侯平選, 鮮文峰, 邢雅昶, 左汴京

1南陽市第二人民醫(yī)院骨科二病區(qū)(河南南陽 473000)； 2鄭州兒童醫(yī)院、河南省兒童醫(yī)院、鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院超聲科(河南鄭州 450046)

發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(developmental dysplasia of the hip，DDH)是一種發(fā)育障礙性疾病，其特點為股骨頭相對于髖臼松弛或位置異常，包括從扁平或髖臼發(fā)育不良到關(guān)節(jié)外的股骨頭完全脫位[1]。盡管在出生時和嬰兒期可常規(guī)篩查DDH，但許多病例直到成年才被診斷出來，由于髖臼形態(tài)的變異性，DDH表現(xiàn)為一系列解剖異常，常見髖臼前部或前外側(cè)缺損[2]，輕度DDH可導(dǎo)致成人骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的高發(fā)病率，這與DDH早期關(guān)節(jié)軟骨退行性改變有關(guān)[3]，但關(guān)于DDH早期軟骨退化的具體機制仍尚待探究。微小RNA(microRNA，miR)是控制增殖、分化、炎癥和廣泛的其他生物過程的基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)，miR-155參與調(diào)節(jié)OA的炎癥反應(yīng)、軟骨退化及關(guān)節(jié)損傷[4]，且可負向調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)通路誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡并發(fā)揮分解代謝活性[5]，為探究miR-155是否可靶向調(diào)控PI3K/Akt通路參與大鼠DDH，本研究于2020年1月至2021年10月通過誘導(dǎo)構(gòu)建新生大鼠DDH模型，體內(nèi)下調(diào)miR-155表達，觀察大鼠髖關(guān)節(jié)病理并檢測相關(guān)指標(biāo)因子表達，以期為DDH病理具體機制提供一定的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡無特定病原體級可育雌性Wistar大鼠10只，雄性5只，體重為(240±20)g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號為SCXK(魯)2019-0003。恒溫(24±2)℃、恒濕(相對濕度50%～60%)環(huán)境下普通飼養(yǎng)，給予充足水和普通飼料，12 h光照-12 h黑暗交替，適應(yīng)性培養(yǎng)1周后以雌雄比例2∶1合籠過夜受孕。孕鼠分娩后取新生大鼠60只用于實驗。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則(倫理審批號：KY2019-892551)。

1.1.2 主要試劑和儀器 miR-155-RNAi-LV、miR-155-NC-LV購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；改良番紅O-固綠軟骨染色液(BP-DL421)購自南京森貝伽生物科技有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13(ab286191)、X型膠原蛋白(Collagen X)(ab182563)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycinm，mTOR)(ab2833)、核糖體S6蛋白激酶1(ribosomal S6 protein kinase 1，S6k1)(ab32529)及p-S6k1(ab59208)購自美國Abcam公司；Akt(AA326)抗體購自上海碧云天生物科技有限公司；p-mTOR(bs-3494R)、PI3K(bs-10657R)、p-PI3K(bs-6417R)、p-Akt(bs-2720R)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ABI 7300型實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司；MultiskanTMFC多功能酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾科技有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-155在DDH大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達 20只Wistar新生大鼠隨機分為空白組和DDH組，每組各10只，其中DDH模型通過改變襁褓姿勢，固定Wistar新生大鼠后肢伸展和內(nèi)收進行直腿誘導(dǎo)[6]，期間每天松綁10 min后再固定以防血流不通，空白組大鼠不作干預(yù)，固定期間經(jīng)母鼠哺乳。10 d后，空白組和DDH組幼鼠施行安樂死，收集髖關(guān)節(jié)軟骨組織并保存于液氮中，通過RT-qPCR技術(shù)檢測miR-155在DDH大鼠中的表達水平：Invitrogen Trizol試劑提取軟骨組織總RNA，SuperScriptTMVILOTMcDNA 合成試劑盒合成cDNA，SYBR熒光染料法檢測，反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s、55℃ 20 s、72℃ 20 s 35個循環(huán)；72℃ 8 min。U6為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。引物序列：miR-155：F：5′-UUAAUGCAAUCGUCAUAGGCGU-3′，R：5′-CCGUAUCACGAUUUGCAUUACAUU-3′；U6：F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2 分組、造模及干預(yù) 經(jīng)檢測，miR-155表達在DDH大鼠髖關(guān)節(jié)中上調(diào)，故將40只Wistar新生大鼠隨機分為空白組、DDH組、DDH+miR-155 NC組及DDH+miR-155下調(diào)組，每組各10只，除空白組外，剩余組大鼠均參考1.2.1誘導(dǎo)DDH模型，10 d后各組幼鼠均自由活動同時進行干預(yù)：DH+miR-155 NC組及DDH+miR-155下調(diào)組大鼠分別于尾靜脈注射miR-155-NC-LV、miR-155-RNAi-LV各100 μL，空白組及模型組大鼠僅注射等量生理鹽水，1次/周，共8周。

