陸玲鴻，馬媛媛，古咸彬，肖金平，宋根華，張慧琴

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州310021)

果實(shí)成熟是一個(gè)非常復(fù)雜的遺傳調(diào)控過程，伴隨著生理、生化、物理和風(fēng)味的變化[1]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實(shí)，采后極易變軟腐爛，不耐貯藏[2]。獼猴桃果實(shí)后熟軟化分為軟化起始、快速軟化、可食和過熟4個(gè)階段[3]。研究表明，不同獼猴桃種或品種有相似的果實(shí)軟化進(jìn)程，但是有不同的果實(shí)軟化速率[4-9]。美味獼猴桃一般較中華獼猴桃軟化速度慢，更耐貯藏；軟棗獼猴桃軟化最快，貨架期最短。軟棗獼猴桃營養(yǎng)豐富，即食性好，已經(jīng)開始規(guī)?；耘啵l(fā)展迅速[10]，但其低溫貯藏期僅為1～2個(gè)月；美味獼猴桃海沃德在0 ℃的貯藏期為4～6個(gè)月[11-12]。

細(xì)胞壁組分與結(jié)構(gòu)的變化是導(dǎo)致獼猴桃果實(shí)軟化的關(guān)鍵因素。細(xì)胞壁主要包含多種多糖組分，如果膠、纖維素和半纖維素[13]。果膠是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的植物細(xì)胞壁多糖，在細(xì)胞與細(xì)胞的黏附中起重要作用。在番茄和許多其他肉質(zhì)水果中，一些與成熟相關(guān)的最顯著的變化發(fā)生在果膠多糖中[14]。研究表明，獼猴桃果實(shí)中果膠聚合物和半纖維素的解聚與降解可導(dǎo)致細(xì)胞間隙增大和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松動(dòng)，從而引起獼猴桃果實(shí)后熟軟化[15]。

果膠聚合物在果實(shí)成熟過程中的降解是幾種果膠代謝酶作用的結(jié)果，其中主要包括果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)、內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶(endo-polygalacturonase，PG)、果膠酸裂解酶(pectate lyase，PL)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，α-AF)等[14，16]。研究表明，果實(shí)軟化是多種果膠降解酶綜合作用的結(jié)果，同種果膠降解酶在不同物種的果實(shí)軟化中具有不同作用?，F(xiàn)有的研究主要圍繞美味獼猴桃品種展開[17-21]，尚未有對(duì)不同貯藏條件、不同種獼猴桃果實(shí)細(xì)胞壁多糖物質(zhì)與果膠降解酶的相關(guān)研究。有研究表明，PL是影響番茄果實(shí)軟化的一個(gè)重要因素，但目前對(duì)獼猴桃果實(shí)PL活性的研究較少[22]。本研究以徐香、金麗、晚綠3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)為試材，測(cè)定25 ℃和4 ℃貯藏過程中不同獼猴桃果實(shí)的硬度、細(xì)胞壁多糖物質(zhì)含量和果膠降解相關(guān)酶活性，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析，為獼猴桃果實(shí)采后軟化機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為商業(yè)采收期采摘的3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)，即徐香、金麗和晚綠(圖1)。3個(gè)品種果實(shí)分別采自浙江仙居、麗水和新昌的實(shí)驗(yàn)基地。徐香是市場(chǎng)上暢銷的美味獼猴桃(Actinidiadeliciosa)品種；金麗和晚綠分別是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育出的中華獼猴桃(Actinidiachinensis)和軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)品種。果實(shí)采收當(dāng)天挑選大小均勻、成熟度一致、無病蟲害和機(jī)械損傷的果實(shí)，均勻地平鋪在紙箱中，用保鮮膜包裝后分別放置于25 ℃和4 ℃、相對(duì)濕度(90±5)%的環(huán)境中。貯藏期間，25 ℃貯藏組中徐香和金麗獼猴桃果實(shí)每3 d取樣1次，晚綠獼猴桃每2 d取樣1次；4 ℃貯藏組每周取樣1次；果實(shí)硬度低于0.35 kg·cm-2或晚綠獼猴桃果實(shí)表皮褐化率50%以上時(shí)停止取樣。獼猴桃果肉用液氮速凍后置-80 ℃冰箱保存待測(cè)，每個(gè)重復(fù)取用8個(gè)果實(shí)。

圖1 三個(gè)品種獼猴桃果實(shí)形態(tài)特征

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.1 硬度測(cè)定

在果實(shí)赤道部位均勻取3個(gè)點(diǎn)，削去約1 cm2果皮，用FHM-1果實(shí)硬度計(jì)(竹村，日本)測(cè)定硬度，以kg·cm-2表示。每品種隨機(jī)測(cè)量6個(gè)果實(shí)，結(jié)果取平均值。

