PSA和GCB等常用吸附劑，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)常規(guī)QuEChERS方法在嬰幼兒配方乳粉中酰胺醇類藥物的分析檢測(cè)效果并不理想。

氧化鋅是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且具有寬能帶隙的新型吸附劑。由于鋅原子的不穩(wěn)定性，外層電子共享可以形成強(qiáng)烈的分子間作用力，從而產(chǎn)生吸附效應(yīng)[12]。氧化鋅粉末比表面積大、吸附容量大，在重金屬和有機(jī)物的吸附、農(nóng)藥的測(cè)定中有一定程度的應(yīng)用[13]。然而，很少有研究關(guān)注使用氧化鋅作為復(fù)雜食品基質(zhì)的QuEChERS吸附劑。本研究使用新型吸附材料ZnO與C18作為QuEChERS吸附劑純化嬰幼兒配方乳粉樣品，結(jié)合HPLC-MS /MS的靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，建立了嬰幼兒配方乳粉中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考快速準(zhǔn)確分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

嬰幼兒配方粉25批次（8批次1段，8批次2段，9批次3段）均購(gòu)于武漢本地商超。

1.2 試劑

氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)FN）、甲砜霉素（Thiamphenicol,TAP）、氯 霉 素（Chloramphenicol，CAP）（純度均大于99.31%），德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（Primary Secondary Amine，PSA）（40～60 μm），中國(guó)ANPEL公司；石墨化炭黑（Graphitized Carbon Black，GCB）（40～120 μm），中 國(guó)ANPEL公司；氧化鋅（Zinc oxide，ZnO）（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑公司；硅膠鍵合氧化鋯（Zirconia Separation，Z-Sep）（粉末），德國(guó)西格瑪奧德里奇公司；乙酸乙酯、甲醇、乙腈（色譜純），上海ANPEL公司；NaCl（分析純），上海國(guó)藥試劑公司。

1.3 設(shè)備

AB SCIEX Triple Quad 4500質(zhì)譜儀，上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司；LC 30A液相色譜儀，日本島津公司；ALLEGRA 64R 離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；VXMNAL渦旋振蕩儀，常州奧豪斯儀器公司；SK8200LHC超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器公司；EFAA-DC24-RT氮吹儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)公司；Milli-Q超純水，USA Milipore公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.0 mg，用乙腈定容至50 mL，使 各 目 標(biāo) 物 濃 度 均 為100 μg·mL-1，于-18 ℃保存。定量分析時(shí)用空白基質(zhì)溶液稀釋成0.05 ng·mL-1、0.10 ng·mL-1、0.20 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1和10.00 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.001 g）乳粉樣品于50 mL離心管中，加入3.0 mL水分散樣品，再加入10.0 mL乙腈，振蕩提取10 min，超聲提取10 min，加入1.0 g NaCl，渦旋混勻，4 ℃條件下4 000 r·min-1離心5 min，上清液全部轉(zhuǎn)移至12 mL離心管中，準(zhǔn)確加入100 mg ZnO、20 mg C18，振蕩10 min后于4 ℃條件下4 000 r·min-1離心5 min，上清液氮?dú)獯蹈?，?.0 mL 10%乙腈水溶解殘?jiān)?，過0.22 μm尼龍濾膜，待測(cè)。

1.4.3 LC-MS儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱為Waters XBridge C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；流速0.3 mL·min-1；流動(dòng)相組成為A水，B乙腈。

（2）質(zhì)譜參數(shù)。ESI負(fù)離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；電噴霧電壓（IS） -4 500 V；氣簾氣（CUR）壓力40 psi；霧化氣（GS1）壓力50 psi；輔助加熱氣（GS2）壓力50 psi；碰 撞 氣 體（CAD）Medium；離子源溫度（TEM） 500 ℃。各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 分析物的母離子、子離子等重要參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

獸藥殘留分析時(shí)常用的溶劑有乙腈、甲醇和乙酸乙酯等。為保證提取效率，乳粉中需先加少量水以達(dá)到分散基質(zhì)的作用。本研究在添加3 mL水溶解乳粉樣品后，考察了10 mL乙腈、10 mL甲醇、10 mL乙酸乙酯對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率。由圖1可知，使用乙腈作為提取溶劑時(shí)，3種酰胺醇類藥物的回收率均高于其他兩種溶劑。甲醇提取時(shí)，提取液渾濁，不易與水分離且較黏稠；乙酸乙酯、乙腈作為提取試劑時(shí)，其共萃物都能與水分層，但乙酸乙酯脂溶性較強(qiáng)，導(dǎo)致奶粉乳化嚴(yán)重，使目標(biāo)物回收率偏低；乙腈極性更強(qiáng)且具有沉淀蛋白作用。故該實(shí)驗(yàn)最終選擇10 mL乙腈作為提取劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