1.2.3 樣品采集與處理 8周后，戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)麻醉，頸椎脫位處死各組大鼠，取左側(cè)髖關(guān)節(jié)測量股骨頭長徑和橫徑以及髖臼長徑、橫徑，后經(jīng)PBS沖洗，于4%多聚甲醛中固定2 d，隨后將樣品在10%乙二胺四乙酸中脫鈣15 d，脫水后常規(guī)制備石蠟切片以用于組織學(xué)染色；右側(cè)髖關(guān)節(jié)軟骨組織于液氮中保存以用于RT-qPCR及Western blot檢測。

1.2.4 番紅O-固綠染色觀察軟骨組織蛋白聚糖分泌情況 石蠟切片于二甲苯和分級乙醇中脫蠟，Weigert蘇木素染液染色3 min，鹽酸乙醇分化15 s，水洗；固綠染色液浸染5 min，水洗；番紅O染色液內(nèi)浸染2 min后蒸餾水、乙酸溶液分別洗滌1 min，脫水透明封片。鏡下軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖呈紅色。

1.2.5 RT-qPCR技術(shù)檢測miR-155及軟骨退變指標(biāo)因子基因表達 miR-155相對表達量檢測同1.2.1；Invitrogen Trizol試劑提取髖關(guān)節(jié)組織總RNA后利用TaqMan Reverse Transcription Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR熒光染料法檢測。反應(yīng)條件為95℃ 5 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s 40個循環(huán)；以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCT法量化mRNA表達水平。引物序列如下：MMP-13：F：5′-TACGAGCATCCATCCCGAGACC-3′，R：5′-AACCGCAGCACTGAGCCTTTTC-3′；Collagen X：F：5′-GATCATGGAGCTCACGGAAAA-3′，R：5′-CCGTTCGATTCCGCATTG-3′；β-actin：F：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCT A-3′，R：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

1.2.6 Western blot法檢測軟骨中軟骨退變指標(biāo)因子及PI3K/Akt通路蛋白表達 軟骨組織于RIPA裂解液中裂解，4℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清液保存于-80℃。BCA法測定蛋白濃度，20 μg等量蛋白樣品于10% SDS-PAGE凝膠中分離，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，于室溫5%牛血清白蛋白中封閉2 h，4℃一抗中(均1∶1 000稀釋)孵育過夜，洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育2 h，洗膜，增強化學(xué)發(fā)光試劑盒試劑對膜進行可視化，Image J軟件量化蛋白，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白的相對表達量，以磷酸化蛋白灰度值/全蛋白灰度值比值作為蛋白活性水平。

2 結(jié)果

2.1 miR-155在DDH大鼠髖關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達 RT-qPCR結(jié)果顯示，與空白組(1.01±0.01)比較，miR-155在DDH組(3.65±0.43)大鼠髖關(guān)節(jié)軟骨組織中的相對表達量升高(P<0.05)。

2.2 各組大鼠股骨頭及髖臼大小 測量結(jié)果顯示，與空白組比較，DDH組、DDH+miR-155 NC組及DDH+miR-155下調(diào)組大鼠股骨頭長徑、橫徑和髖臼長徑、橫徑及髖臼深度值均減小；與DDH組比較，DDH+miR-155 NC組大鼠與之差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DDH+miR-155下調(diào)組大鼠上述測量指標(biāo)值均增加(P<0.05)；與DDH+miR-155 NC組比較，DDH+miR-155下調(diào)組大鼠上述測量指標(biāo)值均增加(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠股骨頭及髖臼大小比較(n=10)

2.3 各組大鼠軟骨組織蛋白聚糖分泌情況 番紅O-固綠染色結(jié)果顯示，空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨切片軟骨邊緣完整，軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖呈紅色深染；與空白組比較，DDH組、DDH+miR-155 NC組及DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨組織切片見基質(zhì)中紅染變淡，另DDH組及DDH+miR-155 NC組大鼠軟骨表層細胞缺損；相對與DDH組、DDH+miR-155 NC組，DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨基質(zhì)中紅染程度加深。見圖1。

