李晨京，馮怡華，王春玲

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

紫甘薯，屬于旋花科甘薯屬，是一種雙子葉農(nóng)業(yè)作物[1]。它在世界的三大溫度帶（熱帶、副熱帶和溫帶）地區(qū)種植廣泛，因其產(chǎn)量高和對不同環(huán)境、溫度和土壤條件的適應(yīng)能力強，紫甘薯被認(rèn)為是甘薯市場上最有優(yōu)勢的經(jīng)濟作物之一[2]。我國于20世紀(jì)90年代引進紫甘薯，并在河北、河南、山東、江蘇等地種植[3]。紫甘薯營養(yǎng)豐富，與普通甘薯相比，其含有更多的氨基酸、淀粉、可溶性糖、花青素等[4]。近幾年，紫甘薯以其特有的營養(yǎng)價值受到越來越多人的喜愛，因此其種植面積也呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢，市場開發(fā)潛力很大。

植物多糖是一種具有生物活性的大分子，由相同或不同數(shù)量的單糖組成，研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗炎、預(yù)防癌癥、抗氧化、降低血糖、保護肝臟[5-8]等多種生物活性，是保健類食品開發(fā)的重要原料之一。目前能夠參與體內(nèi)生理功能的天然多糖已被鑒定出300多種[9]，且大部分植物多糖都比較安全，不會產(chǎn)生明顯的副作用[10]。多糖提取方法有很多，酸法和堿法提取多糖時，由于提取液的酸堿度比較高，容易引起糖苷鍵斷裂，破壞多糖結(jié)構(gòu)[11-12]。超聲波輔助提取和微波輔助提取雖然可以比較徹底地破壞細(xì)胞壁，提高多糖的提取率，但也會對多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用[13]。而熱水提取是在一定的溫度和時間內(nèi)提取多糖[14]，它因具有成本低、操作簡單、試劑無污染、提高多糖的溶解度等優(yōu)點而備受青睞。近年來對于紫甘薯，國內(nèi)外的學(xué)者的研究主要集中于對其花青素[15]、黃酮類化合物[16]、酚酸衍生物[17]等具有活性成分的物質(zhì)分離，但是對紫甘薯多糖的提取、工藝的優(yōu)化以及結(jié)構(gòu)鑒定的研究鮮見。

因此，本試驗以紫甘薯為原料，采用熱水提取法提取多糖，通過單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取工藝，并對紫甘薯多糖進行分離純化和結(jié)構(gòu)分析鑒定，為后續(xù)的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘薯（紫羅蘭品種）：市售。

石油醚、無水乙醇、正丁醇、濃硫酸、三氟乙酸、甲醇（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠；三氯甲烷（分析純）：上海藍(lán)季科技公司；重蒸酚、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（分析純）、Sepharose 4B、α-淀粉酶（≥40 000 U/g，食品級）、糖化酶（≥100 000 U/g，食品級）、蛋白酶（≥100 000 U/g，食品級）、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸（均為分析純）：北京Sorlabio生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能粉碎機（1500C）：東莞市華泰電器有限公司；Freezone凍干機（6 plus）：美國 Labconco公司；精密天平（Q224-1CN）：美國Sartorius公司；磁力攪拌器（Tex-Ⅱ）、高性能臺式離心機（X1R）、酶標(biāo)儀（MULTISKAN GO）、高效陰離子色譜儀（ICS-5000+）：美國Thermo公司；電熱恒溫水浴鍋（BCI-HW）：上海醫(yī)療器械五廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（3000A）、自動部分收集器（BSZ-100）：上海亞榮生化儀器廠；蠕動泵（100M）：保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司；高效液相色譜儀（LC20A）：日本島津公司；紫外分光光度計（U-T6）：上海屹譜儀器制造有限公司；傅里葉變換紅外光譜檢測儀（IS50）：美國布魯克儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫甘薯預(yù)處理

紫甘薯洗凈、去皮，切成5 cm×0.5 cm×0.5 cm的矩形長條，-80℃凍干機中冷凍干燥24 h至無水分，粉碎過篩后裝袋儲存在干燥器中。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 提取溫度對紫甘薯多糖提取率的影響

