顧秋亞,李姝瑤,楊文華,余曉斌
(江南大學 生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)
沙棘(Hippophae rhumnoides L),屬于薔薇目胡頹子科沙棘屬,是一種具有較多用途的高緯度植物,在醫(yī)藥保健、綠色食品開發(fā)及環(huán)境保護中應用廣泛[1-2]。我國沙棘資源豐富,沙棘葉天然、無毒,而且含有多種對人體有益的活性化合物,其中黃酮類化合物是其最重要的功能活性成分之一[3-4]。沙棘葉中黃酮類化合物大都以糖苷形式存在,經(jīng)研究[5-6],黃酮糖苷的抗氧化等生物活性和生物利用率均低于苷元。利用微生物轉化對沙棘黃酮進行結構修飾,將黃酮糖苷轉化成相應苷元,可提高其生理活性,促進其進一步的開發(fā)和利用。
金花菌是黑茶茯磚茶加工工序中的優(yōu)勢菌,該類菌具有耐熱、抗逆性好的特點[7]。金花菌酶系豐富,現(xiàn)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)多種酶如多聚半乳糖轉移酶、淀粉酶、單寧酶、纖維素酶、果膠酶等[8]。這些酶在制茶過程中作為生化動力推動茶葉生化成分的轉變,并使發(fā)酵茶具備更好的保健功效和飲用價值。將傳統(tǒng)發(fā)酵茶中的有益菌引入沙棘葉進行制茶,不僅能賦予沙棘葉發(fā)酵茶的風味和口感,其次由于微生物的參與可改變沙棘葉化學組成、提升其生理活性。合理利用沙棘葉,將其制成發(fā)酵型沙棘葉茶,具有廣闊的應用前景。
試驗菌株:金花菌Eurotium amstelodami BSX001,由江南大學生物工程學院發(fā)酵健康食品實驗室分離并保藏于中國農業(yè)微生物菌種保藏中心,編號ACCC32729。
沙棘葉采集地點是寧夏固原市原州區(qū)張易鎮(zhèn);甲醇、乙腈(均為色譜純):Tedia公司(美國);水溶性維生素 E (Trolox)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazide,DPPH)、2,2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]二銨鹽:阿拉丁生化科技股份有限公司;槲皮素、異鼠李素、山奈酚標準品、胰脂肪酶(牛胰腺,15 U/mg~35 U/mg):美國sigma-Aldrich公司。
Agilent1260高效液相色譜儀:美國安捷倫科技公司;Synergy H4酶標儀:美國伯騰儀器有限公司;7GI-16M高速冷凍離心機:賽默飛世爾科技(中國)有限公司;SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進醫(yī)療器械廠;6CST-50殺青機、6CRL-65揉捻機:浙江武義萬達干燥設備制造有限公司。
1.3.1 金花菌孢子懸液的制備與計數(shù)
稱取300 g馬鈴薯,洗凈去皮切碎,加入1 000 mL蒸餾水,煮沸約30 min,雙層紗布過濾后,取濾液加入20 g黑毛茶,煮沸5 min,再次雙層紗布過濾,加入20 g葡萄糖與20 g瓊脂,蒸餾水定容至1 000 mL,即為改良PDA培養(yǎng)基。將E.amstelodami BSX001接種在改良PDA平板上,28℃恒溫培養(yǎng),至菌落覆蓋平板較大面積時(7 d~10 d),在超凈工作臺下倒入少量無菌水,用接種環(huán)小心將黃色閉囊殼刮下,再將懸浮液轉入裝有150 mL無菌水的三角瓶內(內含玻璃珠),150 r/min振搖20 min成分散均勻的孢子懸液,平板菌落計數(shù)法測得孢子濃度。
1.3.2 沙棘發(fā)酵茶的制備
預處理:取一定質量的沙棘鮮葉,清水沖洗去除葉片泥沙,晾曬;殺青:將沙棘葉放在殺青機內,翻動,完成殺青;揉捻:用揉捻機輕度搓揉3 min~5 min,溫度維持在30℃;發(fā)花:將Eurotium amstelodami BSX001孢子懸浮液按每千克沙棘葉9×109個孢子的比例接種揉捻后的沙棘葉,含水量控制在45%~50%。32℃持續(xù)發(fā)酵4 d,通風換氣6次,25℃繼續(xù)發(fā)酵2 d~6 d;干燥:將完成發(fā)酵的沙棘葉在60℃下干燥4 h,即得沙棘發(fā)酵茶。
