葉芳兵 朱寶菊

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南鄭州 450014

侵入性胎盤是子宮內(nèi)膜不全或損傷導(dǎo)致子宮蛻膜缺陷，使胎盤絨毛異常侵入甚至穿透子宮肌層的病理現(xiàn)象[1]。侵入性胎盤的主要發(fā)病因素包括剖宮產(chǎn)史和前置胎盤。隨著剖宮產(chǎn)率的增加及子宮肌瘤剔除等宮腔操作手術(shù)的增加，全球范圍內(nèi)侵入性胎盤疾病的發(fā)病率持續(xù)增加，從40 年前的1/30 000 增加為1/300[2-3]。侵入性胎盤是導(dǎo)致產(chǎn)后出血、休克、子宮切除甚至死亡等產(chǎn)科嚴(yán)重并發(fā)癥的重要原因[4]。而且侵入性胎盤起病隱匿，處理時(shí)被動(dòng)且棘手，給產(chǎn)科醫(yī)生帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。了解侵入性胎盤疾病的具體發(fā)生機(jī)制，從分子水平上尋求該病的標(biāo)志物，以期盡早發(fā)現(xiàn)、診斷甚至治療該病有重大意義。

侵入性胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生與腫瘤細(xì)胞侵襲類似的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）過(guò)程[5]，推測(cè)侵入性胎盤疾病的具體發(fā)生機(jī)制可能與一系列具有EMT 特征性的因子調(diào)控相關(guān)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）、胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA 結(jié)合蛋白2（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 2，IGF2BP2）及高遷移率族蛋白A2（high mobility group A2，HMGA2）不僅參與腫瘤細(xì)胞EMT 過(guò)程在其侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且參與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)遷移的調(diào)控。本研究通過(guò)檢測(cè)以上3 種因子在侵入性胎盤組織中的表達(dá)，初步探討其與侵入性胎盤疾病的發(fā)生關(guān)系，以便為該病的早期預(yù)測(cè)及診療提供新的醫(yī)學(xué)思路及臨床方法提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年3 月至12 月于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）產(chǎn)科分娩并確診為侵入性胎盤疾病的孕婦23 例為侵入性胎盤組，同期正常妊娠孕婦29 名為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合侵入性胎盤診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；②受試者及其家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴妊娠糖尿病、感染、免疫類疾病及妊娠高血壓等并發(fā)癥；②合并腫瘤、各器官功能障礙等。侵入性胎盤組分娩孕齡小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；兩組年齡、孕次、宮腔操作次數(shù)（包括剖宮產(chǎn)、其他子宮手術(shù)、清宮術(shù)）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表1。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021322）。

表1 兩組一般資料比較[M（P25，P75）]

1.2 研究方法

兩組于胎盤娩出30 min 內(nèi)避開出血壞死、鈣化區(qū)域，剪取粘連植入病灶中心區(qū)域或正常胎盤母體面靠近臍帶的中央組織2 塊，大小約1 cm×1 cm×1 cm，經(jīng)無(wú)菌0.9%氯化鈉液漂洗后，所有組織均保存在液氮中。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 Western blot 取適量待測(cè)樣本，將其放在滅菌后的缽體中研磨，取準(zhǔn)備好的磷酸鹽緩沖液處理樣本，取適量的細(xì)胞裂解液與處理后的樣本混勻并破碎細(xì)胞；室溫下12 000 r/min 離心15 min（離心半徑為21 cm），取上清液。制備BCA 液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。應(yīng)用SDS-PAGE 系統(tǒng)對(duì)獲得的總蛋白電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行PVDF 轉(zhuǎn)膜。將PVDF 膜封閉1 h 加入一抗（1∶1 000 稀釋）和二抗（1∶1 000 稀釋），使用ECL 試劑盒處理后，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像并保存條帶圖像。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR 取適量待測(cè)樣本加入液氮研磨粉碎，加入1 ml Trizol 提取總RNA，并進(jìn)行RNA 濃度和純度的檢測(cè)。使用invitrogen 的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒superscript Ⅲ合成cDNA，取2 μl cDNA 作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。引物序列包括Actin 正向引物：5’-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCC-3’，反向引物：5’-CATACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’（22 bp）；MMP2 正向引物：5’-AGTTTCCATTCCGCTTCCAG-3’，反向引物：5’-CACCTTCTGAGTTCCCACCAA-3’（20 bp）；IGF2BP2正向引物：5’-GAAGCCTGTCACCATCCA-3’，反向引物：5’-GGTCTCATCTGCCTCTTTC-3’（18 bp）；HMGA2正向引物：5’-TAGGAAATGGGCTGGAGTGG-3’，反向引物：5’-GGTGGTGGGTGCCTGTAATC-3’（20 bp）。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 min；95℃10 s，58℃20 s，72℃20 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的采用中位數(shù)（M）和四分位數(shù)（P25，P75）表示，比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組IGF2BP2、HMGA2、MMP2 蛋白表達(dá)比較

