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        超聲輔助吐溫80提取發(fā)芽小米GABA和多酚的工藝優(yōu)化

        2022-12-20 04:22:54高曉麗鮑玉琪
        食品研究與開發(fā) 2022年24期
        關(guān)鍵詞:吐溫小米功率

        高曉麗,鮑玉琪

        (呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系,山西 呂梁 033001)

        小米,也稱之為粟或稷,是禾本科草本植物粟米經(jīng)加工脫殼后的成品。小米中除富含維生素B1、B12、不飽和脂肪酸外,還含有纖維素、植物甾醇、多酚活性物質(zhì)、γ-氨基丁酸(gamma-amino butyric acid,GABA)等多種功能性成分[1]。多酚是具有多個酚基團的一類化學(xué)元素的總稱[2],小米中所含有的酚類物質(zhì)包括單寧、植酸、酚酸及其衍生物等,所有這些酚類物質(zhì)都具有降血糖、抗致突變、抗炎、抗衰老、防輻射等獨特的生理功效[3]。GABA是一種游離氨基酸,主要存在于胚芽中,在植物生長發(fā)育中發(fā)揮保護功能[4],還可促進酚類物質(zhì)合成從而增強植物抗逆性[5-7]。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,具有抗壓健腦、增強長期記憶[8]、降血壓、抗焦慮[9]、解毒等多種功效[10]。植物中一般GABA含量較低[11],但在受到刺激時含量會大量提升,如楊樹葉在受鹽脅迫后GABA含量增加了2倍[12],機械損傷可使鮮切梨GABA累積[13],而粟米發(fā)芽過程中因相關(guān)內(nèi)源酶激活而使發(fā)芽小米中酚類、黃酮類化合物及GABA的含量提升[14-15]。

        基于發(fā)芽谷物較高的營養(yǎng)價值,目前國內(nèi)有較多的相關(guān)研究。徐麗[16]的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)芽處理的小米GABA含量提高了2.9倍,其得率為251.46 mg/100 g;李彩云[17]的研究表明粟谷樣品中黃酮、總氨基酸含量和必需氨基酸含量會隨發(fā)芽時間的延長而增加;沙坤等[18]的研究發(fā)現(xiàn)粟米在發(fā)芽過程中總酚含量逐漸增加,在72 h后趨于平緩,總酚含量達到約1.7 mg/g。以上研究都表明發(fā)芽可以有效提升小米中GABA和多酚的含量。

        超聲波輔助表面活性劑提取法與傳統(tǒng)提取法相比,因具有提取時間短、效率高的優(yōu)點而被廣泛研究與應(yīng)用。陳瓊等[19]的研究表明此法能優(yōu)化青錢柳中總黃酮的提取;肖道安[20]在吐溫80協(xié)同酶法提取桑葉總黃酮的研究中發(fā)現(xiàn)吐溫80有顯著的增溶作用。本文旨在通過超聲輔助-表面活性劑法富集發(fā)芽小米中GABA和多酚物質(zhì)的含量,提高發(fā)芽小米GABA和多酚的得率,為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù),以期降低成產(chǎn)成本。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        谷米:山西天公種業(yè)有限公司;谷芽:安國市廣盛商貿(mào)有限公司;吐溫80(化學(xué)純):天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純98%):上海源葉生物科技有限公司;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純98%)、福林酚試劑:國藥集團化學(xué)試劑有限公司;次氯酸鈉、重蒸酚、硼酸(化學(xué)純):天津市化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ):鄭州長城科工貿(mào)有限公司;超聲波清洗機(SB-3200DTDN):寧波新芝生物科技股份有限公司;生化培養(yǎng)箱(SPX-250):上海躍進醫(yī)療器械有限公司;高速萬能粉碎機(FW-400A):北京科偉永興儀器有限公司;可見分光光度計(VIS-723N):北京瑞利分析儀器有限公司;臺式高速離心機(Neofuge13):上海力申科學(xué)儀器有限公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 發(fā)芽小米制備與前處理