1.3.3 沙棘茶總酚及總黃酮含量的檢測
茶葉中總酚(以沒食子酸計)含量的測定[9]:用每克提取物中所含沒食子酸毫克數(shù)來表示茶葉中所含總酚的量。將樣品稀釋至不同濃度,依次吸取0.5 mL樣品,1.0 mL福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑(稀釋 10倍),1.0 mL 87.56 g/L的碳酸鈉溶液,搖勻后放置60 min,于750 nm下測定吸度。以沒食子酸濃度對吸光度進行回歸,繪制標準曲線,得回歸方程:y=0.026 8x+0.014 1,R2=0.999 0。
茶葉中總黃酮(以蘆丁計)含量的測定[10]:吸取2 mL樣品溶液兩份,分別置于25 mL具塞刻度試管中,加水到10 mL,加入1 mL亞硝酸鈉溶液(50 mg/mL),混勻后室溫反應6 min,加1 mL硝酸鋁溶液(100 mg/mL),另一份不加硝酸鋁溶液作為空白液,混勻后室溫放置6 min,加 4 mL氫氧化鈉溶液(200 mg/mL),加水至刻度,混勻后室溫放置15 min,于510 nm處測定吸光度。以蘆丁對照品使用液濃度對吸光度進行回歸,繪制標準曲線,得回歸方程:y=0.026 8x+0.014 1,R2=0.999 5。
1.3.4 高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法同時測定黃酮苷元的含量
色譜條件:液相色譜柱ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為甲醇-0.2%磷酸(50∶50,體積比),流速 0.8 mL/min,檢測波長 370 nm,柱溫 35℃,進樣量 10 μL。
標準樣品的制備:分別精密稱取槲皮素、山奈酚、異鼠李素標準品于25 mL棕色容量瓶,用無水甲醇溶解并定容,制成0.1 mg/mL對照品儲備液(4℃貯藏)。取標準儲備液進行稀釋,配制系列濃度的混合標準液(4℃貯藏)。
供試樣品的制備:將茶樣粉碎,過80目篩,稱取1.00 g,加10 mL甲醇,超聲輔助提取30 min,稀釋,過0.45 μm 濾膜,待測。
1.3.5 沙棘茶抗氧化活性的測定
DPPH自由基清除能力的測定[11]:分別取50 μL適當稀釋后的樣品與150 μL的DPPH甲醇溶液(75 μmol/L)混合。在室溫黑暗中培養(yǎng)30 min后,在517 nm處測量紫色自由基DPPH溶液的脫色情況。所有測試均做3個復孔,取其平均值,陰性對照以樣品溶劑代替樣品溶液。Trolox是一種維生素E的類似物,具有和維生素E相近的抗氧化能力,將其作為沙棘茶總抗氧化能力的參考。樣品的抗氧化能力用其對DPPH自由基的清除率表示,抗氧化活性越強則清除率越大。DPPH自由基清除率計算公式如下。
DPPH 自由基清除率/%=(1-A1/A0)×100
式中:A0為陰性對照吸光度;A1為樣品組吸光度。
ABTS法測定抗氧化活性[12]:首先,將7 mmol/L ABTS二銨鹽和2.4 mmol/L硫酸鉀等體積混合,在室溫下黑暗放置12 h,產(chǎn)生新鮮的ABTS+自由基。將1 mL ABTS溶液與60 mL甲醇混合,在734 nm吸光度為1.10±0.02。然后,將 50 μL 適當稀釋的樣品與 150 μL的ABTS溶液反應,2 h后在734 nm處測量吸光度。所有測試均做3個復孔,取平均值,陰性對照以樣品溶劑代替樣品溶液。ABTS+自由基清除率計算公式如下。
ABTS+自由基清除率/%=(1-A1/A0)×100
式中:A0為陰性對照吸光度;A1為樣品組吸光度。
1.3.6 沙棘茶降脂活性的測定
