戴龍飛,王 旭,柏 濤,陳 博,楊文奇
安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科,安徽 合肥 230032
膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶-1(acyl-coenzyme A:cholesterolacyltransferase-1,ACAT1)是一種將膽固醇轉(zhuǎn)換為膽固醇酯的酶,可導(dǎo)致Warburg效應(yīng)和腫瘤生長(zhǎng)[1-2]。通過抑制ACAT1表達(dá)可增強(qiáng)T細(xì)胞效應(yīng)器功能[3]。早有研究[4-6]表明,ACAT1表達(dá)水平與大多數(shù)腫瘤預(yù)后相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示,ACAT1可能是泛癌患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物。
腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),存在于腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段[7]。許多“癌癥標(biāo)志”都與腫瘤微環(huán)境有關(guān),包括誘導(dǎo)增殖和抑制細(xì)胞凋亡、抑制免疫系統(tǒng)避免免疫監(jiān)測(cè)以及激活免疫細(xì)胞等[8]。在腫瘤微環(huán)境中鑒定治療靶標(biāo)可用于治療癌癥[9]。腫瘤細(xì)胞通過激活免疫檢查點(diǎn)通路逃避免疫監(jiān)視,而免疫檢查點(diǎn)抑制劑可恢復(fù)抗腫瘤免疫反應(yīng)[10]。腫瘤新抗原具有高度免疫原性,可激活T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng),影響免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效[11]。錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制、腫瘤突變負(fù)荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相互關(guān)聯(lián),與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的敏感性有關(guān),可以用于預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療效果[12-15]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,可誘導(dǎo)T細(xì)胞吸引并增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的功效[16]。
這項(xiàng)研究中,我們分析了ACAT1基因在泛癌患者中的預(yù)后及免疫作用。通過TCGA及GTEX數(shù)據(jù)庫(kù)下載泛癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、突變數(shù)據(jù)和臨床生存數(shù)據(jù),通過K-M生存分析探討ACAT1基因在泛癌中的預(yù)后價(jià)值。利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù),研究ACAT1基因與腫瘤免疫浸潤(rùn)的關(guān)系,尤其是膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BLCA)和腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)。最后,運(yùn)用SangerBox分析ACAT1基因與免疫治療的預(yù)測(cè)標(biāo)志物(包括腫瘤新抗原、腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、錯(cuò)配修復(fù)缺陷、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)之間的關(guān)系。本研究的發(fā)現(xiàn)揭示了ACAT1基因在泛癌預(yù)后和免疫浸潤(rùn)中的重要作用。
通過TCGA及GTEX數(shù)據(jù)庫(kù)下載泛癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)、突變數(shù)據(jù)和臨床生存數(shù)據(jù)。
1.2.1 K-M生存分析 繪制Kaplan-Meier曲線分析泛癌中ACAT1基因表達(dá)水平與生存率的關(guān)系,包括總生存率(overall survival,OS),疾病特異生存率(disease free survival,DSS),無(wú)病生存率(disease-free interval,DFI)和無(wú)進(jìn)展生存率(progression free survival,PFI)。閾值設(shè)置為Cox P值<0.05。探討ACAT1基因表達(dá)水平對(duì)泛癌的OS、DSS、DFI和PFI的影響。在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,LAML)、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(pheochromocytoma and paraganglioma,PCPG)、結(jié)腸腺癌(colon adenocarcinoma,COAD)、BLCA、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)、肝細(xì)胞癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)、直腸癌(Rectum adenocarcinoma,READ)、KIRC、腎乳頭狀細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP)和腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤(brain lower grade glioma,LGG)中分析ACAT1基因表達(dá)與OS、DSS、DFI和PFI的相關(guān)性。計(jì)算95%CI的危險(xiǎn)比(HR)和對(duì)數(shù)秩P值。