        谷米經(jīng)除雜和清洗后與3.5 mmoL/L的CaCl2溶液以 1∶10(mg/mL)的比例混合,35℃下浸泡 12 h后平鋪放入墊有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi),再覆蓋上六層紗布,控制發(fā)芽濕度95%,在30℃下發(fā)芽72 h,之后45℃下烘干制得成品發(fā)芽小米。

        參考寧亞維等[21]的方法脫除發(fā)芽小米中的黃色素:準(zhǔn)確稱取干燥后的發(fā)芽小米粉1.0 g置于錐形瓶中,首先加入5 mL無水乙醇提取發(fā)芽小米中的黃色素,于60℃水浴保溫2 h,然后于8 000 r/min、離心20 min以后,上清液即為黃色素提取液,將其棄去留取沉淀物。1.3.2 GABA的提取和優(yōu)化試驗

        1.3.2.1 GABA的提取與測定

        取上述沉淀物,按一定料液比加入吐溫80溶液,設(shè)置提取溫度、超聲功率,經(jīng)超聲提取后,測定GABA得率??瞻讓φ眨好撊S色素的沉淀物加10倍蒸餾水于40℃下浸提1 h,每隔10 min搖動一次,得粗提液。粗提液于10 000 r/min條件下離心15 min后得到待測提取液,測定GABA得率。參照趙大偉等[22]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定GABA含量。

        1.3.2.2 單因素試驗

        取脫除黃色素的發(fā)芽小米沉淀物5份,設(shè)置不同吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%、2%、4%、6%、8%)、超聲溫度(20、25、30、35、40 ℃)、超聲時間(5、15、25、35、45 min)、料液比[1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22(g/mL)]、超聲功率(90、108、126、144、162 W),研究各單因素對 GABA 得率的影響。以吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、料液比1∶20(g/mL)、超聲溫度25℃、超聲時間15 min、超聲功率126 W為基準(zhǔn)進行試驗。

        1.3.2.3 正交試驗

        以GABA得率為指標(biāo),以吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時間、料液比和超聲功率5個因素作為影響發(fā)芽小米多酚得率的主要因素,并設(shè)計L16(45)正交試驗,正交試驗因素水平見表1。

        表1 GABA提取正交試驗因素水平Table 1 Factor level of GABA extraction orthogonal test

        1.3.3 多酚的提取和優(yōu)化試驗

        1.3.3.1 多酚提取與測定

        取脫去黃色素的發(fā)芽小米沉淀物,加入5倍質(zhì)量、體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇和一定量的吐溫80溶液,設(shè)定超聲功率162 W,在不同溫度下提取多酚,測其得率。

        空白對照:取脫去黃色素后的沉淀物,加入5倍70%的乙醇,真空抽濾后在5 000 r/min的條件下離心10 min,定容得到待測提取液。多酚含量測定參照朱仙慕等[23]和王若蘭等[24]的Folin-Ciocaltue法測定。

        1.3.3.2 單因素試驗

        取經(jīng)脫去黃色素的發(fā)芽小米沉淀物5份,設(shè)置不同吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5%、10%、15%、20%、25%)、超聲溫度(25、35、45、55、65 ℃)、超聲時間(10、20、30、40、50 min)、料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)]作為4個單因素,考察各因素對多酚得率的影響。以吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%、料液比 1∶10(g/mL),超聲溫度 45℃、超聲時間10 min為基準(zhǔn)試驗條件。

        1.3.3.3 響應(yīng)面試驗

        以吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時間、料液比4個因素為自變量,選取得率較高的3個水平,以多酚得率為響應(yīng)值,分析各因素對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面試驗設(shè)計見表2。

        表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 2 Response surface experimental design

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        用origin 2018進行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制;采用正交設(shè)計軟件進行正交設(shè)計及方差分析確定發(fā)芽小米GABA最佳提取工藝;采用Design-Expert 10.0軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗,并進行方差分析優(yōu)化多酚提取工藝。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 GABA的提取