1.2.2 細(xì)胞壁物質(zhì)組分測(cè)定

細(xì)胞壁物質(zhì)的提取和分離參考Figueroa等[23]的方法。半纖維素含量測(cè)定用蒽酮法[24]，用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，單位mg·g-1；用重量法測(cè)定纖維素含量，單位mg·g-1。不同溶解性果膠含量測(cè)定參考曹建康等[24]的方法，單位mg·g-1。以上數(shù)據(jù)都以鮮重計(jì)。

1.2.3 酶活性測(cè)定

用蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并采用上?？婆d生物科技有限公司的ELISA試劑盒進(jìn)行酶活性測(cè)定。每樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)，單位U·g-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft office 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析與繪圖，利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果實(shí)采后硬度的變化

硬度是評(píng)價(jià)果實(shí)軟化的重要指標(biāo)。在25 ℃和4 ℃兩種貯藏溫度下，3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)硬度都隨貯藏時(shí)間延長而下降(圖2)。25 ℃貯藏條件下，晚綠硬度下降最快，4 d時(shí)硬度已下降84.62%；其次是金麗，6 d時(shí)，硬度下降77.7%；徐香硬度變化最為緩慢，6 d時(shí)硬度僅下降45%，9 d時(shí)下降69.79%。4 ℃貯藏條件下，晚綠果實(shí)硬度呈直線型下降，金麗和徐香果實(shí)硬度均在前3周快速下降而后緩慢變化，而徐香硬度始終保持最高。4 ℃低溫貯藏延緩了獼猴桃果實(shí)的軟化，延長了貯藏期限。

圖2 獼猴桃果實(shí)軟化期間果肉硬度變化

2.2 獼猴桃果實(shí)采后細(xì)胞壁多糖物質(zhì)的降解

兩種貯藏條件下，獼猴桃果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)含量呈不斷下降趨勢(shì)(圖3)。0 d時(shí)，3個(gè)品種獼猴桃細(xì)胞壁物質(zhì)含量從高到低依次為徐香、晚綠、金麗。25 ℃貯藏條件下，3個(gè)品種獼猴桃細(xì)胞壁物質(zhì)含量在貯藏前期下降速度不同，晚綠的細(xì)胞壁物質(zhì)含量下降最快，貯藏2 d時(shí)已下降38.44%，而金麗和徐香在貯藏3 d時(shí)分別下降32.11%和13.61%；徐香的細(xì)胞壁物質(zhì)含量始終高于其他兩個(gè)品種。4 ℃貯藏條件下，3個(gè)品種獼猴桃細(xì)胞壁物質(zhì)含量均在貯藏前期快速下降，貯藏3周時(shí)，晚綠、金麗和徐香獼猴桃細(xì)胞壁物質(zhì)含量分別下降39.01%、43.17%和38.12%。4 ℃低溫貯藏延緩了獼猴桃果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)的降解。

數(shù)據(jù)以鮮重計(jì)。圖4、圖5同。

3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)貯藏期間半纖維素含量呈不斷降低趨勢(shì)(圖4)。0 d時(shí)，3個(gè)品種半纖維素含量從高到低依次為徐香、金麗、晚綠。兩種貯藏溫度下，不同品種獼猴桃果實(shí)半纖維素含量均在貯藏前期快速下降，隨后緩慢降低。在整個(gè)貯藏過程中，徐香果實(shí)的半纖維素含量始終較高。25 ℃貯藏末期，徐香、金麗、晚綠的半纖維素含量分別為1.06、1.00、1.25 mg·g-1。4 ℃貯藏末期，金麗和晚綠的半纖維素含量較25 ℃貯藏末期分別增加43%和103.2%，徐香的半纖維素含量無明顯變化。纖維素含量與半纖維素含量變化趨勢(shì)較為一致(圖4)。4 ℃低溫貯藏延緩了獼猴桃果實(shí)半纖維素和纖維素含量的下降。

