干建松

（1.江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 糧食與食品藥品學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

農(nóng)作物秸稈是世界上最豐富的纖維素類可再生資源[1-2]，同時(shí)也是世界上年產(chǎn)量最多的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2014～2018年，中國(guó)秸稈年均產(chǎn)量高達(dá)6.537 8×108t，其中谷類、麥類和玉米秸稈產(chǎn)量分別占32.3%、22.7%和45.0%[3-4]。在我國(guó)，大量秸稈往往被就地焚燒，不但污染了環(huán)境，而且造成秸稈資源的浪費(fèi)。近年來(lái)，雖然開(kāi)發(fā)出一些新的秸稈利用技術(shù)，但是由于技術(shù)瓶頸，秸稈的利用仍然存在轉(zhuǎn)化利用率低、時(shí)間長(zhǎng)、成本偏高等問(wèn)題。秸稈的主要成分纖維素、木質(zhì)素等，是可再生資源的重要組成部分。纖維素的降解和轉(zhuǎn)化利用可以通過(guò)纖維素酶的作用進(jìn)行，不但能耗低，而且反應(yīng)溫和，且不像化學(xué)方法那樣會(huì)產(chǎn)生對(duì)環(huán)境有污染的物質(zhì)。

我國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，但在秸稈利用方面較差，開(kāi)發(fā)利用較少[5]，纖維素酶能將天然纖維素降解，生成纖維素分子鏈、纖維二糖和葡萄糖，高產(chǎn)纖維素酶微生物的篩選對(duì)解決這些問(wèn)題十分重要[6-8]，然而目前制約纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素之一是纖維素酶效率低下，從而造成生產(chǎn)成本過(guò)高[9]。因此，篩選具有高活性纖維素酶的秸稈降解微生物菌株及相關(guān)研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[10-11]。若能將秸稈合理利用，其潛力巨大，前景廣闊[12-13]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)高產(chǎn)纖維素酶的微生物開(kāi)展了大量的研究工作，左勇等[14]以羧甲基纖維素鈉為培養(yǎng)基的唯一碳源，從酒糟中分離純化出一株具有產(chǎn)纖維素酶能力的維氏芽孢桿菌P-7；傅科鶴等[15]從土壤中分離純化獲得一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株TW063-3，通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定得出，該菌株為草酸青霉，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化，酶活比優(yōu)化前提高了34.1%；何深宏等[16]從牛糞堆肥樣品中分離得到的57株菌株中篩選出10株有較高纖維素酶活力，其中菌株X10纖維素酶活力最高，為31.9 U/mL，菌株X10鑒定為解淀粉芽孢桿菌；蘭時(shí)樂(lè)等[17]從腐木上分離并篩選出1株具有較高纖維素酶活力的菌株TP01，并將其鑒定為綠色木霉，對(duì)該菌株進(jìn)行誘變處理，獲得了1株高產(chǎn)纖維素酶的突變菌株TP1202，發(fā)現(xiàn)TP1202對(duì)纖維素的降解活性高于野生型菌株TP01；王靖等[18]從快速腐爛的苧麻基質(zhì)中篩選到1株產(chǎn)纖維素酶活力較高的菌株F1-1，分析該菌株的遺傳背景，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化；但由于各種原因，均未能應(yīng)用。本文利用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法從自然界篩選出一株性能穩(wěn)定、高產(chǎn)纖維素酶的纖維素降解菌，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為其實(shí)際應(yīng)用提供一定的技術(shù)支撐。對(duì)于木質(zhì)纖維原料的應(yīng)用工藝的研究和開(kāi)發(fā)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)性發(fā)展和環(huán)境保護(hù)有著極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

磷酸二氫鉀（分析純）：宜興市第二化學(xué)試劑廠；蛋白胨（生物試劑）：上海東海制藥股份有限公司；剛果紅、羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na）（均為分析純）：中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；硫酸鎂（分析純）：上海試四赫維化工有限公司；3，5-二硝基水楊酸（分析純）：湖州生物化學(xué)有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：江蘇永豐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水葡萄糖（分析純）：成都化學(xué)試劑廠；酒石酸銨（分析純）：浙江寧?？h有機(jī)化工廠；過(guò)氧化氫（分析純）：無(wú)錫市亞盛化工有限公司；溶壁酶（生物試劑）：廣東微生物研究所；纖維素酶（≥300 U/mg）：德國(guó)SERVA公司；崩潰酶（≥3 U/g）：芬卡國(guó)際貿(mào)易（上海）公司。