2.2 凈化用吸附劑的選擇及其用量的確定

奶粉基質(zhì)復(fù)雜，富含脂類、糖類、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等干擾物質(zhì)，痕量分析時(shí)易產(chǎn)生明顯的基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)考察了C18、PSA和GCB等常用凈化劑和新材料ZnO、Z-Sep等對(duì)目標(biāo)化合物的凈化效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PSA、GCB和Z-Sep對(duì)甲砜霉素具有較強(qiáng)的吸附作用，回收率低，排除使用。采用C18和ZnO作為凈化劑時(shí)平均回收率分別為61.8%、81.4%。進(jìn)一步考察C18和ZnO兩種吸附劑用量和組合對(duì)目標(biāo)化合物的影響。由圖2可知，在20 mg C18和100 mg ZnO時(shí)凈化效果最佳，基質(zhì)干擾最小，目標(biāo)化合物的回收率均大于85%。因此，實(shí)驗(yàn)最終采用20 mg C18+100 mg ZnO的組合吸附劑對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

圖2 不同凈化劑組合對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）是液質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)普遍存在的情況，指樣品中基質(zhì)組分對(duì)分析物的干擾，由共流出物干擾分析物離子化導(dǎo)致，分為基質(zhì)抑制和增強(qiáng)效應(yīng)。ME=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME為0.85～1.15時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；當(dāng)ME＞1.15時(shí)，存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME＜0.85時(shí)，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)[14]。本實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化的色譜分離和樣品凈化條件，由表2可知，在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)方法下，CAP （ME=0.98）和FFN（ME=0.92）基質(zhì)效應(yīng)不明顯，TAP（ME=0.71）存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，故本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

表2 3種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

用空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為0.05～10.00 ng·mL-1的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按本實(shí)驗(yàn)確定的條件進(jìn)行測(cè)定，以各目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，3種目標(biāo)物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999（表2）。對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定，分別以3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限，以10倍信噪比（S/N）計(jì)算定量限，實(shí)驗(yàn)測(cè)得3種目標(biāo)物檢出限均為0.02 μg·kg-1，定量限為0.05 μg·kg-1。3種目標(biāo)物的提取離子流圖如圖3所示。

圖3 嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流圖

2.5 回收率和精密度

取空白奶粉樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加濃度分別為L(zhǎng)OQ、2 LOQ、10 LOQ，每個(gè)濃度均為6平行實(shí)驗(yàn)，以考察方法的回收率和精密度（以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示RSD）。由表3可知，3種目標(biāo)物的平均回收率為83.62%～96.45%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%～9.46%，方法回收率穩(wěn)定，精密度高，完全滿足嬰幼兒配方乳粉中3種酰胺醇類抗生素污染監(jiān)測(cè)的要求。

表3 分析物的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用建立的方法測(cè)定了25批次嬰幼兒配方乳粉樣品（8批次1段嬰兒配方奶粉，8批次2段幼兒配方奶粉，9批次3段幼兒配方奶粉），CAP和TAP均為未檢出，2批次3段乳粉中檢出FFN，測(cè)定值分別為0.124 μg·kg-1、0.112 μg·kg-1。為進(jìn)一步驗(yàn)證，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》（GB/T 22338—2008）[7]對(duì)陽性樣品進(jìn)行復(fù)測(cè)，結(jié)果分別為0.119 μg·kg-1、0.115 μg·kg-1，偏差分別為4.20%、-2.61%，表明建立的方法適用于嬰幼兒配方乳粉中3種酰胺醇類抗生素的測(cè)定。

3 結(jié)論

嬰幼兒是食品敏感性高的特殊群體，嬰幼兒配方乳粉又是其主要膳食營(yíng)養(yǎng)來源之一，該產(chǎn)品中若檢出抗生素氟苯尼考，存在較大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)問題。針對(duì)嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)特點(diǎn)，克服傳統(tǒng)固相萃取凈化耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑消耗大等問題。本研究以乙腈為提取溶劑，以100 mg ZnO+20 mg C18為吸附劑，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，建立了氧化鋅QuEChERS前處理技術(shù)同時(shí)快速測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中3種酰胺醇類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。實(shí)驗(yàn)表明，該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，可以很好地滿足嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)的出廠檢測(cè)需求，同時(shí)也可應(yīng)用于生產(chǎn)企業(yè)對(duì)原料乳的質(zhì)量把關(guān)，對(duì)于乳粉行業(yè)的日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。