胡 珊 陳鵬典 寧 艷 馬 飛 劉昱磊 邱婷婷 覃曉玲 唐 夢

南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院中醫(yī)科，廣東深圳 518028

自然流產是目前全球生殖醫(yī)學領域研究的熱點難點，發(fā)生在妊娠12 周內稱為早期自然流產。近年研究[1-2]表明，細胞凋亡是調控細胞增殖、保證胎盤組織結構和功能的重要調控機制，妊娠過程中胎盤絨毛和蛻膜的細胞凋亡與增殖處于一種相對平衡的狀態(tài)，當這種平衡被打破可能影響妊娠結局?，F代研究[3]發(fā)現，中醫(yī)藥可通過調節(jié)生殖內分泌功能和免疫因子功能、協調母胎界面滋養(yǎng)細胞增殖凋亡及改善胎盤微循環(huán)障礙等環(huán)節(jié)干預自然流產。本課題組前期臨床研究[4-5]發(fā)現，“補腎健脾”中藥可一定程度改善早期妊娠先兆流產患者焦慮情緒狀態(tài)及免疫和凝血功能，提高保胎療效。在此基礎上，觀察“補腎健脾”灸法對腎虛-黃體抑制流產模型孕鼠蛻膜組織相關凋亡細胞蛋白表達的影響，以探討艾灸防治早期流產的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選購廣東省實驗動物中心SD 大鼠雄性16 只、雌性36 只，周齡8～10 周，體重220～250 g，許可證號為SCXK（粵）2018-0002，實驗動物使用許可證號為SYXK（粵）2020-0230。購入后于SPF 實驗動物中心空調下架式單籠喂養(yǎng)，環(huán)境溫度20～25℃，濕度50%～60%，光照、黑暗各12 h 交替，標準顆粒飼料、滅菌注射用水喂養(yǎng)。本實驗已通過深圳拓普生物科技有限公司動物實驗福利和倫理審查（TOP-IACUC-2020-07-0011）。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 超凈工作臺（型號：YJ-VS-1，無錫一凈凈化設備有限公司）；倒置顯微鏡（型號：Mshot MF53，廣州明美光電有限公司）；生物組織包埋機（型號：EG11504，德國Leica 公司）；組織脫水機（型號：ASP3 00S，德國Leica 公司）；冷卻臺（型號：EG1150C，德國Leica 公司）；石蠟切片機（型號：RM2235，德國Leica公司）等。

1.2.2 試劑 地屈孕酮片（360397，10 mg/片，荷蘭Abbott公司）；米非司酮片（200402，25 mg/片，廣州朗圣藥業(yè)有限公司）；羥基脲片（0B0193D05，0.5 g/片，齊魯制藥有限公司）；TUNEL 檢測試劑盒（G1507，塞維爾生物科技有限公司）；大鼠抗Bcl-2 多克隆抗體（12789-1-AP）、大鼠抗Caspase-3 多克隆抗體（19677-1-AP）、大鼠抗Bax 多克隆抗體（50599-2-Ig）均來自Proteintech 公司；清艾條（200505，江蘇康美制藥有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組、造模與干預治療 雌鼠（36 只）和雄鼠（16 只）合籠交配。合籠第1 天晨起雌鼠行陰道涂片，觀察到大片精子及陰道栓脫落作為妊娠第1 天[6]。選取32 只孕鼠采用隨機數字表法將其分為正常組、模型組、地屈孕酮組和艾灸組，每組8 只。其他四只雌鼠未妊娠。除正常組以外，其他組均采用“羥基脲+米非司酮”造模[7]：從妊娠第1 天開始，每天上午正常組予4 ml生理鹽水灌胃；模型組予2 ml 蒸餾水灌胃；造模同時，地屈孕酮組予生理鹽水＋地屈孕酮片（3.02 mg/kg）2 ml/d 灌胃；艾灸組予艾灸雙側足三里和太溪穴，其定位參照大鼠常用針灸穴位[8]，用艾條懸灸以上兩組穴位，持續(xù)時間為15 min/（次·穴），每日1 次至動物處死。下午除正常組予蒸餾水灌胃外，其余各組均予生理鹽水＋羥基脲（450 mg/kg）1 ml 灌胃，共9 d。在妊娠第10 天早上除正常組外，其余各組均分別加用米非司酮（RU486）4.0 mg/kg，以造成腎虛-黃體抑制流產模型。孕鼠出現形體消瘦，精神萎靡，毛色枯槁，喜蜷縮，脫毛，小便頻且清長，納呆，甚至出現陰道出血，提示造模成功[9]。