1.1.2 霉菌自然樣本采集

除去地表植被和枯枝落葉后，取表面4 cm～5 cm左右的表土，來(lái)源于江蘇淮安清江浦區(qū)富麗花園西部柳樹(shù)灣保護(hù)區(qū)樹(shù)林。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10.00g，蛋白胨2.00 g，磷酸二氫鉀1.00 g，硫酸鎂0.50 g，水1 L，pH自然。

篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 10.00 g，蛋白胨2.00 g，磷酸二氫鉀1.00g，硫酸鎂0.50g，剛果紅0.03g，瓊脂18.00g，水1 L，pH自然。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：秸稈粉10.00 g，硫酸銨2.00 g，磷酸二氫鉀1.00 g，硫酸鎂0.50 g，吐溫-80 5 mL，水1 L，pH 自然。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（切片，沸水煮30 min，6層紗布過(guò)濾），葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀0.3 g，七水硫酸鎂0.15 g，瓊脂18 g，補(bǔ)水至水1 L，pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9052）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）：金壇市富華電器有限公司；自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX型）：上海申安醫(yī)療器械廠；電子天平（FA2004）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫?fù)u床（DHZ-C）：江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；分光光度計(jì)（721型）：上海棱光技術(shù)有限公司；搖床（MJ-106）：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；冰箱（BCD-215C型）：青島海爾冷凍柜總公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

1.3.1.1 富集培養(yǎng)

取10 g的土壤樣品加入裝有100 mL無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中，150r/min，28℃振蕩20min，制成土壤懸液，吸取3mL土壤懸液置于富集培養(yǎng)基中，150r/min，28℃，培養(yǎng)2 d。

1.3.1.2 菌株初步篩選

將富集培養(yǎng)后的菌懸液，按10倍法稀釋，稀釋至10-8。將上述稀釋液（10-5～10-8）涂布于篩選培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)3 d，觀察是否產(chǎn)生透明圈。挑取有透明圈的菌落，用接種針在平板上劃線，再次分離篩選，重復(fù)3次～4次。平板劃線分離后，挑取單菌落接入斜面，28℃恒溫培養(yǎng)2 d～3 d后，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 菌株復(fù)篩

初篩后菌株平板培養(yǎng)3 d后，接入PDA培養(yǎng)基活化，而后接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min發(fā)酵3 d，后每隔24 h測(cè)定一次酶活力。選取發(fā)酵酶活力高的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.1.4 纖維素酶高產(chǎn)菌株誘變

種子液培養(yǎng)2 d，過(guò)濾收集菌絲體，刮取2勺菌絲體于酶解液中，28℃，220 r/min酶解2 h～3 h，從2 h開(kāi)始鏡檢觀察原生質(zhì)體制備情況，酶解結(jié)束后，過(guò)濾收集原生質(zhì)體濾液，5 000 r/min離心10 min，收集原生質(zhì)體，用0.6 mol/L氯化鈉沖洗2遍并重懸至10 mL，分別稀釋50倍、100倍備用。將稀釋好的原生質(zhì)體溶液分別取 100 mL 涂布，進(jìn)行 0、1、2、3、4、5 min 紫外照射，每個(gè)時(shí)間梯度2個(gè)平板，28℃培養(yǎng)，分別記錄單菌落數(shù)量，繪制致死率曲線，確定最佳誘變時(shí)間。挑取單菌落進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵驗(yàn)證。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 纖維素酶酶活力的測(cè)定

1.3.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

將無(wú)水葡萄糖粉末置于105℃烘箱烘至恒重，精確稱取0.108 g葡萄糖，蒸餾水定容至100 mL，配制濃度6 μmol/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。分別取6 μmol/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于具塞試管中，加蒸餾水定容至2.5 mL，分別加1.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑[19]，沸水浴中加熱5 min，流水冷卻。再用蒸餾水稀釋10倍，混勻后以空白管為對(duì)照，530 nm測(cè)OD值。以葡萄糖微摩爾數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 粗酶液的制備

從冰箱中取出備用的菌株，接入PDA培養(yǎng)基活化，而后接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃、150 r/min搖床產(chǎn)酶發(fā)酵，取發(fā)酵液2 000 r/min離心l5 min，上清液即為粗酶液。

1.3.2.3 酶活力測(cè)定

根據(jù)葡萄糖回歸方程和測(cè)得的OD值，可由公式（1）計(jì)算纖維素酶活力。酶活力單位（U）：標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下，每分鐘從底物溶液中釋放1 μmol葡萄糖所需的酶量稱為一個(gè)酶活力單位。這里所指標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)通常是指酶反應(yīng)最佳條件。