參考陳永麗等[13]的方法測定沙棘葉茶樣品的胰脂肪酶活性抑制能力。胰脂肪酶可將脂肪水解成游離脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。通過抑制胰脂肪酶的活性可以減少脂質的吸收。將胰脂肪酶溶于50 mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0),-20℃保存。稱取0.016 1 g月桂酸4-硝基苯酯溶于100 mL 5 mmol/L乙酸鈉溶液(含質量分數(shù)1%的Trition X-100)中,在沸水中加熱以加速溶解,配制得0.5 mmol/L月桂酸4-硝基苯酯底物溶液,冷卻至室溫備用。分別配制不同質量濃度(1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/mL)的沙棘葉茶甲醇超聲提取液??瞻讓φ諡榘l(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后不接菌,其他處理與發(fā)酵組保持一致。
在96孔板中依次加入50 mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)50 μL、不同濃度樣品溶液 50 μL 和胰脂肪酶溶液(100 mg/mL)50 μL;樣品對照組以等體積磷酸緩沖液代替胰脂肪酶溶液;空白組加入磷酸緩沖液50μL、甲醇50 μL和胰脂肪酶溶液50 μL;空白對照組以等體積磷酸緩沖液代替胰脂肪酶溶液;混勻后于37℃下預熱10 min,然后加入0.5 mmol/L月桂酸4-硝基苯酯溶液50 μL,混勻后37℃孵育20 min,在405 nm波長下測定反應液的吸光度。以奧利司他作為陽性對照,每一樣品平行測定3次。按照以下公式計算樣品對胰脂肪酶的抑制率。
胰脂肪酶抑制率/%=[1-(Aa-Ab)/(Ac-Ad)]×100
式中:Aa為樣品組在405 nm處的OD值;Ab為樣品對照組在405 nm處的OD值;Ac為空白組在405 nm處的OD值;Ad為空白對照組在405 nm處的OD值。
采用SPSS Statistics 25進行數(shù)據(jù)分析,采用Duncan法進行差異顯著性分析(P<0.05,差異顯著)。所有結果均表示為至少3次重復的平均值±標準差。采用Origin 2018軟件進行繪圖。
原料是影響茶葉品質的基礎物質條件。茶樹品種、栽培方法和管理技術影響著鮮葉的品質,但在相同的條件下,鮮葉的品質很大程度取決于采摘時機[14]。選用采摘期分別為6月、7月、8月、9月、10月的寧夏沙棘鮮葉為試驗原料,測定不同采摘期鮮葉的含水量及總酚、總黃酮的含量,結果見圖1和圖2。
圖1 不同采摘期沙棘葉的含水量Fig.1 Water content of seabuckthorn leaves in different picking periods
圖2 采摘期對沙棘葉總黃酮和總酚含量的影響Fig.2 The effect of seabuckthorn leaf picking on contents of flavonoids and phenols
由圖1可知,6月至10月沙棘葉的含水量為在54.28%~68.35%,其中6月的沙棘葉鮮嫩,含水量最高,隨著氣溫慢慢提升,葉片的蒸騰作用加強,葉片開始失水,到10月沙棘葉已成熟,部分葉子開始枯萎、脫落,此時含水量最低,僅為54.28%,因此選用7月~9月的沙棘鮮葉制茶較為合適。
酚類化合物除了受品種遺傳因子影響外,環(huán)境對其影響也很大,其中光的影響尤其重要。凡在光照強度和日照量大的環(huán)境下,沙棘葉中兒茶素含量明顯增加,光質方面黃色光有利茶樹生育[15]。
由圖2可知,在6月~9月隨著葉片成熟度的增加,沙棘葉中總酚含量基本呈上升趨勢,含量變化在42.61 mg GAE/g~50.34 mg GAE/g,9 月總酚含量達到最高值50.34 mg GAE/g;沙棘葉總黃酮含量變化在15.35 mg RT/g~23.12 mg RT/g,在 9 月達到最高值。10月總酚和總黃酮含量又有所下降。所以綜合各因素,制備沙棘葉茶應以9月采摘沙棘葉較好。
以9月份采摘沙棘鮮葉為原料,將金花菌E.amstelodami BSX001孢子懸浮液按每kg沙棘葉1×109個孢子的比例接種于揉捻后的沙棘葉,按茯茶“發(fā)花”工藝制得沙棘發(fā)酵茶。沙棘葉發(fā)酵茶的感官品析結果見圖3。
圖3 沙棘葉發(fā)酵茶的感官品析Fig.3 Sensory analysis of fermented tea with seabuckthorn leaves