每份稱取10 g紫甘薯粉末，共計5份。在設(shè)定提取時間 2.5 h、液料比為 20∶1（mL/g）的條件下，于 50、60、70、80、90℃的溫度下提取多糖，離心收集上清液并濃縮。水浴鍋60℃加熱濃縮液，加入適量糖化酶水解30 min后溫度調(diào)至95℃，加入適量淀粉酶水解15 min，冷卻至室溫（26℃）。結(jié)束后，緩慢加入濃縮液體積4倍的無水乙醇，4℃冷藏12 h，離心后除去上清，加入適量蒸餾水復(fù)溶。采用蛋白酶-Sevag聯(lián)合法除蛋白，首先水浴鍋70℃加熱后，加入適量蛋白酶水解30 min后冷卻；其次加入1/4多糖溶液體積的Sevag試劑，搖床均勻振蕩15 min離心除去白色沉淀物，重復(fù)此操作6次。AB-8大孔吸附樹脂脫除色素，作用時間為12 h，結(jié)束后用蒸餾水沖洗3次樹脂以充分獲得全部多糖。除去色素的多糖溶液濃縮至1/10體積，凍干后得到紫甘薯多糖。測定糖含量，得出提取率。

1.3.2.2 提取時間對紫甘薯多糖提取率的影響

每份稱量10 g紫甘薯粉末，共計5份。設(shè)定提取溫度80℃、液料比為20∶1（mL/g）恒定不變，提取時間分別取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。其余操作步驟同 1.3.2.1。

1.3.2.3 液料比對紫甘薯多糖提取率的影響

每份稱量10 g紫甘薯粉末，共計5份。設(shè)定提取溫度80℃、提取時間為2.5 h恒定不變，液料比分別取5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）。其余操作步驟同1.3.2.1。

1.3.3 紫甘薯多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[18]測定紫甘薯中的多糖含量。

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取干燥無水的葡萄糖10.0 mg，使用100 mL容量瓶定容，即得到0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。分別吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 于各試管中，蒸餾水補足至終體積為1.0 mL。向各管加入5.0 mL濃硫酸與1.0 mL 6%苯酚，均勻振蕩后加熱煮沸15 min，冷卻后于490 nm測定吸光值。

1.3.3.2 紫甘薯多糖含量的測定

稱取一定質(zhì)量的多糖，定容至250 mL，依照標(biāo)椎曲線的方法加入試劑進行試驗，并以此計算出紫甘薯多糖的提取率。紫甘薯多糖提取率的計算如下。

式中：R為紫甘薯多糖的提取率，%；C為紫甘薯多糖濃度，μg/mL；V為樣液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；W為所稱樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 響應(yīng)面試驗

響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Response surface experiment factors and levels

1.3.5 紫甘薯多糖的分離純化

Sepharose 4B的特點是分子量分離范圍較大，根據(jù)它的特點選用其作為層析的填料進行紫甘薯多糖的分離和純化，方法參考文獻(xiàn)[19]并進行適當(dāng)修改。

將紫甘薯粗多糖用超純水配制成20mg/mL的多糖溶液，過0.22μm水系濾膜后在Sepharose4B（id1.6cm×60 cm）凝膠層析柱中上樣2.0 mL，以超純水洗脫，流速設(shè)置為0.5 mL/min，每管的收集時間設(shè)定為4 min，用苯酚-硫酸法檢測各管吸光值，將收集管數(shù)作為橫坐標(biāo)，各管的吸光度值作為縱坐標(biāo)，繪制紫甘薯多糖的洗脫曲線。根據(jù)曲線將洗脫峰對應(yīng)管數(shù)分別合并收集，低溫真空冷凍干燥，得純化后多糖組分。

1.3.6 多糖的分子量測定

采用高效液相色譜法進行紫甘薯多糖的純度鑒定。精確稱量標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖各5.0 mg，分子量分別為4×104、1×105、2×105、5×105、1×106、2×106。1 mL 超純水溶解后，過0.22 μm水系膜除雜，進樣針吸取20 μL進樣。根據(jù)不同分子量葡聚糖的出峰時間制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

