謝遼遼，丁云龍，鄧慧琳，吳念，田星,2*

1(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410208)2(湖南省康德佳林業(yè)科技有限責(zé)任公司，湖南 永州，425600)3(中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)湖南有限公司，湖南 長(zhǎng)沙，410007)

如今，牛奶過(guò)敏、乳糖不耐癥、高膽固醇血癥以及對(duì)素食主義的青睞等影響了消費(fèi)者對(duì)于牛乳替代品的選擇[1]。盡管以乳制品為基礎(chǔ)的功能性食品種類非常豐富，但植物源性乳作為乳制品的可持續(xù)替代品，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及能夠緩解畜牧業(yè)對(duì)環(huán)境的巨大壓力而受到廣泛關(guān)注[2]?！?020～2025年中國(guó)植物蛋白飲料行業(yè)市場(chǎng)需求與投資規(guī)劃分析報(bào)告》指出，在食品行業(yè)未來(lái)幾年的發(fā)展中，植物乳制品將有希望保持20%以上的平均增長(zhǎng)速度。植物基蛋白發(fā)酵酸奶是以大豆、椰子等植物原料作為基底，輔以代糖、檸檬酸等其他原料，經(jīng)菌株發(fā)酵后得到的酸奶[3]。而作為一種優(yōu)質(zhì)植物源性原料，大豆具有高蛋白營(yíng)養(yǎng)、植物甾醇和多不飽和脂肪酸以及低成本效益等特點(diǎn)[4]，同時(shí)其所含的肽類已被證明具有抗氧化、抗癌、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和胰島素調(diào)節(jié)等特性，因此，大豆成為了近年來(lái)功能性食品研究的新熱點(diǎn)。

對(duì)發(fā)酵乳制品中微生物多樣性的研究，傳統(tǒng)方法在多數(shù)情況下采用分離培養(yǎng)，但是在各種環(huán)境樣品中僅有小于1%的微生物能獲得純培養(yǎng)。而如變性梯度凝膠電泳、熒光原位雜交等傳統(tǒng)免培養(yǎng)技術(shù)能檢測(cè)到的微生物種類有限且準(zhǔn)確性低?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)的宏基因組學(xué)技術(shù)則可對(duì)生態(tài)位中提取的所有微生物DNA進(jìn)行深度測(cè)序和分析，鑒定其物種組成、菌群結(jié)構(gòu)和表征群落豐度，具有讀長(zhǎng)高、精度高、通量高、無(wú)偏性等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，技術(shù)的發(fā)展和成熟也使得高通量測(cè)序更多地用于乳制品及其他領(lǐng)域微生物群落分析，如用高通量測(cè)序研究腌制麻竹筍中細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)演替[5]；分析新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬的微生物群落多樣性[6]；分析西藏牦牛酸奶菌群多樣性[7]；評(píng)價(jià)不同飼料源附近生微生物群及其對(duì)納皮爾草發(fā)酵品質(zhì)和微生物多樣性的影響[8]。

目前對(duì)酸奶微生物多樣性的研究多數(shù)以牛乳為原料，對(duì)植物蛋白發(fā)酵酸奶與動(dòng)物蛋白發(fā)酵酸奶進(jìn)行對(duì)比的研究甚少，而進(jìn)一步開(kāi)發(fā)植物蛋白中特殊的微生物資源將逐漸成為研究的熱點(diǎn)。植物蛋白酸奶雖然具有廣闊的發(fā)展前景，但仍要解決營(yíng)養(yǎng)不均衡、發(fā)酵體系不穩(wěn)定等問(wèn)題[1]。本研究通過(guò)對(duì)黃豆發(fā)酵酸奶和牛乳發(fā)酵酸奶中菌群組成、結(jié)構(gòu)和群落差異進(jìn)行分析，探究植物蛋白與動(dòng)物蛋白發(fā)酵乳品中細(xì)菌多樣性之間的聯(lián)系，以期為開(kāi)發(fā)利用植物蛋白中微生物資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌酸奶發(fā)酵粉(經(jīng)典5菌型：保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌)，北京川秀科技有限公司；羅漢果糖，湖南華城生物資源股份有限公司；伊利無(wú)菌磚純牛奶，長(zhǎng)沙市沃爾瑪超市；FastDNA?Spin Kit for Soi DNA抽提試劑盒，美國(guó)MP Biomedicals 公司；NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)試劑盒，美國(guó)Bioo Scientific公司；biowest agArose瓊脂糖，西班牙biowest公司；MiSeq Reagent Kit v3測(cè)序試劑盒，美國(guó)Illumina公司；FastPfu Polymerase，中國(guó)TransGen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N13462C移液器、5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；ABSON MiFly-6小型離心機(jī)，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；GeneAmp?9700 PCR儀，美國(guó)ABI公司；QuantusTMFluorometer微型熒光計(jì)，美國(guó)Promega公司；Illumina MiSeq測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司；ELx800酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek公司；TL-48R粉碎研磨儀，上海萬(wàn)柏生物科技有限公司；QL-901旋渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 純黃豆、純牛乳發(fā)酵酸奶的制備