1.2.2 TIMER中ACAT1表達(dá)與泛癌免疫浸潤(rùn)的關(guān)系 TIMER是一個(gè)全面的資源數(shù)據(jù)庫(kù),用于系統(tǒng)分析不同癌癥類型的免疫浸潤(rùn)。用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)定ACAT1基因表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系,是系統(tǒng)分析不同癌癥類型免疫浸潤(rùn)的理想資源。TIMER應(yīng)用統(tǒng)計(jì)反褶積方法,從基因表達(dá)譜推斷腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的豐度。TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)包含了來(lái)自TCGA的32種癌癥類型的10 897個(gè)樣本,用于評(píng)估免疫浸潤(rùn)的豐度。從TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中下載泛癌的6種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的得分?jǐn)?shù)據(jù),分析基因表達(dá)與免疫細(xì)胞得分的相關(guān)性。分析ACAT1基因的表達(dá)與6種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞之間的關(guān)系,包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。使用R軟件包estimate分析各個(gè)腫瘤樣本的免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分,同時(shí)測(cè)定ACAT1基因的表達(dá)水平與腫瘤純度的關(guān)系。
1.2.3 Sanger Box Sanger Box工具盒(http://sangerbox.com/)是一款具有多種生物信息分析,可視化作圖和便捷數(shù)據(jù)下載功能的工具。本研究收集了常見的四十多個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因,利用Sanger Box分析ACAT1基因表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)基因的關(guān)系,同時(shí)分別提取這些免疫檢查點(diǎn)基因,計(jì)算與ACAT1基因表達(dá)水平的相關(guān)性。此外,本研究還利用Sanger Box分析了ACAT1基因與泛癌患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑的預(yù)測(cè)標(biāo)志物(包括腫瘤新抗原、腫瘤突變負(fù)荷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、錯(cuò)配修復(fù)基因突變、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)的相關(guān)性。
1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用Kaplan-Meier生存曲線探討ACAT1表達(dá)水平與泛癌的預(yù)后的關(guān)系。此外,利用Sanger Box分析ACAT1基因表達(dá)與免疫治療的預(yù)測(cè)標(biāo)志物之間的關(guān)系?;虮磉_(dá)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
通過收集TCGA及GTEX數(shù)據(jù)庫(kù)中泛癌組織和正常組織的標(biāo)本,分析ACAT1基因在不同腫瘤和鄰近正常組織中的差異表達(dá)。結(jié)果顯示:在大部分癌癥中ACAT1基因表達(dá)水平明顯低于鄰近正常組織,而在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme,GBM)、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤(brain lower grade glioma,LGG)和腎嫌色細(xì)胞癌(kidney Chromophobe,KICH)中明顯高于臨近正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。
表1 ACAT1基因在腫瘤組織和正常組織中的差異表達(dá) 個(gè)
利用K-M生存分析進(jìn)一步評(píng)估ACAT1基因與預(yù)后的關(guān)系。ACAT1基因低表達(dá)顯著提高了HNSC的OS、DSS、DFI和PFI。ACAT1基因低表達(dá)顯著提高了LAML的OS。在PCPG和COAD中,ACAT1基因低表達(dá)對(duì)其DFI具有保護(hù)作用。而在BLCA中,ACAT1基因低表達(dá)顯著提高其OS和DSS,但是在KIRP患者中,低ACAT1基因表達(dá)對(duì)其OS和DSS不利。另外,ACAT1基因顯著降低了READ中的PFI。在KIRC和LGG中,ACAT1基因?qū)S、DSS和PFI均不利。最后研究還發(fā)現(xiàn),ACAT1基因低表達(dá)顯著降低了LUAD的DSS和PFI??紤]到以上結(jié)果中HR值僅為0.98,0.99和1.02等,我們對(duì)以上腫瘤的ACAT1表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)換后發(fā)現(xiàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。
表2 ACAT1基因在泛癌中的預(yù)后分析