式中：10為酶與底物作用時(shí)間，min。

1.3.2.4 CMC法測(cè)纖維素酶活力

取含有0.05 mol/L CMC-Na的醋酸緩沖液1 mL于5 mL離心管中，加入粗酶液0.50 mL，50℃酶解10 min，1 mL 10%NaOH終止反應(yīng)，加入1.50 mL DNS試劑，沸水加熱5 min，流水冷卻，稀釋10倍，530 nm測(cè)OD值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得每毫升酶液酶解產(chǎn)生的葡萄糖摩爾數(shù)[20-22]，空白為0.50 mL粗酶液，先經(jīng)1 mL 10%NaOH處理，其他操作同樣品的測(cè)定。

1.3.2.5 濾紙酶（filter paper activity，F(xiàn)PA）活力測(cè)定

于試管中加pH4.5檸檬酸緩沖液1mL，再加入1張卷曲的濾紙條（1 cm×3 cm），50℃預(yù)熱 5 min，在試管中加入0.5 mL酶液，50℃保溫10 min，1 mL 10%NaOH終止反應(yīng)，加入1.50 mL顯色液，再沸水浴5 min，流水冷卻終止反應(yīng)，用蒸餾水稀釋10倍，同時(shí)用失活的酶做對(duì)照，先以1 mL 10%NaOH使酶液失活。530 nm測(cè)OD值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到酶單位[21]。FPAase酶活力的定義：1個(gè)酶活力單位是指在50℃與pH4.8的條件下，每分鐘分解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所對(duì)應(yīng)的酶量。

1.3.2.6 外切型-β-葡聚糖（circumscribed type-βglucanase，C1）酶活力的測(cè)定

取1%的微晶纖維素溶液1.0 mL作為底物，溶劑為0.05 mol/L pH4.5的檸檬酸緩沖液，加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的纖維素酶溶液，于50℃下反應(yīng)10 min后，立即用1 mL 10%NaOH終止反應(yīng)，加入1.50 mL DNS試劑，沸水浴5 min顯色，流水冷卻終止反應(yīng)，用蒸餾水稀釋10倍，530 nm測(cè)OD值，并從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的葡萄糖濃度，折算成酶單位。同時(shí)用失活的酶作對(duì)照，先以1 mL 10%NaOH使酶液失活，其余均與上面步驟一致。

1.3.2.7 β-葡萄糖苷（β-glucosidase，BG）酶活力的測(cè)定

取1%的水楊甘（素）溶液1.0 mL作為底物，溶劑為0.05 mol/L pH4.5的檸檬酸緩沖液，加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的纖維素酶溶液，50℃反應(yīng)10 min，1 mL 10%NaOH終止反應(yīng)，加入1.50 mL DNS試劑，沸水浴5 min顯色，流水冷卻終止反應(yīng)，用蒸餾水稀釋10倍，530 nm測(cè)OD值，并從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的葡萄糖濃度，折算成酶單位。同時(shí)用失活的酶作對(duì)照，先以1 mL 10%NaOH使酶液失活，其余均與上面步驟一致。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 培養(yǎng)基試驗(yàn)

采用菌種復(fù)篩發(fā)酵條件，分別將氮源調(diào)整為硫酸銨、硝酸銨、蛋白胨、尿素、酵母膏，最終含氮量為0.8%，以研究不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響；分別將誘導(dǎo)物（用量10 g/L）調(diào)整為玉米芯提取物、秸稈粉、麩皮，以研究不同物質(zhì)對(duì)菌株誘導(dǎo)產(chǎn)酶的影響。

1.3.3.2 單因素爬坡試驗(yàn)

將最適氮源的質(zhì)量濃度調(diào)至1 g/L～3 g/L，最適誘導(dǎo)物的質(zhì)量濃度調(diào)至5 g/L～15 g/L，磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度 0.5 g/L～1.5 g/L、硫酸鎂 0～1 g/L，吐溫-80 0～10 mL/L，以研究氮源、誘導(dǎo)物、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、吐溫-80對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of steepest climbing

1.3.4 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素爬坡試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)秸稈粉、蛋白胨、吐溫-80進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，響應(yīng)值為纖維素酶活力，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Response surface experiment design

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3），采用origin 8.0和Design-expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

從土壤樣本中共篩得到8株菌株，其中有3株（S-1、S-2、S-3）可在初篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)后產(chǎn)生透明圈，3株菌菌絲和孢子的形態(tài)如圖1所示。