注：A：空白組；B：DDH組；C：DDH+miR-155 NC組；D：DDH+miR-155下調(diào)組

2.4 各組大鼠軟骨組織中miR-155表達情況 RT-qPCR結(jié)果顯示，與空白組(1.01±0.01)比較，DDH組(3.59±0.15)、DDH+miR-155 NC組(3.63±0.18)及DDH+miR-155下調(diào)組(1.88±0.21)大鼠軟骨組織中miR-155相對表達量升高(P<0.05)；與DDH組比較，DDH+miR-155 NC組大鼠與之差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨組織中miR-155相對表達量降低(P<0.05)；與DDH+miR-155 NC組比較，DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨組織中miR-155相對表達量降低(P<0.05)。

2.5 各組大鼠軟骨組織中MMP-13、Collagen X mRNA及蛋白表達情況 RT-qPCR及Western blot結(jié)果顯示，與空白組比較，DDH組、DDH+miR-155 NC組及DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨組織中MMP-13和Collagen X mRNA及蛋白相對表達量均升高(P<0.05)；與DDH組比較，DDH+miR-155 NC組大鼠與之差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨組織中MMP-13和Collagen X mRNA及蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與DDH+miR-155 NC組比較，DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨組織中MMP-13和Collagen X mRNA及蛋白相對表達量降低(P<0.05)。見圖2、表2。

注：A：空白組；B：DDH組；C：DDH+miR-155 NC組；D：DDH+miR-155下調(diào)組

表2 MMP-13、Collagen X mRNA及蛋白相對表達量比較(n=10)

2.6 各組大鼠軟骨組織中PI3K/Akt通路蛋白表達情況 Western blot結(jié)果顯示，與空白組比較，DDH組、DDH+miR-155 NC組及DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨組織中PI3K、Akt、mTOR及S6k1蛋白活性水平均降低(P<0.05)；與DDH組比較，DDH+miR-155 NC組大鼠與之差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨組織中PI3K、Akt、mTOR及S6k1蛋白活性水平均升高(P<0.05)；與DDH+miR-155 NC組比較，DDH+miR-155下調(diào)組大鼠軟骨組織中PI3K、Akt、mTOR及S6k1蛋白活性水平均升高(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 各組大鼠軟骨組織中PI3K、Akt、mTOR及S6k1蛋白活性比較(n=10)