本研究進(jìn)一步評(píng)估了泛癌中ACAT1基因表達(dá)與免疫浸潤(rùn)水平的相關(guān)性,確定不同腫瘤組織中ACAT1基因的表達(dá)是否與6種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)相關(guān)。結(jié)果顯示:與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞最顯著相關(guān)的3種腫瘤分別為BLCA、LGG和肉瘤(sarcoma,SARC)。
本研究還分析了在泛癌中ACAT1基因表達(dá)與免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和綜合評(píng)分的關(guān)系。結(jié)果顯示:與免疫評(píng)分最顯著相關(guān)的為BLCA、甲狀腺癌(thyroid carcinoma,THCA)和KIRC,與基質(zhì)評(píng)分最顯著相關(guān)為L(zhǎng)IHC、THCA和KIRC,與綜合評(píng)分最顯著相關(guān)為胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)、THCA和KIRC?;谝陨习l(fā)現(xiàn),我們選擇KIRC代表當(dāng)ACAT1基因低表達(dá)水平時(shí)生存率低的癌癥,而BLCA代表生存率良好的癌癥。對(duì)于KIRC,ACAT1基因表達(dá)水平與免疫評(píng)分(R=-0.319,P=6.21e-14)呈顯著負(fù)相關(guān),而對(duì)于BLCA,與免疫評(píng)分(R=0.336,P=4.04e-12)呈顯著正相關(guān),并且與CD4+T細(xì)胞、 CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈顯著正相關(guān)。此外,KIRC中的ACAT1基因表達(dá)水平與腫瘤純度呈正相關(guān),而在BLCA中無(wú)相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)有力地表明,在KIRC和BLCA中,ACAT1基因通過與免疫浸潤(rùn)相互作用而影響患者生存,見表3。
表3 ACAT1基因與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系 分
另外,本研究還分析了ACAT1基因與免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)關(guān)系。在乳腺癌(breast invasive carcinoma,BRCA)、 LIHC、 KIRC、 THCA、 KIRP及LUAD中,ACAT1與免疫檢查點(diǎn)基因顯著負(fù)相關(guān)。
本研究分析了ACAT1基因表達(dá)水平與腫瘤新抗原數(shù)量、TMB及MSI的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn),在BRCA中,ACAT1基因表達(dá)水平與新抗原數(shù)量顯著負(fù)相關(guān)(R=-0.133,P=0.000 31);在BRCA中ACAT1基因表達(dá)水平與TMB顯著負(fù)相關(guān)(-0.36<R<0,P=8.5e-13),在PAAD中ACAT1基因表達(dá)水平與TMB顯著負(fù)相關(guān)(-0.36<R<0,P=1.4e-06);在BRCA中ACAT1基因表達(dá)水平與MSI顯著負(fù)相關(guān)(-0.27<R<0,P=0.006 7),在THCA中ACAT1基因表達(dá)水平與MSI顯著負(fù)相關(guān)(-0.27<R<0,P=0.003 5)。
評(píng)估錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2及EPCAM突變與ACAT1表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果表明,當(dāng)ACAT1基因低表達(dá)時(shí),LIHC錯(cuò)配修復(fù)基因的MSH2(-0.25<R<0,P<0.001)及MSH6(-0.25<R<0,P<0.05)突變率高,容易出現(xiàn)dMMR。
我們進(jìn)一步分析了ACAT1表達(dá)與四個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1,DNMT2,DNMT3A,DNMT3B)的關(guān)系。結(jié)果顯示:ACAT1基因表達(dá)水平與LIHC中的甲基轉(zhuǎn)移酶顯著負(fù)相關(guān),與葡萄膜黑色素瘤(Uveal Melanoma,UVM)及PAAD顯著正相關(guān),見表4。
表4 ACAT1基因表達(dá)水平與dMMR及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系
ACAT1是CD8+T細(xì)胞中膽固醇酯化的主要酶,抑制ACAT1活性可顯著增強(qiáng)CD8+T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)器功能,促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖。這是由于CD8+T細(xì)胞質(zhì)膜膽固醇水平的增加,增強(qiáng)了T細(xì)胞受體聚集和信號(hào)傳遞以及更有效地形成免疫突觸[17]。這些證據(jù)表明,抑制ACAT1活性可提高機(jī)體的免疫力,同時(shí)為腫瘤的預(yù)后和免疫治療提供新方向。
ACAT1基因被證實(shí)與多種癌癥的增殖相關(guān)[18-20]。因此我們推測(cè),ACAT1基因可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖影響患者的生存。與正常組織相比,ACAT1基因在大部分腫瘤組織中表達(dá)水平較低。在LAML、PCPG、COAD、BLCA、HNSC中,ACAT1基因低表達(dá)與較好的預(yù)后相關(guān),而在LUAD、READ、KIRC、KIRP、LGG中預(yù)后較差。