圖1 3株菌的菌絲、孢子Fig.1 Hyphae and spores of 3 strains of bacteria

2.2 纖維素酶活力

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在OD530的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 2），線性回歸方程：y=0.077x-0.020，R2=0.997。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Glucose standard curve

通過(guò)液體產(chǎn)酶發(fā)酵試驗(yàn)，獲得了菌株S-1、S-2、S-3的4種酶活力，結(jié)果如表3所示。

表3 不同菌株纖維素酶活力Table 3 Cellulase activity of different strains U/mL

綜合比較S-1、S-2和S-3試樣的各類酶活力，可知S-2菌株試樣的酶活力整體上高于另外兩株試樣的酶活力，因此選擇S-2菌株作為后繼研究菌株。

2.3 高產(chǎn)菌株誘變及遺傳穩(wěn)定性

2.3.1 高產(chǎn)菌株紫外誘變

記錄紫外誘變 0、1、2、3、4、5 min 后單菌落的數(shù)量，繪制致死率曲線，結(jié)果如圖3所示。

圖3 致死率曲線Fig.3 The lethality curve

由圖3可知，照射4 min時(shí)，致死率可達(dá)70%以上，因此確定4 min為最佳誘變時(shí)間。紫外誘變后選取水解圈直徑較大的菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，分別編號(hào)為SUV2-1、SUV2-2、SUV2-3、SUV2-4，SUV2-5，SUV2-6，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)3次，測(cè)定平均酶活力，結(jié)果如圖4～圖7所示。

由圖4～圖7可知，SUV2-1產(chǎn)C1酶活力最大，可達(dá)0.64 U/mL，SUV2-2產(chǎn)BG酶活力最大可達(dá)1.52 U/mL，SUV2-3產(chǎn)CMC酶和FPA酶活力最大，分別達(dá)到0.52 U/mL和0.35 U/mL。

圖4 誘變后菌株的CMC酶活力Fig.4 CMC activity of the mutagenized strain

圖5 誘變后菌株的C1酶活力Fig.5 C1 activity of the mutagenized strain

圖6 誘變后菌株的BG酶活力Fig.6 BG activity of the mutagenized strain

圖7 誘變后菌株的FPA酶活力Fig.7 FPA activity of the mutagenized strain

2.3.2 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將誘變后的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，菌株的酶活力如表4所示。

表4 傳代培養(yǎng)的4代菌株的活力Table 4 Enzyme activity of the four generations of subcultured strains U/mL

從表3可以看出，SUV2-1菌株4種酶都略有降低，但較為穩(wěn)定；SUV2-2和SUV2-3兩株菌分別有BG、CMC的最大酶活力，分別為1.48 U/mL和0.52 U/mL但其并不穩(wěn)定，且其他酶活力并不理想；SUV2-4、SUV2-5、SUV2-6 3株菌酶活力都相對(duì)較低。綜上來(lái)看，此次紫外誘變SUV2-1菌株酶活力明顯提高，CMC酶活力最大達(dá)到0.48 U/mL，相對(duì)誘變前提高了9.58%；C1酶活力最大達(dá)到0.57 U/mL，相對(duì)提高了32.69%；BG酶活力最大達(dá)到1.37 U/mL，相對(duì)提高了52.60%；FPA酶活力最大達(dá)到0.30 U/mL，相對(duì)提高了40.93%，且較為穩(wěn)定。將SUV2-1菌株保藏，進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8～圖11。

由圖8可知，不同氮源對(duì)SUV2-1產(chǎn)酶的影響不同，添加蛋白胨效果最佳，酵母膏次之，添加尿素的效果最差。纖維素酶是一種誘導(dǎo)酶，因此在發(fā)酵過(guò)程中通常需要添加誘導(dǎo)物以提高發(fā)酵產(chǎn)酶水平，如圖10可知，使用秸稈粉的CMC酶活力最大達(dá)到0.45 U/mL，3種誘導(dǎo)物中最高，C1酶活力最高達(dá)到0.45 U/mL，F(xiàn)PA酶活力最高達(dá)到0.21 U/mL，BG酶的誘導(dǎo)作用達(dá)到最大值0.90 U/mL，效果最為明顯。綜合以上4種酶活力，因此秸稈粉誘導(dǎo)作用更為明顯。

圖8 氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of nitrogen source on enzyme production

圖9 誘導(dǎo)物玉米芯提取物對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of the inducer corncob extract on enzyme production

圖10 誘導(dǎo)物秸稈粉對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of inducer straw powder on enzyme production