1.3.2 標本制備與采集 各組均在妊娠第11 天（除正常組外，其他組均在灌服米非司酮24 h 后）處死大鼠，取子宮濾紙吸干，計算胚胎數并測量子宮直徑。將取得的新鮮蛻膜組織用甲醛溶液固定、石蠟包埋、組織切片、TUNEL 檢測及免疫組化等制作。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 一般情況 觀察大鼠的精神狀態(tài)、鼠毛、納食、大小便及活動情況等。

1.4.2 免疫組織化學法測定Bax、Bcl-2 和Caspase-3蛋白的表達 將石蠟切片用二甲苯及梯度酒精脫蠟至水，經EDTA 抗原修復，并按標準分別使用5%山羊血清、分別予兔抗大鼠Bax 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠Bcl-2 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠Caspase-3 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠Fas 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠FasL 多克隆抗體（1∶200 稀釋）、兔抗大鼠P53 多克隆抗體（1∶200 稀釋）及兔抗大鼠CDKN1A 多克隆抗體（1∶200 稀釋），4℃過夜，PBS 沖洗，二抗孵育，DAB 顯色，蘇木精返藍液返藍，梯度酒精二甲苯脫水，中性樹膠封片等操作后，在顯微鏡下觀察棕色陽性點，高倍鏡（100×）下隨機選擇5 個不重疊的視野；采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)，選用陽性區(qū)域積分光密度（optical density，OD）及陽性面積行統(tǒng)計分析，并計算陽性表達的平均OD 值。

1.4.3 TUNEL 法測定原位細胞凋亡 檢測遵照試劑盒說明書進行。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，新鮮稀釋的蛋白酶K 溶液消化，TBS 沖洗；加3%H2O2；加100 μl 1×TdT 平衡緩沖液，室溫孵育。加標記反應混合液，TBS洗；加終止緩沖液，室溫孵育；加封閉緩沖液；加稀釋過的1×偶聯物，室溫孵育；加DAB 顯色液，室溫孵育；dH2O 漂洗，甲基綠復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。凋亡指數（apoptosisindex，AI）=凋亡細胞核數/總細胞核數。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對所得數據進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，計數資料采用例數表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

造模期間，與正常組比較，模型組孕鼠形體消瘦，精神萎靡，毛色枯槁，喜蜷縮，脫毛明顯，小便頻且清，納呆，妊娠約第6 天開始逐漸出現陰道出血；地屈孕酮組和艾灸組均可改善腎虛-黃體抑制流產模型一般體征，減少其陰道出血癥狀。

2.2 各組大鼠子宮直徑及宮內胚胎數比較

與正常組比較，模型組大鼠子宮直徑減小，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；與模型組比較，艾灸組子宮直徑均增大，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；正常組和模型組，模型組和艾灸組宮內胚胎總數比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠子宮直徑及宮內胚胎數比較（）

表1 各組大鼠子宮直徑及宮內胚胎數比較（）

注 與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

2.3 各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白平均OD 值及細胞AI 值比較

各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2 蛋白陽性染色位于細胞漿，Caspase-3 蛋白陽性染色位于細胞核和細胞漿，均呈棕黃色，Bax、Caspase-3 蛋白在正常組、地屈孕酮組及艾灸組中分布較為稀疏，在模型組分布較密集。見圖1。與正常組比較，模型組Bax、Caspase-3蛋白平均OD 值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），與模型組比較，艾灸組Bax、Caspase-3 蛋白平均OD值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。Bcl-2蛋白在正常組、地屈孕酮組及艾灸組中分布較為密集，在模型組分布較為稀疏，且在地屈孕酮組染色較為明顯，正常組及艾灸組次之，模型組染色較輕。見圖1。與正常組比較，模型組Bcl-2 蛋白平均OD 值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），與模型組比較，艾灸組Bcl-2 蛋白平均OD 值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。凋亡細胞陽性染色主要位于細胞核，呈棕黃色-黃色，在模型組中凋亡蛋白表達較為密集。見圖2。與正常組比較，模型組細胞AI 值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），與模型組比較，艾灸組細胞AI 值降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白平均OD 值及AI 值比較（）

