程鳴威, 朱培君, 楊爍, 陳家豪, 羅柯, 劉倩, 徐淑蘭

南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)院種植中心(廣東廣州 510280)

在口腔種植領域，引導骨再生是常用的骨增量手術之一，其中屏障膜與細胞的相互作用非常重要，理想的膜材料不只是被動的給細胞提供生長環(huán)境，更應該積極的促進細胞間信號傳遞，使細胞更好地行使生物功能[1-2]。人體組織與生物電有著密切關系，天然骨和骨膜中存在生理電位(-10～-90 mV)，已有研究表明，成骨細胞會對電信號產生回應[3]，據(jù)此，本課題組前期設計出電活性P(VDF-TrFE)生物膜，通過極化處理，使得該電活性多聚物表面帶有電荷，將電信號直接傳遞給細胞，從而影響細胞黏附，增殖與分化。牛蒡子苷元(Arctigenin, ARG)是從中醫(yī)藥牛蒡子中提取的木質素類化合物[4]。多項研究表明其具有抗炎，抗氧化，抗腫瘤以及促進成骨的作用[5-7]，已有研究證實牛蒡子苷元抑制RANKL誘導的破骨細胞生成和羥基磷灰石再吸收[8]。而對于骨質疏松患者，牛蒡子苷元能夠通過PI3K/Akt/PPARγ通路調節(jié)骨再生[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)電活性P(VDF-TrFE)產生的微電環(huán)境能夠有效促進骨再生，2021年5月至2022年5月在本研究中，將進一步探索牛蒡子苷復合電活性P(VDF-TrFE)薄膜對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠骨髓間充質干細胞(ATCC)；P(VDF-TrFE)粉末(法國阿克瑪公司)；N，N-二甲基甲酰胺(上海阿拉丁試劑有限公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國)；DMSO(北京索萊寶)；MTT試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；ALP試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒 (上海貝博生物科技有限公司)；茜素紅染液(上海賽業(yè)生物)；氯化十六烷基吡啶(上海遠慕生物); 掃描電子顯微鏡觀察表面形貌(JSM6300，JEOL，Peabody，MA，USA);電熱鼓風箱(GZ-140 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)。

1.2 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜制備 按照前期研究實驗方法制備P(VDF-TrFE)膜[10]，在高溫下對P(VDF-TrFE)膜進行油隅極化處理，電壓設置為6 kV/cm，加壓速率為100 V/min，120℃高溫極化1 h。將牛蒡子苷元粉末溶解于DMSO中，使用無水乙醇配置成4個工作濃度(2.5、5、10、20 μmol/L)，調整溶液pH為7.4。分為5組，對照組浸泡于無水乙醇，其余4組浸漬于不同濃度的牛蒡子苷元溶液中作為處理組，設置溫度為37℃，使得牛蒡子苷元吸附在P(VDF-TrFE)膜表面，經過48 h后取出P(VDF-TrFE)膜，在空氣下自然干燥，所有樣品均經過紫外消毒后備用。

1.3 大鼠骨髓間充質干細胞培養(yǎng) 大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)購自賽業(yè)生物公司，BMSCs培養(yǎng)于T25培養(yǎng)瓶中，加入5 mL完全培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基為含10% 胎牛血清和1% 雙抗(青霉素/鏈霉素)的F12/DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合至70%～80% 時用0.25% 胰蛋白酶消化傳代。使用第3～4代BMSCs，將細胞按照密度為2×104個/孔分別種植在不同組別的牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜上。

1.4 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜表面形貌和電學性能分析

1.4.1 掃描電鏡分析表面形貌 將牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜裁剪成0.5 cm×0.5 cm大小，通過導電膠粘接在樣品臺上，進行噴金(鉑)提高材料的導電性，使用掃描電子顯微鏡觀察表面形貌。

1.4.2 牛蒡子苷元釋放行為測定 取一定質量的牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜置于鼓風烘箱中做釋放處理，溫度設置為室溫。按照設定的時間間隔，使用萬分之一天平來稱量纖維膜的質量，記下復合膜質量的變化，結果以失重質量百分比表示。

1.4.3 電學性能表征 使用壓電測量儀(ZJ-3AN, IACAS, Beijing, China)測量牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜的壓電系數(shù)(d33)。為了檢測電學穩(wěn)定性，將牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜放置在DMEM/F12培養(yǎng)基中浸泡，在第30天時檢測d33。

1.5 細胞增殖實驗 細胞增殖實驗按照CCK8說明書進行操作，BMSCs按照上述說明進行培養(yǎng)，在24、48、72 h時用滅菌PBS沖洗3次，加入含有10% CCK8工作液的完全培養(yǎng)基，在 37℃下孵育 30 min。酶標儀記錄450 nm波長下各孔的吸光度，實驗重復3次。