圖11 誘導(dǎo)物麩皮對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effect of inducer bran on enzyme production

2.3.4 單因素爬坡試驗(yàn)

選擇單因素試驗(yàn)中產(chǎn)酶效果最好的蛋白胨、秸稈粉，以及培養(yǎng)基中其它組分磷酸二氫鉀、硫酸鎂、吐溫-80進(jìn)行單因素爬坡試驗(yàn)，結(jié)果如圖12～圖16所示。

圖12 蛋白胨對(duì)SUV2-1產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.12 Effect of peptone on the production of cellulase from SUV2-1

圖13 秸稈粉對(duì)SUV2-1產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.13 Effect of straw powder on the production of cellulase from SUV2-1

圖14 磷酸二氫鉀對(duì)SUV2-1產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.14 Effect of potassium dihydrogen phosphate on the production of cellulase from SUV2-1

圖15 硫酸鎂對(duì)SUV2-1產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.15 Effect of magnesium sulfate on the production of cellulase from SUV2-1

圖16 吐溫-80對(duì)SUV2-1產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.16 Effect of tween-80 on the production of cellulase from SUV2-1

由圖12～圖16可知，對(duì)產(chǎn)酶影響最大的3個(gè)因素分別為蛋白胨、秸稈粉和吐溫-80，濃度分別在2、10 g/L和2.5 mL/L時(shí)產(chǎn)酶活力最高。

2.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

使用爬坡試驗(yàn)中獲得的各因子對(duì)應(yīng)的最適產(chǎn)酶濃度為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)并開(kāi)展試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示?；貧w模型方差分析見(jiàn)表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析Table 5 Analysis of response surface experiment results

從表6中可以看出，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=96.05%，表明多項(xiàng)式模型方程具有較高的擬合程度，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有較大的相關(guān)性；模型F=23.93，P=0.000 2，說(shuō)明回歸模型是顯著的；失擬項(xiàng)F=0.42，P=0.746 1>0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)是不顯著的?？梢杂么四Ｐ蛯?duì)產(chǎn)纖維素酶菌株發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。經(jīng)過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析，得到二次多元回歸方程：Y=0.43+0.023X1+0.024X2+0.013X3+0.031X1X2+0.004545X1X3+0.0006494X2X3-0.031X12-0.027X22-0.035X32。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Regression analysis of variance

根據(jù)響應(yīng)面回歸方程可以利用Design-Expert軟件繪制響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖17～圖19。

圖17～圖19直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，比較3組圖可知：圖18中AB對(duì)產(chǎn)酶的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；圖17中AC對(duì)產(chǎn)酶的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線有一定陡峭；圖19中BC對(duì)產(chǎn)酶的影響最小，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化相對(duì)較小。綜上可知：3個(gè)因素兩兩之間相互影響的主次關(guān)系：AB>AC>BC。

圖17 秸稈粉和吐溫-80含量交互作用對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.17 Effect of interaction between straw powder and Tween-80 content on enzyme production

圖18 秸稈粉和蛋白胨含量交互作用對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.18 Effect of interaction between straw powder and peptone content on enzyme production

圖19 吐溫-80和蛋白胨含量交互作用對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.19 Effect of interaction between Tween-80 and peptone content on enzyme production

2.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，在秸稈粉、蛋白胨、吐溫-80含量分別為11.63 g/L、2.33 g/L和2.71 mL/L的最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次試驗(yàn)平均值為0.46 U/mL，與預(yù)測(cè)值0.454 5 U/mL十分接近，充分說(shuō)明模型是可靠的。

3 結(jié)論

本研究從自然界篩選以及紫外誘變獲取性狀優(yōu)良的產(chǎn)纖維素酶菌株SUV2-1。結(jié)果表明，S-2經(jīng)誘變后產(chǎn)不同種類纖維素酶（CM酶、FPA酶、C1酶、BG酶）的活力有所不同，可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用情況，分別選擇適合的菌株。單因素試驗(yàn)選擇誘導(dǎo)物時(shí)，發(fā)現(xiàn)秸稈粉誘導(dǎo)作用較好，其原因有可能是秸稈粉含有的粗纖維高達(dá)30%以上，高于玉米芯及麩皮。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到菌株發(fā)酵最佳條件：秸稈粉、蛋白胨、吐溫-80含量分別為11.63 g/L、2.33 g/L和2.71 mL/L，產(chǎn)生纖維素酶活力的最大值為0.46 U/mL。本研究為纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育建提供了1株良好出發(fā)菌株，發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果為該菌株的后續(xù)放大發(fā)酵和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。