        2.1.1 單因素試驗

        2.1.1.1 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對GABA得率的影響

        吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對GABA得率的影響見圖1。

        圖1 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對GABA得率的影響Fig.1 Effect of Tween 80 mass fraction on GABA yield

        經(jīng)試驗得到空白對照組GABA的得率為1.213mg/g。由圖1可知,與空白組相比,加入吐溫80后GABA的得率大幅度增加,原因可能是由于GABA自身極易溶于水,且吐溫80作為增溶劑可以降低溶液表面張力,更利于被超聲波破碎的細胞中易溶性物質(zhì)的浸出;吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時,隨著吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,GABA的得率不斷減小,其原因可能是吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到了臨界膠束濃度,且其對其它雜質(zhì)的增溶作用也會影響吸光度的大小[25]。由此可以確定最佳吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

        2.1.1.2 超聲溫度對GABA得率的影響

        超聲溫度對GABA得率的影響見圖2。

        圖2 超聲溫度對GABA得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on GABA yield

        由圖2可知,GABA得率隨超聲溫度的升高先增大后減少,當(dāng)超聲溫度為30℃時得率最高。此變化的原因可能是溫度較低,分子的熱運動緩慢,在較短的時間不能完全浸出;當(dāng)溫度上升至超過30℃時,其得率下降,原因可能是由于,溫度過高,破壞了GABA結(jié)構(gòu),使得GABA從提取液中析出,其得率反而下降[26],可初步確定因素最佳水平為30℃。

        2.1.1.3 超聲時間對GABA得率的影響

        超聲時間對GABA得率的影響見圖3。

        圖3 超聲時間對GABA得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on GABA yield

        由圖3可知,在控制其它條件不變的情況下,隨超聲時間的延長,GABA得率在5 min~25 min內(nèi)不斷增加,當(dāng)超聲時間達到25 min時,發(fā)芽小米GABA的得率達到最大值(2.219 mg/g);而繼續(xù)延長超聲波提取時間,GABA得率的增加效果并不明顯,且逐漸趨于平穩(wěn)。可能是因為在此條件下,提取液中溶質(zhì)濃度已經(jīng)達到固液平衡,延長超聲時間提取效果優(yōu)化并不明顯。確定GABA適宜的超聲提取時間為25 min。

        2.1.1.4 料液比對GABA得率的影響

        料液比對GABA得率的影響見圖4。

        圖4 料液比對GABA得率的影響Fig.4 Effect of material liquid ratio on GABA yield

        由圖 4 可知,料液比為 1∶14(g/mL)~1∶20(g/mL)時,隨著提取溶劑用量的增加,發(fā)芽小米粉與料液的接觸面積增大,使得GABA的得率增加;在1∶20(g/mL)之后,繼續(xù)增加濃度差不僅使得單位提取液中GABA的濃度降低,而且增大提取溶劑用量的同時會增加生產(chǎn)成本,因此從生產(chǎn)成本和GABA提取效果兩個角度考慮,確定最佳的提取料液比為1∶20(g/mL)。

        2.1.1.5 超聲功率對GABA得率的影響

        超聲功率對GABA得率的影響見圖5。

        圖5 超聲功率對GABA得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on GABA yield

        由圖5可知,GABA得率隨著超聲功率的增加先增大,當(dāng)超聲功率為126 W時得率達到最大值,這可能是由于在90 W~108 W內(nèi),隨超聲功率增加其振動頻率也增大,分子熱運動加劇,使得GABA更容易溶出[27],故其得率不斷增加;超聲功率在108 W~126 W時,GABA的增長幅度較小,可能是因為超聲波對發(fā)芽小米細胞的破壞作用使得GABA的溶出較完全,繼續(xù)增大功率其得率不會顯著增大;當(dāng)超聲功率大于126 W時,GABA得率降低,但降低趨勢較為平緩。其原因可能是盡管GABA分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,但超聲波功率過高也會對GABA分子結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用,影響其得率。因此從節(jié)約能源和提取效果兩方面考慮,確定最適超聲功率為126 W。