1.6 堿性磷酸酶實驗 BMSCs按照上述說明進行培養(yǎng)，在3 d時，用滅菌PBS洗滌3次。在堿性磷酸酶染色實驗中，使用4% 多聚甲醛固定細胞30 min，然后用堿性磷酸酶染色溶液(Beyotime Biotechnology Inc.)染色30 min。在堿性磷酸酶活性測定實驗中，使用BCA試劑盒檢測蛋白總量，用適量不含磷酸酶抑制劑的 RIPA 細胞裂解液處理細胞，制備待測液。根據(jù)ALP試劑盒說明配置ALP活性測定工作液，并將工作液與待測液混合，用酶標儀測定其在405 nm的吸光度，計算酶活力，結果以U/L表示。

1.7 茜素紅實驗 BMSCs按照上述說明進行培養(yǎng)，在14 d時，用滅菌PBS洗滌3次。在茜素紅染色實驗中，使用4%多聚甲醛固定細胞30 min，然后用茜素紅染液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)染色10 min，在顯微鏡下觀察拍照觀察。向孔板內加入2 mL 10% 十六烷基吡啶溶液，置于搖床上輕搖1 h，待染色物完全溶解后，取適量溶解液于 562 nm 的波長下測定其吸光度用于茜素紅染色定量分析。

1.8 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差來表示。使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，SNK法進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜物理特征 所有樣本在浸泡牛蒡子苷元溶液后均無出現(xiàn)樣本損傷，從圖1可以看出，SEM結果顯示樣本表面形貌無明顯改變。將浸泡了牛蒡子苷元的P(VDF-TrFE)膜在室溫下對牛蒡子苷元釋放進行測定， 從表1可以看出，不同濃度的4個組在10 h前均有藥物突釋行為，在96 h基本釋放完全，累積釋放率達到90%以上。對牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜壓電常數(shù)的分析表明，浸泡牛蒡子苷元后，材料表面的仍具有良好電學性能，為了測試復合膜的壓電穩(wěn)定性，將其浸入DMEM/F12培養(yǎng)基中30 d，30 d結束時，浸沒樣品的壓電系數(shù)d33接近原始d33，見表2。說明牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜在體外能夠穩(wěn)定的構建微電環(huán)境。

表1 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜釋放率 %

表2 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜的壓電系數(shù)d33

注：A:對照組；B:2.5 μmol/L組

2.2 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜的細胞相容性 實驗在不同濃度水平檢測了牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜對BMSCs增殖的影響，CCK8結果顯示(圖2)牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜呈現(xiàn)出濃度依賴的細胞增殖抑制，與對照組相比，在濃度為20 μmol/L時呈現(xiàn)出明顯的細胞毒性。

注：*與2.5 μmol/L組比較 P<0.05；#與5 μmol/L組比較 P<0.05；△與10 μmol/L組比較 P<0.05

2.3 牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜促進骨髓間充質干細胞成骨分化的效能 骨髓間充質干細胞成骨分化的效能通過ALP和茜素紅染色實驗表征。堿性磷酸酶染色實驗結果顯示(圖3)，在3 d時，5組復合膜表面均出現(xiàn)深染藍色物質，說明均有堿性磷酸酶形成。堿性磷酸酶定量結果顯示(圖4)，牛蒡子苷元處理組的早期成骨分化效能均優(yōu)于對照組，在濃度為10 μmol/L時擁有最佳的早期成骨效能。

注：A:對照組；B：2.5 μmol/L組；C：5 μmol/L組；D：10 μmol/L組；E：20 μmol/L組

注：*與對照組比較 P<0.05；#與2.5 μmol/L組比較 P<0.05；△與5 μmol/L組比較 P<0.05；▲與10 μmol/L組比較 P<0.05

茜素紅染色結果顯示(圖5)，在14 d時，5組復合膜表面均出現(xiàn)紅褐色礦化結節(jié)，說明有鈣磷物質沉積到細胞外基質中，但茜素紅定量結果顯示(圖6)，相比對照組，處理組不會促進BMSCs礦化結節(jié)生成。從細胞增殖實驗和成骨分化實驗結果來看，牛蒡子苷元濃度為10 μmol/L時，牛蒡子苷元P(VDF-TrFE)復合膜用有最佳的成骨效能。

