姚文，遠(yuǎn)孝瓊，姚青云，覃丹俞，李倪捷，黃勇，李豫峰

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 453000)

2018年一項(xiàng)包含18 571對(duì)夫婦的橫斷面研究顯示，中國育齡婦女中不孕癥的患病率為15.5%，在有生育意向的人群中則高達(dá)25%[1]。輔助生殖技術(shù)(ART)作為治療不孕不育疾病的重要手段，在近30年取得了極大進(jìn)步。但胚胎著床依然是制約活產(chǎn)的關(guān)鍵因素，提高患者的著床率仍然是一大挑戰(zhàn)。

低分子肝素(LMWH)是通過用不同的化學(xué)或酶法裂解肝素獲得的平均分子量在4 500～5 000 Da、范圍在1 000～10 000 Da的肝素鹽。因其更安全有效且更可控而逐漸取代肝素廣泛應(yīng)用于臨床[2]。LMWH具有抗凝抗栓作用，主要用于靜脈血栓、心血管疾病和缺血性中風(fēng)以及炎癥性疾病[3]。此外，LMWH還可以通過與多種蛋白相互作用調(diào)控胚胎著床和發(fā)育的生理過程[4]。

多次著床失敗的患者中出現(xiàn)獲得性或遺傳性血栓形成傾向的概率遠(yuǎn)高于正?；颊遊5-6]。一項(xiàng)Meta分析顯示，LMWH可顯著提高多次著床失敗患者的活產(chǎn)率[7]。但另一項(xiàng)Meta分析則表明，LMWH對(duì)妊娠結(jié)局沒有明顯影響[8]。使用LMWH是否會(huì)改善多次著床失敗患者的妊娠結(jié)局目前還需要進(jìn)一步證實(shí)。

雖然反復(fù)著床失敗(RIF)指3次及以上優(yōu)質(zhì)胚胎移植著床失敗[9]，但在臨床上2次著床失敗患者即開始使用LMWH的情況比較常見，為了明確LMWH對(duì)≥2次著床失敗患者妊娠結(jié)局的影響，遂進(jìn)行本項(xiàng)研究，以期為臨床上多次著床失敗患者的診療提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究為回顧性隊(duì)列研究，納入對(duì)象為2018年1月至2020年12月于我院生殖醫(yī)學(xué)中心行凍融胚胎移植(FET)助孕患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者有2次及以上著床失敗史；(2)均行FET。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)LMWH用藥時(shí)間不足1月；(2)夫妻雙方任何一方染色體異常；(3)供精或供卵周期；(4)有黃體轉(zhuǎn)換但最終未移植；(5)失訪。

按照納排標(biāo)準(zhǔn)，共納入2 140個(gè)解凍周期(1 547例患者)。根據(jù)是否使用LMWH分為LMWH組(n=182)和未使用LMWH的對(duì)照組(n=1 958)。本研究經(jīng)同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(倫理批號(hào)：TJ-IRB20210956)。

二、研究方法

1.促排卵方案：根據(jù)患者情況主要采用激動(dòng)劑方案、拮抗劑方案及其他方案進(jìn)行促排卵。激動(dòng)劑方案于月經(jīng)周期第2天給予促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，達(dá)必佳，輝凌制藥，德國或達(dá)菲林，博福益普生，法國)3.75 mg，拮抗劑方案于月經(jīng)周期第2天給予促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant,抑那通，武田藥品，日本)3.75 mg，30 d后給予起始劑量的卵泡刺激素(FSH，麗申寶，珠海麗珠或果納芬，默克雪蘭諾，德國)(通常為150～300 U/d)，根據(jù)患者的身高、體重、卵巢反應(yīng)、卵泡大小及數(shù)目等調(diào)整用量。當(dāng)出現(xiàn)2個(gè)以上卵泡直徑≥18 mm或3個(gè)以上卵泡直徑≥17 mm時(shí)給予人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克雪蘭諾，德國)10 000 U肌肉注射，34～36 h后進(jìn)行取卵。