以純黃豆發(fā)酵酸奶為例，黃豆冷水浸泡10 h后熱開(kāi)水浸泡15 min，榨汁并加入1.5 g瓊脂，過(guò)濾后加入13 g羅漢果糖，經(jīng)25～30 MPa均質(zhì)處理后95 ℃高溫滅菌10 min，待混合物降溫至40 ℃，接種1.0 g乳酸菌發(fā)酵粉進(jìn)行發(fā)酵處理，于42 ℃恒溫發(fā)酵6.5 h，經(jīng)殺菌包裝后于低溫下冷藏保存。牛乳發(fā)酵酸奶原料采用牛乳替代黃豆汁，其余流程與純黃豆發(fā)酵酸奶相同，無(wú)糖樣本不添加羅漢果糖。黃豆發(fā)酵酸奶制備工藝流程如圖1所示。取1～2 g酸奶樣本置于無(wú)菌凍存管中，做3個(gè)平行，共12個(gè)樣本于-80 ℃保存。

圖1 純黃豆發(fā)酵酸奶制備工藝流程圖Fig.1 The production process flow chart of soy fermented yoghurt

1.3.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

水分含量參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法測(cè)定；灰分含量參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》；脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》索氏抽提法測(cè)定；蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法測(cè)定；碳水化合物含量通過(guò)組分總量減去水分、灰分、脂肪和蛋白質(zhì)的組分含量測(cè)得；鈉含量參照GB 5009.91—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉀、鈉的測(cè)定》中的火焰原子吸收光譜法測(cè)定。

1.3.3 菌群DNA抽提和PCR擴(kuò)增測(cè)序

酸奶菌群DNA提取參照李薇等[5]、戈子龍等[9]的方法稍作改良。以338F-806R(468 bp)為引物，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3-V4可變區(qū)。PCR擴(kuò)增具體體系為5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer 0.8 μL、Reverse Primer 0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、Template DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增具體程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s重復(fù)進(jìn)行27次，72 ℃延伸10 min。Picogreen染料熒光計(jì)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量均一化混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Miseq PE300平臺(tái)測(cè)序。上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成PCR擴(kuò)增及測(cè)序工作。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 25.0軟件對(duì)理化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；诿兰镌破脚_(tái)對(duì)環(huán)境微生物群落進(jìn)行交互式分析并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。質(zhì)控采用FASTP軟件[10]，拼接在FLASH軟件[11]上進(jìn)行。根據(jù)97%[12-13]的相似度在UPARSE軟件[13]上對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)聚類、剔除嵌合體。通過(guò)RDP classifier[14]進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)閾值70%(Silva 16SrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)-v138)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序信息統(tǒng)計(jì)

通過(guò)測(cè)序12個(gè)樣品共產(chǎn)生564 314個(gè)序列數(shù)。去除葉綠體、線粒體等背景污染、抽平序列后的有效序列數(shù)為557 197，平均長(zhǎng)度為428 bp，其中純黃豆發(fā)酵酸奶有271 452個(gè)序列數(shù)，純牛乳發(fā)酵酸奶有285 745個(gè)序列數(shù)。通過(guò)OTU聚類，總共匯聚成116個(gè)OTU。詳細(xì)數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 1 The statistical table of sequencing data results