圖4 獼猴桃果實(shí)軟化期間半纖維素和纖維素含量的變化

如圖5所示，0 d時(shí)徐香、金麗、晚綠的水溶性果膠(water soluble pectin，WSP)含量分別為0.86、0.57、1.29 mg·g-1。25 ℃貯藏條件下，晚綠的WSP含量在貯藏前期快速增加，貯藏4 d達(dá)4.43 mg·g-1；金麗和徐香的WSP含量增加相對(duì)緩慢，貯藏末期其WSP值顯著低于晚綠。4 ℃貯藏條件下，晚綠WSP含量呈直線上升，金麗和徐香的WSP含量則在貯藏前2周迅速上升，隨后緩慢上升直至貯藏末期。不同品種獼猴桃果實(shí)貯藏期間離子結(jié)合型果膠(ionic soluble pectin，ISP)含量變化趨勢(shì)較為一致。0 d時(shí)，徐香的ISP含量最高，晚綠的ISP含量最低。25 ℃貯藏條件下，金麗和晚綠的ISP含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，徐香的ISP含量相對(duì)穩(wěn)定，在貯藏后期有所降低。4 ℃貯藏條件下，3個(gè)品種獼猴桃的ISP含量均呈現(xiàn)先升高后降低再升高的波動(dòng)變化趨勢(shì)，徐香的ISP含量始終保持最高。3個(gè)品種獼猴桃采后共價(jià)型果膠(covalent soluble pectin，CSP)含量均不斷減少。25 ℃貯藏條件下，晚綠的CSP降解最快，在貯藏2 d時(shí)已下降46.49%，而金麗和徐香在貯藏3 d時(shí)分別下降16.08%和31.97%；金麗的CSP含量在貯藏3 d后呈直線下降趨勢(shì)，而徐香呈緩慢下降趨勢(shì)。4 ℃貯藏條件下，3個(gè)品種獼猴桃的CSP含量均在貯藏前2周降低最多，徐香的CSP含量始終保持最高。4 ℃貯藏顯著減緩獼猴桃果實(shí)CSP含量的下降。

圖5 獼猴桃果實(shí)軟化期間果膠含量的變化

2.3 獼猴桃果實(shí)采后果膠降解相關(guān)酶活性

不同品種獼猴桃果實(shí)貯藏過程中PME活性變化趨勢(shì)不同(圖6)。25 ℃貯藏條件下，金麗和晚綠的PME活性呈先升高后降低趨勢(shì)，分別在貯藏3 d和4 d達(dá)到峰值；徐香的PME活性呈先穩(wěn)定后上升的趨勢(shì)。4 ℃貯藏條件下，晚綠的PME活性在整個(gè)貯藏過程中不斷增加；金麗和徐香的PME活性在貯藏1周時(shí)顯著增加，隨后呈波動(dòng)變化趨勢(shì)。

如圖6所示，25 ℃貯藏條件下，金麗和晚綠的PG活性在采后呈先升高后降低趨勢(shì)，晚綠的PG活性相對(duì)較高，貯藏4 d已達(dá)峰值，是金麗活性峰值(6 d)的1.17倍；徐香的PG活性在貯藏前期保持穩(wěn)定，于12 d時(shí)達(dá)到最高值。4 ℃貯藏條件下，3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)均在貯藏前期保持較低的PG活性，在貯藏后期活性升高，低溫抑制獼猴桃果實(shí)PG活性的上升。

不同品種獼猴桃貯藏期間PL活性變化趨勢(shì)差異較大(圖6)。0 d時(shí)，晚綠的PL活性顯著高于其他兩個(gè)品種。25 ℃貯藏條件下，晚綠的PL活性在采后2 d快速下降，隨后又上升，其活性高峰不明顯；金麗和徐香的PL活性總體呈先上升后下降的趨勢(shì)，分別在貯藏6 d和9 d達(dá)到峰值。4 ℃貯藏條件下，晚綠的PL活性呈不斷降低趨勢(shì)，而金麗和徐香的PL活性在貯藏前期較低，于貯藏后期上升；在貯藏前3周，徐香的PL活性顯著低于其他兩個(gè)品種。

數(shù)據(jù)以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)。下同。

25 ℃貯藏條件下，晚綠和金麗兩種糖苷酶活性均呈先上升后下降趨勢(shì)，分別在貯藏4 d和6 d達(dá)到高峰；徐香β-Gal活性在貯藏前期相對(duì)較低，隨后上升，酶活性高峰出現(xiàn)較晚(圖7)。4 ℃貯藏條件下，3個(gè)品種β-Gal活性均呈現(xiàn)上升-下降-上升的波浪式上升趨勢(shì)，α-AF活性在3個(gè)品種中表現(xiàn)不同；晚綠α-AF活性變化呈波浪趨勢(shì)，金麗α-AF活性在前期快速增加隨后保持穩(wěn)定，而徐香則是緩慢上升趨勢(shì)；在貯藏前3周，徐香α-AF活性顯著低于其他兩個(gè)品種。

圖7 獼猴桃果實(shí)軟化期間β-半乳糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性變化

2.4 獼猴桃果實(shí)硬度、細(xì)胞壁組分和果膠降解酶活性之間的相關(guān)性分析

表1相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩種貯藏條件下，3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)硬度與WSP含量之間均呈顯著負(fù)相關(guān)，與CSP、半纖維素、纖維素含量之間呈顯著正相關(guān)，且相關(guān)性較強(qiáng)(0.868

表1 獼猴桃果實(shí)硬度、細(xì)胞壁組分和果膠降解酶活性之間的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