純多糖按照上述方法進行溶解，過膜后上樣，采用高效液相色譜法進行檢測，根據(jù)保留時間按照回歸方程計算分子量。

1.3.7 紫甘薯多糖的純度鑒定

紫外分光光度計在200 nm～400 nm處掃描濃度為1.0 mg/mL的純多糖溶液?；?60 nm和280 nm處曲線是否光滑來判定多糖中是否存在核酸和蛋白質(zhì)[20]。

1.3.8 紅外光譜分析

首先稱量100 mg干燥的KBr，研磨成粉末后模具加壓1 min制成近乎透明的薄片，紅外光譜儀在4 000 cm-1～400 cm-1內(nèi)進行掃描，測定空白背景。1 mg干燥至恒重的純多糖與100 mg KBr混合后迅速研磨至粉狀，制片后采用相同方法掃描并分析多糖的特征吸收峰。

1.3.9 單糖組成分析

1.3.9.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的配制

稱量適量的8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）于試管中，超純水溶解配制成1 mg/mL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液，4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.9.2 樣品處理

試管中加入5 mg的純多糖，N2環(huán)境下加入5 mL的三氟乙酸（2 mol/L），確保N2充滿整個試管后迅速封管。120℃的油浴鍋中降解反應(yīng)3 h，取出冷卻至室溫。50℃蒸干樣品后加入1 mL甲醇繼續(xù)蒸干，操作重復(fù)5次。加入5 mL超純水振蕩溶解樣品，用0.22 μm水系濾膜、小柱過濾后，吸取1 mL準(zhǔn)備上樣。

1.3.9.3 流動相的配制

200 mmol/L NaOH溶液:4.2 mL NaOH溶液定容至400 mL，搖勻，通N2保護備用。

1mol/L醋酸鈉溶液:稱取8.2g醋酸鈉固體，用50mL超純水溶解，減壓抽濾后定容至100 mL，搖勻后通N2保護備用。

800 mL超純水，通N2保護備用。

1.3.9.4 檢測條件

Thermo Dionex ICS2500色譜系統(tǒng)，色譜柱為Carbo Pac PA10（150 mm×3 mm），柱溫設(shè)為 30℃，進樣量1 mL，檢測時間為40 min。

根據(jù)8種單糖的色譜圖出峰時間與純糖進行分析比較，對純多糖的單糖組成進行定性，結(jié)合峰面積、相對分子質(zhì)量等其他數(shù)據(jù)計算出純糖中各單糖的摩爾比。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

利用Design-Expert.V8.0和Origin 8.6等軟件對數(shù)據(jù)進行分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫甘薯多糖提取的單因素試驗

2.1.1 提取溫度對紫甘薯多糖提取率的影響

提取溫度對紫甘薯多糖提取率的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取溫度對多糖提取率的影響Fig.1 Influence of different extraction temperature on extraction yield of polysaccharides

由圖1可知，紫甘薯多糖提取的溫度較低時，隨著提取溫度的升高，多糖提取率隨之增加，說明了溫度升高可促進細(xì)胞內(nèi)多糖分子的運動，以促進多糖溶出[21]，當(dāng)溫度升高到80℃時，多糖提取率最大。但當(dāng)溫度升高到90℃時，糖苷鍵可能會斷裂，發(fā)生多糖降解。通過分析以上結(jié)果，選取提取溫度80℃作為紫甘薯多糖的最佳提取溫度。

2.1.2 提取時間對紫甘薯多糖提取率的影響

提取時間對紫甘薯多糖提取率的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Influence of different extraction time on extraction yield of polysaccharides

由圖2可知，當(dāng)提取時間設(shè)定在1.0 h～2.5 h內(nèi)時，隨著時間的逐漸延長，紫甘薯多糖的提取率也逐漸增加，并在2.5 h時達(dá)到最大，說明了提取時間適當(dāng)?shù)难娱L也可提高多糖的提取效率[22]。但過長的時間，多糖的溶解逐漸達(dá)到平衡后，可能會引起多糖結(jié)構(gòu)的改變從而降低提取率。因此選定2.5 h為紫甘薯多糖的最優(yōu)提取時間。