注：A：空白組；B：DDH組；C：DDH+miR-155 NC組；D：DDH+miR-155下調(diào)組

3 討論

DDH發(fā)病機制復(fù)雜，據(jù)報道，其可能源于異常的圍產(chǎn)期機械因素，如臀位、羊水過少和女性初產(chǎn)[7]，新生大鼠DDH模型表明，襁褓姿勢是一種機械危險因素，該原理設(shè)計的模型被認為是人類DDH軟骨的準確模型，可能適合進一步研究[8]，本研究通過模擬直腿襁褓體位成功制備了DDH新生大鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，DDH早期見軟骨退化，并在大多數(shù)情況下將導(dǎo)致OA發(fā)生[9]，miRNA是長度為21～24個核苷酸的高度保守的非編碼RNA分子，可通過與目標(biāo)mRNA分子的3′-非編碼區(qū)堿基配對來抑制翻譯并驅(qū)動mRNA降解，其異常表達與軟骨細胞發(fā)育和軟骨穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，在OA發(fā)病機制中起重要作用[10]，但miRNA與DDH病理分子機制之間的關(guān)系尚待探究。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥性關(guān)節(jié)軟骨細胞中上調(diào)[4]，通過下調(diào)miR-155水平可減輕膠原酶建立的實驗性小鼠OA模型的滑膜炎癥并延緩OA發(fā)展[11]，故推測miR-155在DDH大鼠中可能高水平表達。經(jīng)RT-qPCR檢測，本實驗結(jié)果顯示，miR-155在DDH大鼠髖關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達上調(diào)，另見模型大鼠提示股骨頭長徑、橫徑和髖臼長徑、橫徑及髖臼深度值均減小，提示miR-155可能在髖關(guān)節(jié)早期軟骨退化及后期發(fā)展為OA過程中發(fā)揮一定的促進作用。通過體內(nèi)下調(diào)miR-155水平后發(fā)現(xiàn)，大鼠股骨頭及髖臼大小異常均有所改善，提示DDH軟骨早期退變是可逆的，后期干預(yù)手段的實施對其具有積極意義。關(guān)節(jié)軟骨在其整個厚度中具有不均勻的結(jié)構(gòu)，從而在生理壓縮載荷下驅(qū)動組織內(nèi)生物力學(xué)應(yīng)變分布的相關(guān)變化[12]，但髖骨畸形導(dǎo)致了關(guān)節(jié)軟骨的異常應(yīng)力，受壓后關(guān)節(jié)軟骨表面對Ⅱ型膠原抗體有免疫屏障的隱形層被破壞，膠原纖維暴露在滑膜中，引起軟骨細胞損傷，功能障礙，蛋白多糖分泌異常[13]，軟骨基質(zhì)中硫酸化糖胺聚糖的損失可導(dǎo)致軟骨變薄，被認為是早期軟骨退化特征[14]。MMP-13是在軟骨中表達的MMP家族的主要成員，在正常成人中不表達，OA患者中MMP-13水平表明軟骨退化的程度，可促進軟骨基質(zhì)和Collagen Ⅱ降解，誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡，導(dǎo)致軟骨損傷[15]。Collagen X是一種軟骨特異性膠原蛋白，正常情況下，僅在肥大軟骨和關(guān)節(jié)軟骨的鈣化區(qū)中發(fā)現(xiàn)，但在關(guān)節(jié)炎中隨著軟骨細胞肥大，可觀察到其表達增加[16]。本研究中，DDH組大鼠軟骨組織基質(zhì)中蛋白聚糖染色程度顯著減弱，且MMP-13和Collagen X mRNA及蛋白相對表達水平均增加，提示早期軟骨退化發(fā)生；而下調(diào)miR-155后，蛋白聚糖染色加深，MMP-13和Collagen X表達下調(diào)，提示miR-155可能通過作用軟骨細胞，促進其凋亡和抑制其功能而導(dǎo)致軟骨發(fā)育受損，進而促進DDH大鼠軟骨退化發(fā)生。

PI3K/AKT通路與軟骨細胞凋亡和退化過程密切相關(guān)。Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/Akt通路可減少軟骨細胞胞外基質(zhì)的降解，降低軟骨細胞炎癥和凋亡水平，從而在OA治療中發(fā)揮作用；另有研究結(jié)果顯示，在軟骨早期退化階段，OA軟骨細胞中的自噬增加以保護軟骨細胞免受對各種環(huán)境變化的適應(yīng)性反應(yīng)，但隨著軟骨逐漸退化，自噬減少[18]，PI3K/Akt信號通路激活后可誘導(dǎo)細胞自噬進而保護大鼠OA軟骨退變損傷[19]。據(jù)報道，miR-155對PI3K/Akt通路具有靶向調(diào)控作用。Fan等[5]研究表明，miR-155可靶向抑制PIK3R1進而抑制PI3K/Akt通路的激活，在體外可增強 IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡和分解代謝活性；另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可靶向抑制PI3KA表達進而抑制自噬依賴的經(jīng)典PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路[20]。本研究中，見DDH組大鼠軟骨組織中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、mTOR及S6k1蛋白活性均降低，提示該通路被抑制；而下調(diào)miR-155表達后，PI3K、Akt、mTOR及S6k1蛋白活性均升高，提示miR-155可能通過抑制PI3K/Akt通路激活而促進DDH發(fā)展。

綜上所述，通過下調(diào)miR-155可激活PI3K/Akt通路抑制DDH大鼠軟骨退化程度，盡管未能闡述miR-155的具體作用靶點，但本實驗為DDH分子機制及干預(yù)措施制定提供了一定依據(jù)，另關(guān)于miR155靶向PI3K/Akt通路具體是通過什么途徑發(fā)揮抗軟骨退化作用還需進一步探究。

利益相關(guān)聲明：本文所有作者均聲明不存在相關(guān)利益沖突。

作者貢獻說明：侯平選負責(zé)實驗總體設(shè)計、實驗部分操作、數(shù)據(jù)收集及論文擬稿；鮮文峰負責(zé)試驗部分操作及數(shù)據(jù)整理、分析；邢雅昶負責(zé)實驗方法設(shè)計及論文內(nèi)容潤色、修改；左汴京協(xié)助實驗準備及進行。