        2.1.2 正交優(yōu)化試驗

        正交試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

        表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

        由表3可知,正交試驗最佳提取工藝條件為A3B4C2D2E2,即吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%,超聲溫度為35℃,超聲時間 25 min,料液比 1∶18(g/mL),超聲功率為126 W。比較4個因素的極差大小可知對評價指標(biāo)影響的大小關(guān)系依次為A、E、D、B、C,其中吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對得率的影響最大,其次是超聲功率、料液比、超聲溫度,超聲時間的影響最小。

        對數(shù)據(jù)進行方差分析,結(jié)果見表4和表5。

        表4 方差分析(a=0.05)Table 4 Analysis of variance

        表5 方差分析(a=0.01)Table 5 Analysis of variance

        方差分析結(jié)果表明在a=0.05時,5個因素對GABA得率無顯著性影響;在a=0.01時,A對GABA得率有顯著性影響。綜上所述,最佳提取工藝條件為A3B4C2D2E2,即吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%,超聲溫度為35℃,超聲時間25 min,料液比 1∶18(g/mL),超聲功率為 126 W。

        2.1.3 驗證試驗

        根據(jù)正交試驗結(jié)果,最佳條件下得到發(fā)芽小米GABA的最終得率為4.70 mg/g,優(yōu)于其它試驗組。

        2.2 多酚提取

        2.2.1 單因素試驗

        2.2.1.1 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響

        吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響見圖6。

        經(jīng)試驗得到空白對照組多酚得率為0.651 mg/g。由圖6可知,在吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~10%時,多酚得率隨其濃度的增加而增大,這可能是由于吐溫80的增溶作用加速了多酚物質(zhì)的浸出;但當(dāng)吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%時,得率開始不斷降低,原因可能是其濃度過高大于臨界膠束濃度,溶入膠束中的多酚活性物質(zhì)的再溶出受到阻礙[28],引起多酚得率下降。

        圖6 吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響Fig.6 Effect of Tween 80 mass fraction on polyphenol yield

        2.2.1.2 超聲溫度對多酚得率的影響

        超聲溫度對多酚得率的影響見圖7。

        圖7 超聲溫度對多酚得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield

        由圖7可知,多酚得率在25℃~45℃時,隨溫度的升高而升高,當(dāng)溫度達到45℃時,多酚得率達到峰值,呈現(xiàn)此變化趨勢的原因可能是淀粉加速破裂加快了多酚物質(zhì)溶出以及吐溫80分子的熱運動加劇有利于對多酚的浸提;繼續(xù)升高溫度多酚的得率反而下降,其原因可能是由于高溫破壞了多酚的結(jié)構(gòu)且會使溶劑蒸發(fā),導(dǎo)致料液比發(fā)生變化,多酚得率減少。因此選擇超聲溫度45℃較為適宜。

        2.2.1.3 超聲時間對多酚得率的影響

        超聲時間對多酚得率的影響見圖8。

        圖8 超聲時間對多酚得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on polyphenol yield

        由圖8可知,在超聲時間為0~20 min時,多酚得率大幅度增加,呈現(xiàn)此趨勢可能是由于延長超聲時間,超聲波的機械作用加速多酚物質(zhì)的溶出,使多酚得率增加;超聲時間在20 min時,多酚得率達到最高點;之后再延長超聲時間,多酚得率急劇下降,可能是因為多酚分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,在超聲波的空化作用產(chǎn)生的羥基自由基的作用下使得多酚氧化速率加快[29],造成多酚物質(zhì)的得率降低,與此同時長時間暴露于空氣中的多酚易于被氧化和分解。故選取20 min為最佳超聲提取時間。