2.胚胎培養(yǎng)及FET：獲卵后采用常規(guī)體外受精(IVF)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)授精，16～18 h后觀察受精情況，并將正常受精的合子繼續(xù)培養(yǎng)至卵裂胚或囊胚。胚胎根據(jù)患者情況遵循醫(yī)生建議及患者意愿進(jìn)行凍存或鮮胚移植。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)實(shí)驗(yàn)室學(xué)組共識(shí)[10]、Istanbul共識(shí)[11]和Gardner囊胚評(píng)分體系[12]將胚胎(包括卵裂胚和囊胚)分為優(yōu)質(zhì)胚胎、中等胚胎和劣質(zhì)胚胎。將未移植的優(yōu)質(zhì)胚胎和中等胚胎進(jìn)行玻璃化凍存。轉(zhuǎn)化內(nèi)膜3或5 d后快速解凍胚胎，放入胚胎復(fù)蘇液(GMOPS Plus，Vitrolife，瑞典)中5 min后轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液(G2，Vitrolife，瑞典)中1～3 h后行FET。解凍后的胚胎存活總細(xì)胞數(shù)>50%認(rèn)為胚胎復(fù)蘇成功。

3. FET前內(nèi)膜準(zhǔn)備及黃體支持給藥方法：對(duì)照組僅給予常規(guī)黃體轉(zhuǎn)化和黃體支持，所用方法同既往研究[13]。具體方案為月經(jīng)第2天開始按遞增法口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳，德國)至內(nèi)膜厚度達(dá)到7 mm及以上且雌激素作用時(shí)間不少于10 d時(shí)，給予黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)肌肉注射，40 mg/次，1次/d，轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。移植后繼續(xù)黃體支持直至測定血清HCG水平。LMWH組從解凍周期黃體轉(zhuǎn)化日起一并給予那屈肝素鈣注射液(速碧林，ASPEN Notre Dame de Bondeville，法國)皮下注射，4 100 U/次，1次/d或磺達(dá)肝癸鈉注射液(澤瑞妥，江蘇恒瑞)皮下注射，2.5 mg/次，1次/d，至B超下見到胎心搏動(dòng)后停藥。

4. 結(jié)果評(píng)價(jià)及隨訪：胚胎移植后12～14 d后測定血清HCG水平，血清HCG>10 U/L為HCG陽性。對(duì)于HCG陽性患者，28 d后行經(jīng)陰道B超檢查，B超探及孕囊存在為臨床妊娠，孕囊數(shù)目為著床胚胎數(shù)目。對(duì)臨床妊娠的患者電話隨訪至產(chǎn)后6周。

5. 觀察指標(biāo)：主要結(jié)局指標(biāo)為活產(chǎn)率(活產(chǎn)周期數(shù)/總周期數(shù)×100%)；次要結(jié)局指標(biāo)包括：HCG陽性率(HCG陽性周期數(shù)/總周期數(shù)×100%)，著床率(B超下妊娠囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%)，臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)/總周期數(shù)×100%)，流產(chǎn)率(妊娠28周前流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)，異位妊娠率(異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基本資料及胚胎移植情況比較

LMWH組和對(duì)照組患者的年齡、不孕年限、不孕因素、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、移植胚胎類型等比較均無顯著性差異(P>0.05)。LMWH組的基礎(chǔ)FSH和移植日子宮內(nèi)膜厚度顯著高于對(duì)照組，而基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者基礎(chǔ)資料及胚胎移植情況比較[(-±s)，n(%)]