BLCA和KIRC在免疫浸潤(rùn)和ACAT1基因表達(dá)之間的相關(guān)性方面有不同的模式,這些發(fā)現(xiàn)目前為止尚屬首次。在BLCA和KIRC中,ACAT1基因表達(dá)具有不一致的預(yù)后價(jià)值。ACAT1基因低表達(dá)與BLCA的良好預(yù)后相關(guān),而KIRC則相反,這與Chen L等[21]的研究結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)ACAT1基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間存在顯著相關(guān)性,尤其在BLCA和KIRC中,ACAT1基因的表達(dá)與不同的免疫浸潤(rùn)水平相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn),ACAT1基因的表達(dá)與BLCA中免疫細(xì)胞評(píng)分顯著正相關(guān),而與KIRC顯著負(fù)相關(guān)。BLCA的免疫浸潤(rùn)與ACAT1基因的表達(dá)水平呈正相關(guān),而KIRC呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示,ACAT1基因表達(dá)與某些免疫細(xì)胞標(biāo)志物之間的關(guān)系并不總是與整體趨勢(shì)相同,ACAT1與某些免疫細(xì)胞亞型之間可能具有某種特定的相互作用,這種特定的相互作用目前尚未可知,需要更多的研究去證實(shí)。更加有趣的是,在BLCA中ACAT1基因的表達(dá)水平與腫瘤的純度無(wú)關(guān),而在KIRC中與腫瘤純度呈顯著正相關(guān)。這一證據(jù)提示,ACAT1在BLCA腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中同樣表達(dá),而僅在KIRC腫瘤細(xì)胞中相對(duì)富集,這種差異可能與腫瘤微環(huán)境中不同的ACAT1基因富集方式有關(guān)。作為重要的抗原提呈細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是BLCA中與ACAT1表達(dá)最顯著相關(guān)的細(xì)胞類型,然而在KIRC中則不是。因此,我們推測(cè)腫瘤在向腫瘤微環(huán)境招募抗原提呈細(xì)胞時(shí)存在異質(zhì)性,這一結(jié)果與Patente TA等[22]的研究結(jié)果相似。ACAT1基因在腫瘤中免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的募集和調(diào)節(jié)中起著重要作用,最終可能影響患者的生存。
當(dāng)免疫檢查點(diǎn)基因高表達(dá)時(shí),免疫檢查點(diǎn)活躍,使抗原不能被提呈至T細(xì)胞,抑制T細(xì)胞的免疫功能,腫瘤得以逃脫生存。Hu F F等[23]的研究表明,在癌癥樣本中上調(diào)免疫檢查點(diǎn)基因的數(shù)量越多,越適用于免疫治療。我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)ACAT1低表達(dá)時(shí),BRCA、LIHC、KIRC、THCA、KIRP及LUAD中的免疫檢查點(diǎn)基因顯著高表達(dá),這說明這些腫瘤適用于免疫治療。研究表明,腫瘤新抗原數(shù)目多、高TMB、高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability high, MSI-H)、錯(cuò)配修復(fù)缺陷及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制,腫瘤免疫治療效果越好。我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)ACAT1基因低表達(dá)時(shí):BRCA的新抗原數(shù)量多、高TMB、MSI-H,這與Bianchini G等[24]的研究結(jié)果一致;THCA患者具有MSI-H,這與Ferrari SM等[25]的研究結(jié)果一致;PAAD具有高TMB及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶受到抑制,Schizas D等[26]發(fā)現(xiàn)免疫治療聯(lián)合其他治療可協(xié)同作用于PAAD; UVM的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶受到抑制,Heppt M V等[27]發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)阻斷聯(lián)合CTLA-4和PD-1抑制是迄今為止UVM最有效的治療方法;LIHC錯(cuò)配修復(fù)缺陷及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá),錯(cuò)配修復(fù)基因高突變時(shí)可增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效,而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性強(qiáng)時(shí)會(huì)降低免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效,這說明免疫治療僅對(duì)某些LIHC患者有益,免疫治療在LIHC中的免疫反應(yīng)差異很大,這一現(xiàn)象可能與以下原因有關(guān),Cao D等[28]發(fā)現(xiàn)LIHC患者的預(yù)后與T細(xì)胞浸潤(rùn)的免疫表型(CD8表達(dá))和適應(yīng)性免疫抵抗基因(B7-H3或CD47)的表達(dá)有關(guān),B7-H3患者低/CD8高或CD47低/CD8高的存活率最高,而B7-H3高/CD8低或CD47高/CD8低的存活率最差。
綜上所述,BRCA、LIHC、KIRC、THCA、KIRP、LUAD、PAAD及UVM的免疫治療效果好,而ACAT1基因低表達(dá)可作為泛癌的免疫治療預(yù)測(cè)標(biāo)志物。