果實(shí)軟化是獼猴桃果實(shí)成熟的最主要特征之一，硬度則是評(píng)價(jià)果實(shí)軟化最直觀的生理指標(biāo)。本試驗(yàn)中，3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)軟化速率不同，其變化速率從大到小依次為晚綠、金麗、徐香。獼猴桃果實(shí)軟化過程中，細(xì)胞壁組分發(fā)生不同程度的降解。雙子葉植物細(xì)胞壁主要由半纖維素、纖維素和果膠組成，上述物質(zhì)降解是造成細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞的主要原因，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而導(dǎo)致果實(shí)質(zhì)地發(fā)生改變。在兩種貯藏溫度下，3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)半纖維素、纖維素和CSP含量不斷降低，WSP含量不斷上升，ISP含量相對(duì)穩(wěn)定，與前人在獼猴桃中的研究結(jié)果一致[20，25]。此外，兩種貯藏溫度下，不同品種細(xì)胞壁組分降解速率不同，軟化最慢的徐香獼猴桃降解速率最小，軟化最快的晚綠獼猴桃降解速率最大，這與桃和番茄果實(shí)中的研究結(jié)果類似[26]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)硬度與WSP含量之間均呈顯著負(fù)相關(guān)，與CSP、半纖維素、纖維素含量之間呈顯著正相關(guān)，說明獼猴桃果實(shí)軟化與細(xì)胞壁多糖物質(zhì)的降解緊密相關(guān)。

果膠物質(zhì)是植物細(xì)胞壁初生壁和中膠層的主要成分，也是對(duì)獼猴桃果實(shí)軟化影響較大的細(xì)胞壁多糖物質(zhì)。果膠結(jié)構(gòu)域主要包括同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，HG)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅰ和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅱ[27]。果膠聚合物的溶解、解聚和去酯化是果實(shí)成熟最重要的特征，多種果膠降解酶參與其中。PME是一種水解酶，水解果膠分子HG中C-6甲酯化的羧基，形成果膠酸。PME為PG和PL提供去甲基果膠酸，促進(jìn)其他果膠酶對(duì)果膠的去聚化；細(xì)胞壁中性糖尤其是β-Gal和α-AF分別催化的半乳糖和阿拉伯糖的釋放丟失也是獼猴桃果實(shí)成熟軟化過程中的一個(gè)重要事件。25 ℃貯藏時(shí)，金麗和晚綠PME活性分別在貯藏前期和后期達(dá)到峰值，徐香PME活性在貯藏前期活性最低，并呈現(xiàn)先穩(wěn)定再上升的趨勢(shì)。研究表明，金魁獼猴桃PME活性則在后期達(dá)到峰值，于貯藏末期有所下降[28]，而秦美獼猴桃的PME活性則一直處于下降狀態(tài)，沒有表現(xiàn)出階段活性高峰[18，25]。4 ℃貯藏條件下，本研究中3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)PME活性呈上升趨勢(shì)，與海沃德獼猴桃[29]和秦美獼猴桃[19]中的研究結(jié)果一致，而與東紅獼猴桃[30]中的研究結(jié)果不同，說明PME活性在不同品種獼猴桃果實(shí)中變化趨勢(shì)不同。25 ℃貯藏時(shí)，PG和β-Gal活性與徐香獼猴桃軟化顯著相關(guān)。25 ℃貯藏前期，PG和β-Gal活性在軟化最快的晚綠果實(shí)中最高，而在軟化最慢的徐香果實(shí)中活性最低。4 ℃貯藏時(shí)，α-AF活性與徐香和金麗的果實(shí)軟化顯著相關(guān)，PL活性與晚綠果實(shí)軟化顯著相關(guān)。4 ℃貯藏前期，α-AF的活性在晚綠中最高，在徐香中最低，這與齊秀東等[31]對(duì)不同貯藏性梨果實(shí)和高萌等[7]對(duì)不同耐貯性獼猴桃果實(shí)中的研究結(jié)果一致。PL活性在獼猴桃中研究相對(duì)較少，有研究表明，PL在東紅果實(shí)軟化期間活性變化不明顯[30]。本試驗(yàn)中，4 ℃貯藏前期，PL活性在晚綠中最高，在徐香中最低。

綜上所述，3個(gè)品種獼猴桃果實(shí)軟化與細(xì)胞壁多糖物質(zhì)的降解緊密相關(guān)。晚綠獼猴桃軟化最快，其細(xì)胞壁多糖物質(zhì)含量變化也最快；徐香獼猴桃軟化最慢，其細(xì)胞壁多糖物質(zhì)含量變化也最慢。25 ℃貯藏條件下，貯藏前期晚綠中PG、β-Gal的高活性和徐香中的低活性是導(dǎo)致其軟化速度差異的原因；4 ℃貯藏條件下，貯藏前期晚綠中PL、α-AF的高活性和徐香中的低活性是導(dǎo)致其軟化速度差異的原因。