續(xù)表

二、LMWH對(duì)妊娠結(jié)局的影響

兩組患者的活產(chǎn)率比較無顯著性差異(P>0.05)；LMWH組的HCG陽性率、著床率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；對(duì)照組有12個(gè)周期(1.31%)發(fā)生異位妊娠，LMWH組無異位妊娠發(fā)生，因樣本數(shù)相差較大，未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表2)。多因素GEE回歸分析發(fā)現(xiàn)，LMWH[OR=2.13，95%CI(1.40，3.22)]、年齡[OR=1.08，95%CI(1.03，1.12)]、不孕類型[OR=1.89，95%CI(1.36，2.63)]、移植胚胎數(shù)目[OR=0.56，95%CI(0.40，0.77)]和移植胚胎類型[OR=0.71，95%CI(0.58，0.87)]是流產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素(P<0.001)；年齡[OR=0.93，95%CI(0.91，0.95)]、移植日內(nèi)膜厚度[OR=1.09，95%CI(1.02，1.17)]、不孕類型[OR=0.72，95%CI(0.59，0.88)]、移植胚胎數(shù)目[OR=1.76，95%CI(1.45，2.14)]、移植胚胎類型[OR=1.81，95%CI(1.59，2.07)]、移植胚胎質(zhì)量[OR=0.75，95%CI(0.67，0.84)]是活產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素(P<0.01)(表3)。

表2 兩組患者妊娠結(jié)局的比較(%)

三、PSM后LMWH對(duì)妊娠結(jié)局的影響

為減少兩組樣本量差異過大產(chǎn)生的偏倚，根據(jù)1∶2的比例進(jìn)行PSM，匹配后所有變量的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)均值差均小于0.1(圖1)。匹配后LMWH組納入182個(gè)解凍周期，對(duì)照組納入364個(gè)解凍周期。PSM后兩組患者的妊娠結(jié)局比較顯示，兩組的活產(chǎn)率仍無顯著性差異(P>0.05)；LMWH組的HCG陽性率、著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；結(jié)果與匹配前一致(表4)。

表3 兩組患者流產(chǎn)率和活產(chǎn)率的GEE分析

圖1 PSM前后協(xié)變量的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)均值差變化

表4 PSM后兩組患者妊娠結(jié)局的比較(%)

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)LMWH可顯著提高患者的HCG陽性率、著床率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率(P<0.05)，但兩組的活產(chǎn)率并無顯著差異(P>0.05)，推測LMWH雖可以提高臨床妊娠率，但因流產(chǎn)率也相應(yīng)升高，故最終活產(chǎn)率并無顯著差異。

LMWH對(duì)多次移植失敗患者妊娠結(jié)局的影響目前還存在爭議。一項(xiàng)隨機(jī)開放性研究發(fā)現(xiàn)，≥2次移植失敗的患者使用LMWH后的活產(chǎn)率比對(duì)照組高8%(n=150)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)[15]。Lodigiani等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，≥2次移植失敗的患者使用LMWH后的妊娠率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，遺憾的是文中并沒有把活產(chǎn)率作為結(jié)局指標(biāo)。另一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究(RCT)同樣發(fā)現(xiàn)，使用LMWH后的RIF患者活產(chǎn)率、著床率和臨床妊娠率顯著升高，流產(chǎn)率顯著降低(P<0.05)；但因該研究樣本量較小(n=83)，且LMWH組僅1人流產(chǎn)，對(duì)照組僅2人流產(chǎn)，故流產(chǎn)率的組間差異可能存在一定的偏倚[17]。熊正方等[18]對(duì)RIF患者開展的研究也表明，使用LMWH可以增加臨床妊娠率。Berker等[19]對(duì)207例≥2次移植失敗患者進(jìn)行的RCT研究并沒有發(fā)現(xiàn)LMWH對(duì)患者的妊娠結(jié)局存在顯著影響；但這一研究僅限于新鮮周期移植的患者，而多次移植失敗的患者往往更傾向于解凍周期移植。另一項(xiàng)多中心回顧性隊(duì)列研究的結(jié)果同樣認(rèn)為，使用LMWH并沒有改善≥2次移植失敗患者的妊娠結(jié)局[20]；但該研究未把活產(chǎn)率作為最終結(jié)局指標(biāo)且未對(duì)相關(guān)混雜因素進(jìn)行調(diào)整。此外，還有一些無移植失敗史或僅移植失敗1次的研究也顯示，LMWH并不能改善移植患者的妊娠結(jié)局[21-22]。由于各個(gè)研究的異質(zhì)性較大，用藥人群、用藥時(shí)間和方式等都不盡相同，因此，還需要更高等級(jí)的證據(jù)進(jìn)一步探究LMWH對(duì)多次移植失敗患者妊娠結(jié)局的影響。