2.2 純黃豆、牛奶發(fā)酵酸奶菌群多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線和α-多樣性分析

當(dāng)測(cè)序深度逐漸增加時(shí)，稀釋曲線趨近于平緩(圖2)，2組發(fā)酵酸奶樣本在測(cè)序覆蓋度上沒(méi)有顯著差異，所有測(cè)序覆蓋度高于99.99%以上，說(shuō)明對(duì)純黃豆、純牛乳發(fā)酵酸奶微生物群落的檢測(cè)率接近飽和，測(cè)序量能夠覆蓋酸奶中的絕大部分物種。

圖2 Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.2 The Shannon exponential dilution curve

對(duì)純黃豆發(fā)酵酸奶(SY)和純牛乳發(fā)酵酸奶(LR2)微生物群落多樣性指數(shù)進(jìn)行分析(表2)。指數(shù)組間差異檢驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

表2 基于T檢驗(yàn)的α-多樣性指數(shù)表Table 2 α-Diversity index table based on T test

圖3 指數(shù)組間差異檢驗(yàn)柱形圖Fig.3 Histogram of difference test between index groups注：***表示存在極顯著性差異(P<0.01)

兩組樣本檢測(cè)到包括Chao指數(shù)(P=0.907 6)和Ace指數(shù)(P=0.459 1)的群落OTU豐富度沒(méi)有顯著性差異。然而，兩組樣本的群落多樣性指數(shù)，包括Shannon指數(shù)(P≤0.001)和Simpson指數(shù)(P≤0.001)具有極顯著性差異，表明黃豆發(fā)酵酸奶細(xì)菌多樣性高于牛乳發(fā)酵酸奶。

2.2.2 Beta多樣性分析

純黃豆、純牛乳發(fā)酵酸奶通過(guò)置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA)，黃豆樣本、牛乳樣本組間菌群結(jié)構(gòu)差異極顯著大于組內(nèi)差異(R=0.577 8，P=0.003<0.01)(圖4)，本次實(shí)驗(yàn)分組具有意義。

圖4 基于Bray-Curtis的組間距離盒狀圖Fig.4 The box plot of distance between groups based on Bray-Curtis

主坐標(biāo)分析結(jié)果表明(圖5)，在OTU水平上，黃豆樣本、牛乳樣本分別聚集在一起(R2=0.207 5，P=0.039)，第1主成分對(duì)樣本菌群結(jié)構(gòu)差異解釋度所占比重為39.15%，第2、第3主成分分別為21.13%、14.37%，黃豆樣本與牛乳樣本組間群落組成差異極其顯著(P<0.05)。

圖5 基于unweighted_unifrac的細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析3D圖Fig.5 The PCoA-3D of bacterial community based on unweighted_unifrac

2.3 純黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中營(yíng)養(yǎng)成分和細(xì)菌菌群的組成及差異分析

2.3.1 營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)分析

如表3所示，水分、脂肪和碳水化合物的含量在黃豆樣本和牛乳樣本中有顯著性的差異；黃豆無(wú)糖、牛乳無(wú)糖樣本水分含量明顯高于黃豆代糖、牛乳代糖樣本；黃豆無(wú)糖、牛乳無(wú)糖樣本碳水化合物含量遠(yuǎn)低于黃豆代糖、牛乳代糖樣本。由此可知，原料不同對(duì)于發(fā)酵酸奶中主要營(yíng)養(yǎng)組分的含量具有一定的影響。