2.1.3 液料比對紫甘薯多糖提取率的影響

液料比對多糖提取率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同液料比對多糖提取率的影響Fig.3 Influence of different liquid-solid ratio on extraction yield of polysaccharides

由圖 3 可知，在液料比為 15∶1（mL/g）時，多糖得率最大。當(dāng)紫甘薯細(xì)胞內(nèi)多糖浸出率達(dá)到最大值之前，多糖的提取率隨著溶劑用量的增大而變大，但當(dāng)多糖在溶液中幾乎完全浸出后，過多的溶劑使后續(xù)步驟更加繁瑣，引起大量多糖被損耗，從而提取效率下降[23]。因此選取15∶1（mL/g）為紫甘薯多糖提取的最佳液料比。

2.2 紫甘薯多糖提取的響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

通過對單因素的試驗結(jié)果進行分析后，確定了提取溫度：70、80、90 ℃，提取時間：2.0、2.5、3.0 h，提取液料比 10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）作為下一步試驗因子。響應(yīng)值為多糖的提取率，響應(yīng)面試驗使用Design-Expert 8.0.6軟件進行設(shè)計，試驗方案共17組，試驗后通過計算得出多糖提取率，結(jié)果見表2。

2.2.2 擬合模型與顯著性檢驗

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行了建模和分析，得到了提取率（R）的提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）的多元回歸方程：R/%=9.00+0.23A+0.33B+0.34C-0.65AB-0.041AC-0.23BC-1.58A2-1.16B2-1.60C2。

響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)的分析結(jié)果見表3。

由表3可知，P<0.000 1，R2=0.995 6，說明此模型顯著性很高；且失擬項P值0.728 3>0.05，說明明顯的失擬因素不存在，因此該回歸方程可信。F檢驗可評估判斷自變量對因變量產(chǎn)生的影響[24]，可知3個因素影響提取率的程度為C（液料比）>B（提取時間）>A（提取溫度）。

表3 Box-Behnken數(shù)據(jù)分析結(jié)果Table 3 Results of Box-Behnken data analysis

2.2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

3個因素的兩兩交互作用對提取率的影響見圖4～圖6。等高線若為圓形則表明兩因素間的相互作用對提取率的影響很小，若是橢圓形則說明影響很大[25]。

圖4 提取溫度和提取時間兩因素對提取率的交互作用Fig.4 Interaction of extraction temperature and extraction time on extraction yield

圖5 提取溫度和液料比兩因素對提取率的交互作用Fig.5 Interaction of extraction temperature and liquid-solid ratio on extraction yield

圖6 提取時間和液料比兩因素對提取率的交互作用Fig.6 Interaction of extraction time and liquid-solid ratio on extraction yield

由圖4～圖6可知，對提取率影響最大的交互作用是提取溫度和提取時間，而提取溫度和液料比的影響最小。

通過軟件計算后，得到最優(yōu)的條件為溫度80.70℃、時間 2.58h、液料比 15.64∶1（mL/g），預(yù)測提取率為9.06%。在實驗室實際操作后，確定了最優(yōu)的條件為提取時間2.5 h、溫度 80 ℃和液料比 15∶1（mL/g），測得實際的提取率取平均值為9.03%，相對偏差為0.74%，這表明響應(yīng)面法優(yōu)化的提取條件是穩(wěn)定可行的。

2.3 紫甘薯多糖的分離純化

洗脫曲線如圖7所示，兩個峰命名為PSPP-A和PSPP-B。合并收集糖含量最高的PSPP-A，進行后續(xù)的純度鑒定。

圖7 紫甘薯多糖的Sepharose 4B洗脫曲線Fig.7 Sepharose 4B elution curve of purple sweet potato polysaccharide

2.4 PSPP-A的純度及分子量鑒定

多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。分子量不同的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=-4.310 7X+36.120 0。PSPP-A的液相色譜圖如圖9所示。

圖8 多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve of molecular weight of polysaccharide