目前關(guān)于LMWH影響妊娠的機(jī)制研究仍較少。Qublan等[5]發(fā)現(xiàn)，68.9%的3次及以上著床失敗患者至少存在一項(xiàng)遺傳或獲得性血栓形成傾向的危險(xiǎn)因素，而移植1次就成功妊娠的患者中這一概率僅為25.6%。對(duì)使用LMWH患者的子宮進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，LMWH可以降低子宮動(dòng)脈血流阻力，增加子宮灌注，從而營造有利于胚胎著床的子宮環(huán)境[23]。免疫調(diào)節(jié)在這一過程中也可能起重大作用[24]。有研究表明，LMWH可以改變RIF患者Th-1相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)免疫耐受[25]。此外，LMWH還可以與L-選擇素、鈣粘素、肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)、胰島素樣生長因子Ⅰ/Ⅱ(IGF-Ⅰ/Ⅱ)、白介素(IL)-1、IL-6、白血病抑制因子(LIF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等胚胎著床相關(guān)分子相互作用[4]，從而調(diào)控胚胎著床過程。LMWH影響著床及妊娠的具體機(jī)制目前尚不明確，血栓形成傾向、子宮血流灌注、免疫調(diào)節(jié)等均有可能在其中發(fā)揮作用，具體作用機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究探討。

本研究中LMWH組的流產(chǎn)率顯著升高(P<0.05)，推測其原因是一些可能發(fā)生生化妊娠的胚胎在LMWH使用后雖然成功著床但并不能順利發(fā)育。但該推測尚需要進(jìn)一步的臨床及機(jī)制研究加以證實(shí)。

本研究聚焦于LMWH使用對(duì)≥2次移植失敗患者妊娠結(jié)局的影響，更貼近于臨床上LMWH在多次移植失敗患者中應(yīng)用的情況。同時(shí)，本研究只納入了用藥超過1個(gè)月即具有良好依從性的患者，減少了患者不規(guī)律用藥可能造成的偏倚；并且通過PSM及GEE對(duì)樣本量和年齡、BMI等多個(gè)混雜因素進(jìn)行調(diào)整，減少了多周期移植及相關(guān)混雜因素對(duì)結(jié)果造成的影響。

本研究為回顧性隊(duì)列研究，仍然存在一些局限性：首先，本研究未對(duì)所有患者血栓前狀態(tài)進(jìn)行檢測，血栓前狀態(tài)及一些其他可能被忽略的潛在混雜因素可能影響妊娠結(jié)局；第二，本研究中兩組樣本量差異過大，可能會(huì)影響最終結(jié)果，因此按照1∶2的比例進(jìn)行了PSM來減少樣本量差異引起的偏倚；第三，本研究為單中心研究，結(jié)論的外推性還需要進(jìn)一步確定；最后，本研究未對(duì)藥物使用不良反應(yīng)等情況進(jìn)行隨訪記錄，這可能對(duì)臨床最終決策產(chǎn)生影響。

綜上所述，LMWH可以提高≥2次胚胎移植失敗患者的HCG陽性率、著床率、臨床妊娠率及流產(chǎn)率，但活產(chǎn)率并未明顯提高。LMWH對(duì)妊娠結(jié)局的影響還需要進(jìn)一步的RCT加以證實(shí)。臨床醫(yī)生在應(yīng)用LMWH來改善≥2次胚胎移植失敗患者的妊娠結(jié)局時(shí)需要關(guān)注其增高流產(chǎn)率的風(fēng)險(xiǎn)。