        2.2.1.4 料液比對多酚得率的影響

        料液比對多酚得率的影響見圖9。

        圖9 料液比多酚對得率的影響Fig.9 Effect of material liquid ratio on polyphenol yield

        由圖 9 可知,料液比在 1∶5(g/mL)~1∶15(g/mL)時,發(fā)芽小米粉中多酚的得率因提取溶劑用量的增多而增加,料液比為 1∶15(g/mL)時,多酚得率最高;當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加時,多酚得率反而降低,這可能是在此條件下提取溶劑的濃度梯度達到極限值。提取原料和提取溶劑的濃度梯度是提取物溶出的動力,較大的濃度梯度有利于提取物的溶出,但當(dāng)此濃度梯度達到一定極限時,繼續(xù)增加濃度梯度對提取物的溶出反而起抑制作用[30],因此料液比選擇 1∶15(g/mL)最合適。

        2.2.2 多酚提取優(yōu)化試驗

        響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果如表6所示。

        表6 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 6 Response surface test results

        用Design Expert10.0軟件對此模型進行分析,經(jīng)擬合后得到該模型的回歸多項式方程:Y=1.97-0.089A-0.13B-0.056C+0.066D+0.057AB-0.11AC-0.18AD+0.26BC-0.082BD+0.027CD-0.34A2-0.36B2-0.38C2-0.27D2。

        方差分析結(jié)果見表7。

        由表7可知,此提取模型的P值小于0.000 1,說明該模型為極顯著,適用于發(fā)芽小米多酚提取過程;失擬誤差項P值為0.190 4>0.05,說明其為不顯著,即模型與試驗值的誤差較??;其決定系數(shù)R2=0.964 5,說明發(fā)芽小米多酚提取得率的試驗值與預(yù)測值之間有較高的擬合度;Radj2=0.929 1,Rpred2=0.815 9,兩者的差異較小,表明此模型可較好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系;信噪比為17.436大于4,即表示該模型可以用于預(yù)測。此二次回歸模型中因素C、D、AC對多酚得率的影響顯著;A、AD對多酚得率的影響為高度顯著;B、BC、A2、B2、C2、D2對多酚得率的影響為極顯著;因素AB、BD、CD對多酚得率的影響為不顯著。各因素的均方值可以反映出試驗因素對響應(yīng)值多酚得率的重要性,均方值越大,表明對響應(yīng)值的影響程度越大。從表7可得對響應(yīng)值影響大小的因素依次為B>A>D>C。

        表7 回歸方程的方差分析及顯著性檢驗Table 7 Variance analysis and significance test of regression equation

        用響應(yīng)面軟件得到各因素之間交互作用強弱的曲面圖和等高線圖,見圖10。

        圖10 各因素兩兩之間交互作用的曲面圖和等高線圖Fig.10 Surface diagram and contour map of the interaction between two single factors

        由圖10依據(jù)等高線圖的形狀可以較為清晰觀察出響應(yīng)值交互作用的顯著性,AC、AD、BC為橢圓形表示交互作用顯著,AB、BD、CD近似為圓形表示交互作用不顯著。

        2.2.3 驗證試驗

        依據(jù)響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果,最佳工藝條件:吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%、超聲溫度42℃、超聲時間19 min、料液比1∶12.5(g/mL),在此條件下得到發(fā)芽小米多酚得率為1.99 mg/g,與預(yù)測值接近。

        3 結(jié)論

        本文以發(fā)芽小米為研究對象,采用超聲輔助表面活性劑法提取發(fā)芽小米中的GABA和多酚物質(zhì)。以吐溫80水溶液作為提取劑,在料液比1∶18(g/mL),吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%,超聲功率為126 W,超聲時間25 min,超聲溫度35℃的條件下,發(fā)芽小米GABA得率最高,為4.70 mg/g。以吐溫80水溶液和60%的乙醇溶液作為浸提溶劑,通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)芽小米多酚提取工藝,結(jié)果表明最佳提取工藝條件為吐溫80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%、超聲溫度為42℃、超聲時間為19 min、料液比為1∶12.5(g/mL)時,多酚得率為 1.99 mg/g。本研究對發(fā)芽作物活性物質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化,在本研究中首次將吐溫80應(yīng)用于發(fā)芽小米GABA和多酚的提取,并采用超聲予以輔助,有效提升了GABA和多酚的得率,可為發(fā)芽產(chǎn)品以及活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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