陳 瑩 王玉美 徐文英 張佩瀅

1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院兒童保健科，江蘇淮安 223002；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院新生兒疾病篩查科，江蘇淮安 223002

隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的迅速發(fā)展，早產(chǎn)兒的生存率逐年提高，但多種因素導(dǎo)致早產(chǎn)兒，特別是極低出生體重兒宮外無(wú)法達(dá)到宮內(nèi)的生長(zhǎng)速度[1-2]，早期的營(yíng)養(yǎng)累積不足成為今后生長(zhǎng)缺陷及神經(jīng)發(fā)育落后的主要原因[3-4]。對(duì)早產(chǎn)兒及低出生體重兒生長(zhǎng)發(fā)育的縱向研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)早產(chǎn)兒在出生后幾個(gè)月至1 歲期間均存在不同程度的追趕生長(zhǎng)，尤其是生后6 個(gè)月[5]。對(duì)于適宜追趕生長(zhǎng)的定義，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，目前建議將小于胎齡早產(chǎn)兒>第10 百分位，適于胎齡早產(chǎn)兒的體重、身長(zhǎng)及頭圍達(dá)到校正年齡的第25～50 百分位定義為追趕生長(zhǎng)滿意[6]。亦有文獻(xiàn)以Z 評(píng)分差異≥0.67 定義為出現(xiàn)追趕生長(zhǎng)[7-9]。本研究以校正月齡6 月齡與出生體重Z 評(píng)分差值進(jìn)行分組，應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析，尋找不同生長(zhǎng)模式下的早產(chǎn)兒血清代謝物及代謝通路的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年3 月至2020 年12 月?lián)P州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院重癥監(jiān)護(hù)病房住院且兒童保健科門(mén)診隨訪至校正月齡6 月齡的55 例早產(chǎn)兒，其中男30 例，女25 例；出生胎齡27+3～33+6周；出生體重0.95～2.73 kg。按校正胎齡6 月齡時(shí)體重是否發(fā)生追趕生長(zhǎng)將其分為兩組，追趕生長(zhǎng)組（35 例），△Z 評(píng)分（校正胎齡6 月齡時(shí)體重的Z 評(píng)分-出生時(shí)體重的Z 評(píng)分）≥0.67；無(wú)追趕生長(zhǎng)組（20 例），△Z 評(píng)分（校正月齡6 月齡時(shí)體重的Z 評(píng)分-出生時(shí)體重的Z 評(píng)分）＜0.67。納入標(biāo)準(zhǔn)：①出生胎齡27～＜34 周；②生后24 h 內(nèi)入院；③出院后在兒童保健科門(mén)診定期隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有先天畸形和遺傳代謝病；②患有青紫型先天性心臟病或伴有心功能不全；③母親患有嚴(yán)重內(nèi)分泌及代謝性疾?。虎苎芯窟^(guò)程中出現(xiàn)嚴(yán)重疾?。ㄈ缒摱景Y、壞死性小腸結(jié)腸炎、嚴(yán)重代謝紊亂等）或死亡。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019063），且樣本采集獲得早產(chǎn)兒家屬的知情同意。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 超高效液相儀（Vanquish）、高分辨質(zhì)譜儀（Q Exactive HFX）、離心機(jī)（Heraeus Fresco17）購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific；天平（BSA124S-CW）購(gòu)于德國(guó)Sartorius；純水儀（明澈D24 UV）購(gòu)于德國(guó)Merck Millipore；超聲儀（PS-60AL）購(gòu)于深圳市雷德邦電子有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)用LC-MS 級(jí)純度的甲醇（X4730 432）、乙腈（Y7060432）、乙酸銨（BCCG1298）和氨水（7218060）由德國(guó)CNW Technologies 提供。

1.3 血清LC-MS/MS 檢測(cè)

1.3.1 提取代謝物 采集兩組早產(chǎn)兒血清2 ml 置于-80℃保存，按樣品∶提取液（甲醇、乙腈等體積混合）=1∶4（V/V）混合，加入同位素內(nèi)標(biāo)，渦旋超聲，40℃靜置1 h 后4℃離心，12 000 r/min 離心15 min，收集上清，為待測(cè)定標(biāo)本，另取所有樣品等量上清混合，為質(zhì)量控制標(biāo)本，分別上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 分離、檢測(cè)標(biāo)本 使用Vanquish（Thermo Fisher Scientific）超高效液相色譜儀和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜：A 相為水相（含25 mmol/L 乙酸銨和25 mmol/L 氨水），B 相為乙腈。梯度洗脫：0～0.5 min，95% B；0.5～7.0 min，95%→65%B；7.0～8.0 min，65%→40%B；8.0～9.0 min，40%B；9.0～9.1 min，40%→95%B；9.1～12.0 min，95%B。流速：0.5 ml/min，柱溫：30℃，樣品盤(pán)溫度：4℃，進(jìn)樣體積3 μl。質(zhì)譜參數(shù)：Spray voltage：+3.5 kV/-3.2 kV；Sheath gas flow rate：50 arb，Aux gas flow rate：10 arb；Capillary Temp：320℃；Full MS resolution：60 000，MS/MS resolution：7500，Collision energy：10/30/60 in NCE mode。