由圖9可知，PSPP-A的液相色譜圖為單一峰，證明多糖經(jīng)Sepharose 4B凝膠層析柱純化后均一性較好。PSPP-A的出峰時間為8.438 min，經(jīng)過計算，最終得出PSPP-A的分子量為2.63×103kDa。

圖9 PSPP-A的高效液相色譜圖Fig.9 High performance liquid chromatography of PSPP-A

2.5 PSPP-A的紫外光譜分析

PSPP-A的紫外掃描光譜圖見圖10。

圖10 PSPP-A的紫外掃描光譜圖Fig.10 UV scanning spectra of PSPP-A

紫外分光光度計掃描PSPP-A溶液后，260 nm和280 nm處均無明顯的吸收峰，說明多糖基本不含核酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì)[26]。

2.6 PSPP-A的傅里葉紅外光譜分析

利用KBr壓片法對多糖進行傅里葉紅外光譜分析，可以得到PSPP-A的特征官能團和糖環(huán)構(gòu)型等結(jié)構(gòu)信息[27]。PSPP-A的傅里葉變換紅外光譜圖見圖11。

圖11 PSPP-A的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.11 Fourier transform infrared spectrumdiagram of PSPP-A

由圖11可知，3 416.39 cm-1處的寬吸收峰是—OH伸縮振動，2 924.24 cm-1和2 853.98 cm-1處的吸收峰是C—H的伸縮彎曲振動，這都是多糖的特征峰，因此可以驗證PSPP-A是多糖類物質(zhì)[28]。1 739.94 cm-1處有吸收峰是因為存在酯羧基，說明PSPP-A含有糖醛酸；1 617.85 cm-1處的吸收峰是羧酸鹽離子[29]。1 438.34、1 420.30 cm-1處的吸收峰是由于C—H的變角振動[30]。在1 077.59、1 050.61 cm-1處存在C—O—C的彎曲振動，表明存在吡喃糖環(huán)[31]。在830.54 cm-1處的吸收峰表明糖結(jié)構(gòu)為α-糖苷鍵，在920.32 cm-1處的吸收峰歸因于 β-糖苷鍵[32]。

2.7 PSPP-A的單糖組成分析

離子色譜法能使單糖通過金電極表面時發(fā)生氧化反應(yīng)，進而引起電流變化來高效地進行單糖分析[33]，不需要進行衍生操作，且每種單糖都會有顯著的色譜峰，適合不易提取多糖中的糖類成分分析[34]。PSPP-A經(jīng)三氟乙酸水解后進行離子色譜分析，結(jié)果如圖12所示。PSPP-A的單糖組成分析見表4。

表4 PSPP-A的單糖組成分析Table 4 Monosaccharide composition of PSPP-A

圖12 PSPP-A的單糖組成離子色譜圖Fig.12 Ion chromatograms for determination of PSPP-A monosaccharide composition

根據(jù)圖12單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰順序和時間判斷PSPP-A中的單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸。

由表4可知，PSPP-A單糖（鼠李糖:阿拉伯糖:半乳糖:葡萄糖:葡萄糖醛酸）組成的相對摩爾比為1.89∶8.45∶1.95∶1.13∶1.00。

3 結(jié)論

本論文以紫甘薯多糖為研究對象，對其提取率的工藝優(yōu)化和分離純化進行了研究，通過進行單因素和響應(yīng)面試驗，得到當(dāng)提取溫度80℃、提取時間2.5 h和液料比15∶1（mL/g）時，紫甘薯多糖提取率最佳，為9.03%。選用Sepharose 4B凝膠分離純化后得到純多糖PSPP-A。PSPP-A的相對分子量為2.63×103kDa。通過紫外吸收光譜可知，PSPP-A中不含核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)。PSPP-A的FT-IR圖譜存在吡喃糖環(huán)、α-糖苷鍵和β-糖苷鍵。PSPP-A經(jīng)單糖組成分析判定后得出，其是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸5 種單糖組成，相對摩爾比為 1.89∶8.45∶1.95∶1.13∶1。本研究可為紫甘薯的綜合開發(fā)和食品功能因子的應(yīng)用提供參考。