注：A：對照組；B：2.5 μmol/L組；C：5 μmol/L組；D：10 μmol/L組；E：20 μmol/L組

圖6 茜素紅定量檢測

3 討論

骨改建是一個高度受控的過程，成骨細胞分泌細胞外基質促進骨形成，破骨細胞降解細胞外基質引起骨吸收。BMSCs定向遷移到損傷部位，分化為成骨細胞以及分泌生長因子，促進受損骨組織的再生[11]。中醫(yī)藥作為促進成骨分化的新思路近年來獲得廣泛關注，研究表明蛤蚧、補骨脂、淫羊藿、鹿茸等單味藥能夠有效促進成骨，治療骨質疏松，改善骨密度[12-15]。牛蒡子苷元提取自天然中藥牛蒡子，初期被用于抗炎、抗腫瘤以及免疫調節(jié)，最近有研究表明牛蒡子苷元能夠抑制破骨細胞分化從而治療骨質疏松[8, 16]，但是對牛蒡子苷元促進成骨細胞或BMSCs成骨分化的研究尚且較少。P(VDF-TrFE)因其具有良好的生物相容性，而被譽為適合生物醫(yī)學應用的仿生電活性材料，相關研究表明P(VDF-TrFE)膜極化后表面帶有電荷，能仿生生物體內的微電環(huán)境，從而提高成骨細胞的生物學活性[17]。此薄膜的設計規(guī)避了外源性電信號裝置易誘發(fā)感染的風險，提高了仿生電活性材料的生物效應及生物安全性，本課題組前期研究表明極化P(VDF-TrFE)通過免疫調節(jié)促進BMSCs成骨分化[10]。因此，本研究進一步將牛蒡子苷元負載在極化P(VDF-TrFE)薄膜上，研究其促成骨效能。

本研究采用浸泡的方式進行藥物負載，極化P(VDF-TrFE)膜浸泡了不同濃度牛蒡子苷元后仍然具有穩(wěn)定的電學能力以及均勻的表面形貌，牛蒡子苷元釋放行為檢測結果顯示不同濃度的4個組在10 h前均有突釋行為，釋放量達到60%以上，而在96 h基本釋放完全，累積釋放率達到90%以上。浸泡是較為常用的一種方式，但是存在釋放時間過短，前期突釋效應顯著等問題。藥物控制釋放能夠在生物體內以可預測的方式完成較長時間的藥物釋放，目前包括納米控釋系統(tǒng)，水凝膠藥物釋放體系、微球控釋體系以及電仿纖維控釋體系[18]。有研究表明，靜電紡絲可以制備壓電材料并且具有生物活性[19]，因此在載中藥電活性生物材料中，靜電紡絲是一種具有前景的制備工藝。

在本實驗中，牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜呈現(xiàn)出濃度依賴的細胞增殖抑制，在濃度為20 μmol/L時呈現(xiàn)出明顯的細胞毒性。Li等[9]的研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元濃度為10 μmol/L以下時不具有細胞毒性，這與本實驗的研究結果一致。牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜在早期促進了ALP表達。實驗結果顯示牛蒡子苷元處理組的早期成骨分化效能均優(yōu)于對照組，同樣呈現(xiàn)出濃度依賴性，高濃度組(20 μmol/L)的堿性磷酸酶活性不如10 μmol/L組，這可能與細胞毒性有關。而對照組的促成骨效能則可能來自于極化P(VDF-TrFE)薄膜為BMSCs提供的微電環(huán)境。生物礦化從無定型的鈣磷沉積開始，無定型鈣磷沉積到膠原纖維形成的框架中，隨后礦物質成核、生長，形成鈣結節(jié)，茜素紅通過與鈣結節(jié)中的鈣離子反應形成紅褐色化合物，能夠反映細胞晚期成骨分化能力。實驗結果顯示對照組和處理組均有少量礦化結節(jié)形成，但是其差異無統(tǒng)計學意義。結合牛蒡子苷元釋放實驗，本課題組推測由于藥物釋放時間過短從而影響了牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜的晚期促成骨分化能力。

綜上所述，本研究在細胞水平探討了不同濃度牛蒡子苷元復合P(VDF-TrFE)生物膜促進BMSCs成骨分化的能力，結果顯示極化P(VDF-TrFE)所創(chuàng)改造的微電環(huán)境能夠為細胞成骨分化提供良好的環(huán)境，同時牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜能更進一步促進早期成骨，且在一定濃度范圍內其成骨作用于藥物濃度呈正相關，而高濃度牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜則會產生細胞毒性，減弱其促成骨效能。目前的載藥方式尚不足以達到藥物控釋的效果，牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜只能在成骨早期釋釋放藥物，如何能夠提高牛蒡子苷元溶解度和生物利用度，使藥物持續(xù)作用于成骨分化的整個過程，仍需要進一步研究。

利益相關聲明：所有作者聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明：徐淑蘭進行了實驗設計，朱培君和楊爍構建了牛蒡子苷P(VDF-TrFE)復合膜并進行了材料分析。羅軻和劉倩進行了細胞實驗，程鳴威統(tǒng)計數(shù)據(jù)并撰寫論文。