由圖3可知,沙棘葉經(jīng)“發(fā)花”工藝后,葉底呈暗褐色,葉片附著大量金花菌的金黃色閉囊殼。當茶水比為 1∶50(g/mL),水溫 100℃,浸泡 15 min 時茶湯紅黃明亮,香氣純正,滋味醇和尚濃。
2.2.1 沙棘葉“發(fā)花”階段金花菌數(shù)量的變化
試驗發(fā)現(xiàn),E.amstelodami BSX001在不另外添加營養(yǎng)成分的條件下,可在沙棘葉上快速“發(fā)花”,分別對“發(fā)花”過程中采集的不同時間的沙棘葉中金花菌進行計數(shù),結果見圖4。
圖4 沙棘葉“發(fā)花”階段微生物數(shù)量變化Fig.4 Changes in the number of microorganisms during flowering
沙棘葉“發(fā)花”是在相對開放的環(huán)境中完成,因此在發(fā)酵前期會發(fā)現(xiàn)有少數(shù)的霉菌和酵母菌,然而沙棘葉的低水分活度、營養(yǎng)條件、以及人工對溫濕度的調節(jié)使得金花菌快速繁殖并成為優(yōu)勢菌,發(fā)花的第3天,可見沙棘葉表面附著大量白色菌絲,部分區(qū)域呈淡黃色,隨后幾天金花菌數(shù)量呈幾何級數(shù)增加,由圖4可知,在發(fā)酵第9天金花菌數(shù)量達到最多(3.3×107CFU/g),隨后金花菌以閉囊殼形式存在,數(shù)量保持穩(wěn)定。
2.2.2 沙棘葉“發(fā)花”階段的總酚含量的變化
茶多酚是茶葉中主要的呈味物質,具有一定的苦澀味并帶有強烈的收斂性[16],沙棘葉中酚類化合物的組成與含量與其他茶類不同,但是同樣對制茶最終品質有著重要影響。沙棘葉“發(fā)花”過程中總酚含量的變化見圖5。
圖5 沙棘葉“發(fā)花”過程中總酚含量的變化Fig.5 Variation of total phenols content of seabuckthorn leaves during flowering
多酚類化合物含量在沙棘葉“發(fā)花”階段呈先增加后減少的趨勢,金花菌的果膠酶、單寧酶、糖苷酶等酶可作用于沙棘葉釋放葉壁中鍵合態(tài)的酚類物質,后期酚類物質再經(jīng)酶的作用發(fā)生氧化、降解、聚合等一系列反應[17-18]。由圖5可知,在“發(fā)花”階段,沙棘葉中總酚含量呈先增加后減少的變化趨勢,發(fā)酵第6天時沙棘葉總酚含量最高,可達(58.54±1.32)mg GAE/g,“發(fā)花”后期總酚含量下降明顯。
2.2.3 沙棘葉“發(fā)花”階段的黃酮類化合物的變化
黃酮類化合物是沙棘葉中主要的一類功能性成分,大都呈黃綠色,通常以黃酮苷的形式存在[19-20]。沙棘葉“發(fā)花”過程中總黃酮含量的變化見圖6。
圖6 沙棘葉“發(fā)花”過程中總黃酮含量的變化Fig.6 Variation of total flavonoids content of seabuckthorn leaves during flowering
由圖6可知,在“發(fā)花”階段,沙棘葉中總黃酮含量呈先增加后減少的變化趨勢,發(fā)酵第6天時沙棘葉總黃酮含量最高,可達(36.62±1.01)mg RT/g,“發(fā)花”后期總黃酮含量下降明顯,但仍明顯高于未加工的沙棘葉[(19.37±0.67)mg RT/g]。
金花菌分泌的多種胞外酶有利于鍵合態(tài)黃酮類化合物的釋放,隨后黃酮類化合物在金花菌分泌的胞外酶與熱作用下發(fā)生降解和轉化,部分與兒茶素、花青素結合產(chǎn)生輔色素。沙棘葉“發(fā)花”階段總黃酮及黃酮苷元含量的變化如表1所示。
表1 沙棘葉“發(fā)花”階段總黃酮及黃酮苷元含量的變化Table 1 Changes of total flavonoids and flavonoid glycosides in seabuckthorn leaves during flowering