表3 黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)分析 單位：g/100 g

2.3.2 細(xì)菌菌群的組成及差異分析

通過(guò)菌群組成分析，屬水平上共測(cè)得12個(gè)屬(圖6-a)，鏈球菌屬(Streptococcus)在黃豆樣本和牛乳樣本菌群中均占主要優(yōu)勢(shì)。除鏈球菌屬外(圖6-b)，芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)僅在黃豆樣本中存在；棒狀桿菌屬(Corynebacterium)僅在黃豆無(wú)糖5(SY_5)樣本中存在；伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)僅在牛乳樣本中存在；摩根氏菌屬(Morganella)、漫游球菌屬(Vagococcus)、假紅桿菌屬(Pseudorhodobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、泰式菌屬(Tissierella)在黃豆樣本和牛乳樣本中均存在。鏈球菌屬以及乳桿菌屬在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行微弱的水解作用，有助于維持較高的發(fā)酵活性，經(jīng)常用于混合發(fā)酵以制備大豆酸奶[15]。門水平上，共測(cè)得2個(gè)門：厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，其中厚壁菌門在黃豆、牛乳樣本中均占主要優(yōu)勢(shì)，這與張敏等[16]對(duì)酸奶中微生物多樣性的研究結(jié)果相一致。

通過(guò)LEfSe多級(jí)物種層級(jí)分析顯示(圖7-a)，從目水平來(lái)看，芽孢桿菌目(Bacillales)在黃豆樣本顯著富集，而在牛乳樣本大量富集乳酸桿菌目(Lactobacillales)；從種水平來(lái)看，枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus

a-屬水平上細(xì)菌群落；b-隱去鏈球菌屬的細(xì)菌群落圖6 屬水平下的群落柱狀圖Fig.6 The histogram of the community at the genus level

subtilissubsp.subtilis)在黃豆樣本顯著富集，牛乳樣本唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcussalivariussubsp.thermophilus)顯著富集。線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)(LDA閾值>1.0)(圖7-b)表明，對(duì)牛乳、黃豆樣本菌群結(jié)構(gòu)差異具有顯著影響的物種主要包括芽孢桿菌屬(Bacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)(P<0.01)。

a-LEfSe多級(jí)物種層級(jí)分析;b-LDA圖圖7 純黃豆、純牛乳發(fā)酵酸奶菌群差異分析圖Fig.7 The difference analysis of bacterial flora between pure soybean and pure milk fermented yoghurt

2.3.3 主要營(yíng)養(yǎng)成分與優(yōu)勢(shì)菌屬的相關(guān)性分析

通過(guò)SPSS 25.0和TB tools軟件，將黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中主要營(yíng)養(yǎng)成分含量與其菌群中主要優(yōu)勢(shì)菌屬(鏈球菌屬)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析(圖8)?？芍?、脂肪和碳水化合物含量與菌群優(yōu)勢(shì)菌屬豐度值呈極顯著相關(guān)；蛋白質(zhì)、鈉含量與菌群優(yōu)勢(shì)菌屬不相關(guān)(P>0.05)。結(jié)合營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)分析數(shù)據(jù)(表3)可推測(cè)得，原料中有無(wú)添加植物代糖對(duì)黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中細(xì)菌菌群種類有一定的影響，后續(xù)對(duì)此結(jié)論進(jìn)行了深入的分析與證實(shí)。

圖8 酸奶組分與主要菌群菌屬相關(guān)性熱圖Fig.8 Heat map of correlation between yogurt components and flora

2.4 植物代糖對(duì)黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中微生物菌群的影響

本研究從是否添加代糖的角度對(duì)2組樣本進(jìn)行層級(jí)聚類(圖9)，添加代糖樣本(SY_4、SY_5、SY_6、LR2_4、LR2_5、LR2_6)，未添加代糖樣本(SY_1、SY_2、SY_3、LR2_1、LR2_2、LR2_3)。根據(jù)分析結(jié)果，共聚成兩大分支，第一大分支為黃豆無(wú)糖樣本，第二大分支為其他樣本。第二大分支中，6個(gè)牛乳樣本所屬同一個(gè)小分支，不論有無(wú)植物代糖，6個(gè)樣本分支距離皆小，說(shuō)明樣本特征值組成差異較小，即對(duì)于純牛乳發(fā)酵酸奶，添加代糖與否對(duì)菌群差異的影響較?。挥刑屈S豆樣本分別屬于2個(gè)小分支,其中SY_2無(wú)糖與SY_5有糖黃豆樣本屬于同一小分支的原因還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。可初步判定，有無(wú)添加植物代糖對(duì)黃豆樣本群落組成有一定的影響。因此，可從有無(wú)添加植物代糖的角度對(duì)豆類等植物源性發(fā)酵酸奶中植物代糖對(duì)人體腸道菌群的影響。