侵入性胎盤組IGF2BP2、HMGA2、MMP2 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 兩組IGF2BP2、HMGA2、MMP2 蛋白表達(dá)比較

2.2 兩組IGF2BP2、HMGA2、MMP2 mRNA 比較

侵入性胎盤組IGF2BP2、HMGA2、MMP2 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 兩組IGF2BP2、HMGA2、MMP2 mRNA 比較

3 討論

3.1 MMP2 在侵入性胎盤組織中的表達(dá)及意義

MMP2 屬于MMPs 家族，是一種鋅依賴的人體內(nèi)重要的蛋白水解酶，可以降解多種膠原蛋白，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移[6]。研究表明，MMP2 與腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制密切相關(guān)[7]，MMP2 可由滋養(yǎng)細(xì)胞分泌，是酶解子宮內(nèi)膜外基質(zhì)和基底膜的關(guān)鍵調(diào)控因子，可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞入侵子宮內(nèi)膜，是妊娠早期調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程的關(guān)鍵酶[8]。Ding 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MMP2 低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力下調(diào)，子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不足，與子癇前期的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果與Kocarslan 等[10]研究結(jié)果相符。推測(cè)胎盤組織中MMP2 表達(dá)升高，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，細(xì)胞外基質(zhì)的降解增多，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵入肌層，可能導(dǎo)致侵入性胎盤的發(fā)生。

3.2 IGF2BP2 在侵入性胎盤組織中的表達(dá)及意義

IGF2BP2 屬于IGF2BP 結(jié)合蛋白家族，作為一種新發(fā)現(xiàn)的m6A 解讀器，具有直接結(jié)合靶基因的mRNA穩(wěn)定靶基因和促進(jìn)靶基因mRNA 蛋白翻譯的作用，參與多種生命活動(dòng)，并促進(jìn)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。IGF2BP2 可通過(guò)激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，來(lái)增殖和抗凋亡癌細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤增殖[12]。研究表明，IGF2BP2在多種癌癥如膽囊癌[13]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[14]等腫瘤組織中高表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)EMT 變化，在腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究顯示，IGF2BP2 在卵母細(xì)胞和早期胚胎中高表達(dá)，與受精卵的著床、胚胎發(fā)育有關(guān)[15]。

Wu 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP2 可以促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移，其蛋白水平在重度子癇前期患者胎盤中顯著降低。本研究結(jié)果顯示，侵入性胎盤組織中IGF2BP2 表達(dá)顯著升高。由此推測(cè)，其可能增強(qiáng)了滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力。Yang 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP2 在子癇前期患者胎盤組織中表達(dá)降低，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力減弱，胎盤淺著床。本研究與Yang 等[17]的研究結(jié)果相符。

3.3 HMGA2 在侵入性胎盤組織中的表達(dá)及意義

HMGA2 屬于HMGA 家族，是一種非組蛋白結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其通過(guò)“AT-hook”結(jié)構(gòu)與富含AT 的序列多種基因結(jié)合，并改變他們的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、EMT 及端粒修復(fù)等生物過(guò)程[18-19]。研究顯示，HMGA2 可在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)EMT 變化來(lái)調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和進(jìn)展[20-21]。Wei 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，HMGA2 在子宮內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌的早期促進(jìn)EMT，是子宮內(nèi)膜漿液性腺癌有用的生物標(biāo)志物。HMGA2 在滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，且在浸潤(rùn)母體蛻膜將胎盤體與子宮壁結(jié)合的高侵襲性的絨毛外細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)最強(qiáng)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGA2 基因在人類滋養(yǎng)細(xì)胞祖細(xì)胞向絨毛外細(xì)胞分化的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[24-25]。Abi Habib 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，HMGA2-PLAG1-IGF2 通路的遺傳破壞可導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限。這些均提示HMGA2 可能參與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程的調(diào)控。Burchardt 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，HMGA2 在妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)，而其在流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜中表達(dá)降低，表明HMGA2 表達(dá)水平降低，可導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)性下降，血管重鑄不足，與自然流產(chǎn)、胚胎停育等病理妊娠的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，侵入性胎盤組織中HMGA2 表達(dá)水平顯著升高。由此可知，HMGA2 在胎盤組織中高表達(dá)，可能與提高滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力及侵入性胎盤的形成有關(guān)。

綜上所述，MMP2、IGF2BP2 及HMGA2 在侵入性胎盤組織中高表達(dá)，促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度侵入子宮肌層，與侵入性胎盤的形成相關(guān)，可為侵入性胎盤的成因及臨床預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)。