1.3.3 差異代謝物鑒定 血清樣本采用LC-MS/MS 技術(shù)，在正離子模式下進(jìn)行代謝組學(xué)分析，從原始數(shù)據(jù)中提取了6 210 個(gè)峰，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理后，仍剩下4 788 個(gè)峰。原始數(shù)據(jù)經(jīng)Proteo Wizard 軟件轉(zhuǎn)換后，通過(guò)自主編寫(xiě)的R 程序包進(jìn)行峰識(shí)別、提取和積分處理。建立主成分分析和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant，OPLS-DA），數(shù)據(jù)與BiotreeDB（V2.1）自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配并進(jìn)行物質(zhì)注釋（cut-off 值設(shè)為0.3）。差異代謝物篩選篩選條件：變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）＞1，且P ＜0.05。

1.3.4 差異代謝物相關(guān)通路分析 通過(guò)富集分析和拓?fù)浞治鰧?duì)差異代謝物所在通路進(jìn)行綜合分析，篩選出與代謝物差異相關(guān)性最顯著的關(guān)鍵通路。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的改用中位數(shù)（M），四分位間距（Q）表示，比較采用Mann-Whiteney U 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別及出生胎齡、體重、身長(zhǎng)、頭圍比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；兩組△Z 評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 血清代謝組學(xué)檢測(cè)與主成分分析質(zhì)量控制

2.2.1 主成分分析 主成分分析顯示，質(zhì)量控制基本聚在一起，樣本都在95%CI 內(nèi)，整個(gè)分析過(guò)程穩(wěn)定可靠、重復(fù)性良好，所得數(shù)據(jù)可用于下一步多元統(tǒng)計(jì)分析。見(jiàn)圖1。

圖1 主成分分析散點(diǎn)圖

2.2.2 OPLS-DA 分析 OPLS-DA 得到的分散點(diǎn)圖顯示，兩組代謝輪廓呈明顯聚類趨勢(shì)，說(shuō)明兩組早產(chǎn)兒代謝模式有所不同。見(jiàn)圖2。

圖2 正交偏最小二乘法分析散點(diǎn)圖

2.2.3 OPLS-DA 置換檢驗(yàn) 所得數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)200 次置換驗(yàn)證得到R2Y、Q2截距分別為0.65、-0.3，說(shuō)明原模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。見(jiàn)圖3。

圖3 正交偏最小二乘法分析的200 次響應(yīng)排序檢驗(yàn)

2.3 血清差異代謝物

火山圖顯示，與追趕生長(zhǎng)組比較，無(wú)追趕生長(zhǎng)組大多數(shù)代謝物在血清中上調(diào)，少部分代謝物在血清中下調(diào)，見(jiàn)圖4。共鑒定出244 種不同的代謝物，其中223 種表達(dá)上調(diào)，21 種下調(diào)。在人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索鑒定，剔除未知代謝物，共得到28 種主要差異代謝物，見(jiàn)表2。其中上調(diào)物質(zhì)27 種，主要為氨基酸類、甘油磷脂類、有機(jī)雜環(huán)化合物等；下調(diào)物質(zhì)1 種，屬脂肪酸類。

圖4 火山圖

2.4 差異代謝物相關(guān)通路分析

本研究共發(fā)現(xiàn)14 條關(guān)鍵代謝物途徑，依據(jù)拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃?0，以及代謝途徑的生物學(xué)作用，共篩選出10 條富集程度顯著的代謝通路，分別為精氨酸和脯氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，氨基酰-tRNA 的合成，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，硫胺素新陳代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，組氨酸代謝，苯丙氨酸代謝及賴氨酸降解代謝，其中涉及氨基酸代謝的有9 條。見(jiàn)圖5。

圖5 通路分析圖

3 討論

早產(chǎn)兒由于各系統(tǒng)發(fā)育不成熟，易引起機(jī)體內(nèi)激素分泌紊亂，如果能闡述早產(chǎn)兒某一時(shí)刻的代謝組學(xué)特點(diǎn)，對(duì)早產(chǎn)兒疾病的營(yíng)養(yǎng)支持及早期識(shí)別有很大幫助[10-12]。出院時(shí)為適于胎齡的早產(chǎn)兒，或在6 個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)并完成追趕生長(zhǎng)的早產(chǎn)兒，生長(zhǎng)和神經(jīng)發(fā)育結(jié)局較好[13]。因此，研究早產(chǎn)兒的不同追趕生長(zhǎng)模式，尤其是生后6 個(gè)月的生長(zhǎng)模式對(duì)早產(chǎn)兒生存質(zhì)量及遠(yuǎn)期預(yù)后至關(guān)重要。代謝組學(xué)通過(guò)篩選、研究疾病相關(guān)生物標(biāo)志物，對(duì)疾病的早期診斷和預(yù)后提供依據(jù)，揭示了飲食或營(yíng)養(yǎng)干預(yù)下機(jī)體的代謝變化[14-16]。