沙棘葉中黃酮主要的存在形式是由槲皮素、山奈酚、異鼠李素等苷元構成的糖苷型化合物,而苷元型黃酮更利于吸收且功能性更強[5]。E.amstelodami BSX001與其他金花菌相比有較突出的β-葡萄糖苷酶活性,黃酮苷通過β-葡萄糖苷酶的去糖基作用可獲得相應的黃酮苷元等。由表1可知,在E.amstelodami BSX001接入6 d時,沙棘葉中可檢測的黃酮苷元含量達到最高,6 d后各苷元含量有所降低。其中異鼠李素(58.37±0.87)mg/100 g,槲皮素(64.14±0.91)mg/100 g,山奈酚(45.24±1.62)mg/100 g。在未加工沙棘葉中僅檢測到微量[(5.68±0.01)mg/100 g]的槲皮素。
2.3.1 沙棘葉發(fā)酵前后的抗氧化活性
沙棘葉發(fā)酵前后自由基清除能力及IC50見表2。
表2 發(fā)酵前后沙棘葉60%乙醇提取物清除自由基能力Table 2 Free radical scavenging capacity of 60%ethanol extract from seabuckthorn leaves before and after fermentation
從表2可以看出,發(fā)酵前后沙棘葉60%乙醇提取物對DPPH、ABTS+自由基均有一定的清除作用,并在試驗濃度范圍內呈現(xiàn)明顯的量效關系。發(fā)酵前后沙棘葉60%乙醇提取物清除DPPH自由基的IC50分別為12.640 mg/mL和4.690 mg/mL,陽性對照Trolox的IC50為0.028 mg/mL;發(fā)酵前后沙棘葉60%乙醇提取物清除ABTS+自由基的IC50分別2.650 mgmL和2.030 mg/mL,陽性對照Trolox的IC50為0.032 mg/mL。表明沙棘葉經(jīng)E.amstelodami BSX001發(fā)酵后抗氧化能力有所提高。
2.3.2 沙棘葉發(fā)酵前后的體外降脂活性
分別考察了沙棘葉發(fā)酵前后的脂肪酶抑制活性,結果見圖7。
由圖7可知,對試驗數(shù)據(jù)進行擬合得到發(fā)酵后沙棘葉對胰脂肪酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為4.21 mg/mL,低于對照組奧利司他的IC50(0.13 mg/mL)。質量濃度為1.00 mg/mL~10.00 mg/mL時,發(fā)酵后沙棘葉對胰脂肪酶的抑制率從30.15%增加到78.33%,未發(fā)酵沙棘葉樣品抑制率為3.01%~64.92%,且在各個質量濃度下,發(fā)酵樣品的抑制率均高于未發(fā)酵的樣品,表明沙棘葉對胰脂肪酶具有較好的抑制作用,且經(jīng)金花菌發(fā)酵之后抑制效果有明顯提高。
圖7 發(fā)酵前后沙棘葉和奧利司他對胰脂肪酶的抑制率Fig.7 Inhibitory rate of pancreatic lipase by seabuckthorn leaves before and after fermentation and orlistat
鮮葉的老嫩程度是影響沙棘葉的色澤及營養(yǎng)成分的重要因素。因此選擇適當?shù)牟烧谑侵谱魃臣~茶的關鍵環(huán)節(jié)。均衡水分和各營養(yǎng)成分含量,確定9月為鮮葉最佳采摘期。在茯茶的“發(fā)花”工藝基礎上,采用人工植入的方式將E.amstelodami BSX001孢子懸浮液接種于沙棘葉,試制新型的沙棘葉發(fā)酵茶。分離自茯磚茶的金花菌能在沙棘葉上正常生長,其代謝產(chǎn)生的各種酶類在“發(fā)花”過程中發(fā)生作用,除去了沙棘葉原有的青澀味,使茶葉品質得到提升,茶湯色澤紅黃明亮,滋味醇和,菌花香顯著。沙棘葉經(jīng)發(fā)酵后總黃酮含量由原來的(19.37±0.67)mg RT/g提高到(36.62±1.01)mg RT/g,總酚含量由(44.61±0.82)mg GAE/g提高到(58.54±1.32)mg GAE/g。原本含量幾乎檢測不到的黃酮苷元含量明顯提升,槲皮素含量為(64.14±0.91)mg/100 g,山奈酚含量為(45.24±1.62)mg/100 g,異鼠李素含量為(58.37±0.87)mg/100 g,沙棘葉經(jīng)E.amstelodami“發(fā)花”后,抗氧化活性、降脂活性都有明顯提高。