表2 各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白平均OD 值及AI 值比較（）

注 與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。OD：光密度；AI：凋亡指數

圖1 四組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達水平（免疫組化法染色，100×）

圖2 四組原位凋亡細胞表達比較（TUNEL 法，100×）

3 討論

細胞凋亡是機體清除病理性受損組織的一種重要途徑[10]。妊娠過程中，適當的凋亡程序可促進蛻膜組織結構改建并完善其功能，但過度表達，尤其在妊娠早期，可引起蛻膜變性壞死，影響胚胎的正常發(fā)育，導致自然流產[11-12]。研究發(fā)現[13]，蛻膜細胞發(fā)生凋亡時Bcl-2 與Bax 保持一個相對平衡，當Bcl-2 過量表達時，則細胞存活；反之則導致細胞凋亡。由此，研究者推測蛻膜細胞Bcl-2/Bax 比值降低會影響妊娠結局[14]。Caspase 蛋白酶也可通過線粒體途徑介導Bax 表達，誘導細胞色素C 從線粒體釋放出來，激活Caspase-3，引發(fā)Caspase 級聯反應，引起蛻膜細胞凋亡[15]。

中醫(yī)認為，自然流產與脾腎功能不足有關，名醫(yī)羅元愷教授根據“腎主生殖”理論提出“腎-天癸-沖任-子宮軸”概念，和現代醫(yī)學的“下丘腦-垂體-卵巢軸”相似[16]。據此羅頌平教授團隊首創(chuàng)以羥基脲和米非司酮制備腎虛-黃體抑制（病證結合）流產大鼠模型[17-18]。該模型模擬了臨床上妊娠期腎虛和黃體抑制導致自然流產的病理狀態(tài)，表現出腎虛癥狀、外周血孕酮水平下降、蛻膜孕激素受體表達被抑制等，均符合腎虛和黃體不健的早期先兆流產臨床表現。研究證實[19-20]，灸法可改善卵巢儲備功能減退大鼠卵巢臟器指數及組織學形態(tài)，調整大鼠動情周期、血清性激素和炎癥因子水平，并可降低先兆流產患者外周血Th17水平和Th17/Treg 比值，改善其妊娠結局。并可雙向調節(jié)Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達[21-22]。其機制是通過光熱傳導刺激神經-內分泌-免疫系統(tǒng)發(fā)揮效應，是多靶點、多通道、多機制的綜合網絡效果[23]。本研究所選穴位足三里及太溪具有補腎健脾之功，在動物實驗中發(fā)現[24-25]，二者對Bcl-2/Bax 比值及Caspase-3 蛋白表達均具有雙向調節(jié)作用。

本研究結果示，與正常組比較，模型組Bax、Bcl-2和Caspase-3 蛋白表達異常，其凋亡細胞明顯增多，提示腎虛-黃體抑制模型大鼠流產與蛻膜組織細胞凋亡關系密切。艾灸足三里和太溪穴可明顯改善其流產情況和相關指標，且可達到與地屈孕酮相似的效果，提示艾灸足三里和太溪穴可通過上調腎虛-黃體抑制流產孕鼠蛻膜組織Bcl-2 蛋白表達并下調其Bax和Caspase-3 蛋白過量表達，降低其AI 值，從而調控母胎界面細胞凋亡，發(fā)揮干預早期流產的作用。灸法無痛、無創(chuàng)傷的特點在臨床上接受性強，依從性高，具有很好的臨床價值。因此，后續(xù)大樣本的臨床研究具有重要的臨床意義。而對于艾灸發(fā)揮其他的作用如調節(jié)生殖內分泌功能、調節(jié)免疫因子功能、改善胎盤微循環(huán)障礙等機制有待作者在以后的研究工作中繼續(xù)闡明。