圖9 基于Bray-Curtis的樣本層級(jí)聚類樹(shù)Fig.9 The sample level clustering tree on Bray-Curtis

2.5 對(duì)黃豆、牛乳樣本中微生物群落功能組成的預(yù)測(cè)

普通酸奶是牛奶經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵而成，有改善腸道微環(huán)境的作用[17]，但以植物蛋白為原料的發(fā)酵酸奶對(duì)人體腸道菌群、健康功能的影響目前所知甚少。本研究對(duì)牛乳與黃豆樣本菌群KEGG pathway進(jìn)行功能組成分析，得到的KEGG功能預(yù)測(cè)信息組成基本相同(圖10)，12份樣品的細(xì)菌群落組成雖存在明顯差異(圖6)，但基因功能一致，只是部分功能豐度變化有所不同，原因可能是不同菌群所具有的基因功能具有相似性[18]。

圖10 KEGG功能熱圖Fig.10 The heat map of KEGG functions

菌群基因大多與碳水化合物代謝(9.93%)、氨基酸代謝(7.43%)、翻譯功能(3.91%)以及能量轉(zhuǎn)換(3.04%)有關(guān)，這與前人的研究結(jié)果具有相似性[19]，表明在發(fā)酵酸奶細(xì)菌基因組中包含大量參與蛋白質(zhì)、碳水化合物代謝相關(guān)的基因。黃豆、牛乳樣本具體在以下4個(gè)功能中豐度變化顯著不同：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(cell motility)、癌癥：特定類型(cancer:specific types)、排泄系統(tǒng)(excretory system)、物質(zhì)依賴(substance dependence)，且在黃豆酸奶樣本中豐度值均遠(yuǎn)大于在牛乳酸奶樣本中，這與前人的研究結(jié)果有一定的關(guān)聯(lián)性，即食用豆制品被證明可以降低患心血管疾病[20]、癌癥(乳腺癌和前列腺癌)和骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)，但不能明確地表明作用機(jī)制，應(yīng)該進(jìn)一步研究驗(yàn)證植物蛋白發(fā)酵酸奶為腸道菌群變化而帶來(lái)的健康益處及具體作用機(jī)制。

3 結(jié)論

黃豆發(fā)酵酸奶細(xì)菌多樣性顯著高于牛乳發(fā)酵酸奶，黃豆發(fā)酵酸奶與牛乳發(fā)酵酸奶組間菌群結(jié)構(gòu)及群落組成差異極其顯著。對(duì)黃豆、牛乳樣本菌群結(jié)構(gòu)差異有顯著影響的物種主要包括鏈球菌屬和芽孢桿菌屬，鏈球菌屬在黃豆、牛乳樣本中均為優(yōu)勢(shì)屬。初步判定，有無(wú)添加植物代糖對(duì)純黃豆發(fā)酵酸奶群落組成有一定的影響，可從此方面對(duì)其進(jìn)行更深入的探究。KEGG pathway功能組成分析發(fā)現(xiàn)，在以下4個(gè)功能中樣本豐度變化顯著不同：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、癌癥：特定類型、排泄系統(tǒng)、物質(zhì)依賴，且從豐度值來(lái)看，黃豆樣本中均遠(yuǎn)大于牛乳樣本，此發(fā)現(xiàn)可為后續(xù)對(duì)植物蛋白基因功能等方面的深入探究提供參考。因此，本研究通過(guò)對(duì)純黃豆、牛乳發(fā)酵酸奶中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，為探究植物蛋白與動(dòng)物蛋白發(fā)酵乳品中細(xì)菌多樣性之間的聯(lián)系提供借鑒。植物基發(fā)酵酸奶有很大潛力成為一種新型的功能性食品，然而隨著消費(fèi)者偏好的變化和發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)步，需要對(duì)植物蛋白乳制品及其他發(fā)酵食品中的微生物資源進(jìn)行更深層次研究，以優(yōu)化植物蛋白酸奶發(fā)酵工藝條件以及菌種優(yōu)良選育，改善人體腸道健康以及自然環(huán)境可持續(xù)發(fā)展。