本研究結(jié)果顯示，不同生長(zhǎng)模式早產(chǎn)兒的血清代謝輪廓存在的差異，且有分類趨勢(shì)，血清差異代謝物通路主要集中在氨基酸的代謝與合成中。提示早產(chǎn)兒的氨基酸代謝過(guò)程和生理功能與其生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)生密切相關(guān)[17]，其中富集程度最顯著的代謝通路為精氨酸和脯氨酸代謝及谷胱甘肽代謝。研究顯示，精氨酸代謝與營(yíng)養(yǎng)在生長(zhǎng)、健康和疾病有關(guān)[18-19]，谷氨酰胺和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體異常活動(dòng)與胎兒生長(zhǎng)受限及胎盤(pán)功能障礙有聯(lián)系[20]，精氨酸和脯氨酸代謝及谷胱甘肽代謝與人類的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)等密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，有27 種血清差異代謝物在無(wú)追趕生長(zhǎng)早產(chǎn)兒中上調(diào)，其中8 種為氨基酸類。研究表明，早產(chǎn)兒早期存在追趕性生長(zhǎng)，對(duì)氨基酸的利用率增高[21-22]，所以體重增長(zhǎng)正常的早產(chǎn)兒體內(nèi)部分氨基酸相對(duì)含量較體重增長(zhǎng)緩慢早產(chǎn)兒降低，而體重增長(zhǎng)緩慢早產(chǎn)兒由于新陳代謝較慢或代謝通路障礙，對(duì)這些氨基酸的利用率下降，所以部分氨基酸相對(duì)含量較體重增長(zhǎng)正常早產(chǎn)兒升高，本研究結(jié)果與其相似。早產(chǎn)兒早期給予含氨基酸的營(yíng)養(yǎng)支持，可減少蛋白質(zhì)分解，增加蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)正氮平衡及肌肉和骨骼的生長(zhǎng)，促進(jìn)早產(chǎn)兒的生長(zhǎng)發(fā)育[23-24]。不同生長(zhǎng)模式的早產(chǎn)兒，其血清代謝物存在差異，6 月齡內(nèi)追趕生長(zhǎng)良好的早產(chǎn)兒更容易出現(xiàn)氨基酸缺乏。因此，臨床醫(yī)生需重視早產(chǎn)兒早期的營(yíng)養(yǎng)支持，尤其是氨基酸補(bǔ)充。本研究結(jié)果顯示，無(wú)追趕生長(zhǎng)早產(chǎn)兒的血清癸酰肉堿水平顯著下調(diào)，可能其自身疾病及營(yíng)養(yǎng)攝入不足，導(dǎo)致肉堿攝入更加不足有關(guān)。劉丹陽(yáng)等[25]提出早產(chǎn)兒生后早期肉堿水平降低（完全腸外營(yíng)養(yǎng)時(shí)幾乎無(wú)肉堿攝入），即使逐漸增加母乳或配方奶喂養(yǎng)，多數(shù)酰基肉堿水平仍呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明早產(chǎn)兒生后早期的肉堿攝入不足可影響其后期的生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀況。因此，建議對(duì)早期腸外營(yíng)養(yǎng)支持的新生兒應(yīng)預(yù)防性補(bǔ)充肉堿。

本研究利用LC-MS/MS 技術(shù)，對(duì)不同生長(zhǎng)模式早產(chǎn)兒的血清進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)在校正胎齡6 月齡時(shí)追趕生長(zhǎng)與無(wú)追趕生長(zhǎng)的早產(chǎn)兒血清代謝物有差異，其差異顯著的代謝通路以氨基酸代謝為主，這一研究結(jié)果為早產(chǎn)兒生后早期營(yíng)養(yǎng)支持尤其是必需氨基酸的合理補(bǔ)充及促進(jìn)早產(chǎn)兒順利完成追趕生長(zhǎng)提供了理論依據(jù)。本研究篩選到1 個(gè)在無(wú)追趕生長(zhǎng)早產(chǎn)兒的血清中顯著下調(diào)的小分子代謝物——癸酰肉堿，為以后從脂肪酸和能量代謝方面研究早產(chǎn)兒追趕生長(zhǎng)提供了新的研究思路。